Name: Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 생쥐 시상교차상핵에서 형광 기자를 이용한 생체 내 생체시계 유전자 발현 실시간 모니터링 방법을. 광섬유 시스템과 AAV 주입을 통해 광-암 및 암-암 조건에서 고해상도 측정이 가능합니다.

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우리는 기술 지원을 제공 하기 위한 자극 토론 및 Zhan 연구소에서 회원을 제공 하기 위한 장 연구소에서 회원을 감사 합니다. 이 연구는 NSFC, 중국의 M.O.S.T.에서 973 프로그램의 (E.E.Z. C.Z.)를 2012CB837700의 31500860 (C.Z.)를 부여 하 고 베이징 시 정부에서 자금에 의해 지원 되었다. E.E.Z.는 "채용 프로그램 글로벌 청소년 전문가" 중국 사람에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜의 모든 절차는 중국의 정부 규정에 따라 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 국립 연구소의 생물학, 베이징의 승인을 실시 했다.
1. 건설 Cry1 형광 기자
참고: 이전 circadian 연구 생물 발광 시스템2,12를 사용 하 여,13 퓨즈 리듬 dLuc 식 유도를 정한 luciferase (dLuc)와 circadian 발기인. 개발 하기 위해 형광 기자, 정한 luciferase 리듬 dVenus 식 유도를 정한 형광 단백질 (dVenus)로 대체 되었다. P (Cry1)의 생성-d금성 기자 아래 설명의 구조는 현재 Addgene에 제출 되 고 학문적 인 사용을 위해 곧 유효할 것 이다.
<ol><li>증폭 기능 마우스 Cry1 발기인 (-1208 bp 지역 전사 시작 사이트 '-1'로 지정, Cry1 유전자의 +328). PCR 효소 (로그인 플러스 네오)를 사용 하 여, 뇌관 f 1와 r 1은 ( 표 2참조), 서식 파일 및 제조업체의 PCR 프로토콜 Cry1 발기인 DNA 파편을 증폭으로 게놈을 마우스.</li>
	<li>Intron 336 Cry114의 circadian 시계 기능을 위해 중요 하다, Cry1 유전자의 증폭. 사용 하 여 PCR 효소 뇌관 f 2와 r 2, 서식 파일 및 제조업체의 intron 336 DNA 파편을 증폭 하기 위하여 PCR 프로토콜 마우스 게놈.</li>
	<li>금성을 증폭. 뇌관 f 3와 R3, 템플릿과 제조업체의 금성 DNA 파편을 증폭 하기 위하여 PCR 프로토콜으로 pVENUS N1 플라스 미드 PCR 효소를 사용 합니다.</li>
	<li>NLS-D2 DNA 파편을 증폭. 뇌관 f 4와 R4, 서식 파일 및 NLS D2 DNA 파편을 증폭 하는 제조 업체의 PCR 프로토콜 pcDNA3.3 d2eGFP 플라스 미드 PCR 효소를 사용 합니다.</li>
	<li>Exon 1로 DNA 조각 1을 음성 합성.</li>
	<li>Intron 336와 금성 DNA 파편 사이 링커로 DNA 조각 2를 음성 합성.</li>
	<li>잘라 두 번 pAAV-EF1a floxed-hChR2 (H134R)-mCherry-WPRE-MluI 및 EcoRI 효소 HGHpA 벡터 플라스 미드. 젤 추출 키트를 사용 하 여 더 큰 DNA 파편을 정화. 제조 업체의 프로토콜을 사용 합니다.</li>
	<li>Using 깁슨 어셈블리 혼합 및 그것의 표준 프로토콜, 모두 함께-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA pAAV-P (Cry1) 기자를 생산 하는 DNA 파편의 조립. 제조 업체의 프로토콜을 사용 합니다.</li>
</ol>2. 생산 Adeno 관련 바이러스15
<ol><li>준비 다음 플라스 미드 DNA 주식: 31.25 µ g의 pRV1, pH21의 31.25 µ g, pFdelta6의 125 µ g 및 62.5 µ g (Cry1)-intron336-pAAV-P의 금성-NLS-d 2-WPRE-HGHpA.</li>
	<li>293T 세포의 5 15 cm 요리를 준비 하 고는 세포가 90% 합칠 때까지 기다립니다.</li>
	<li>Transfection 시 프로토콜을 따르고 297T 셀에는 플라스 미드를 transfect. 각 요리에 대 한 사용 하 여 pRV1의 6.25 µ g, pH21, pFdelta6의 25 µ g, pAAV-P (Cry1)의 12.5 µ g의 6.25 µ g-transfection 시 약의 intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA, 그리고 120 µ L.</li>
	<li>transfection, 후 72 h 피 펫 총;를 사용 하 여 각 접시에서 셀 분리 2 50 mL 튜브에 세포를 수확.</li>
	<li>10 분 동안 800 x g에서 셀 작은 고는 상쾌한 삭제. 각 관;에 20 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 배치 하 여 세포를 씻어 10 분, 800 x g에서 셀 펠 렛 하 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>150 mM NaCl에 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0; 펠 릿 resuspend 솔루션/튜브의 25 mL를 사용 합니다. 각 튜브를 갓된 10% 나트륨 deoxycholate (dH2O)에서 1.25 mL를 추가 합니다. Benzonase nuclease mL 당 50 단위의 최종 농도에 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>15 분 동안 3000 x g에서 centrifuging 세포질 파편을 제거 합니다. 0.45 μ m 주사기 필터;를 통해 혼합물을 추진 하 여 모든 파편 제거 되었습니다 확인 이 단계는 덤플링 열 차단 방지 하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>연동 펌프;를 사용 하 여 헤 파 린 열 설정 1 mL/min, 아무 공기 방울 열에 소개 된다 보장에 흐름 속도 설정 합니다.</li>
	<li>150 mM NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 10 mL와 함께 열 equilibrate 각 열에 바이러스를 포함 하는 솔루션을 추가 합니다. 100 mM NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 20 mL의 열을 씻어. 그런 다음 5 mL 주사기를 사용 하 여 300 mM NaCl의 1 mL와 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0 200 m m NaCl의 1 mL와 20 mM Tris 솔루션 pH 8.0, 열 세척.</li>
	<li>Elute 400 m m NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 3 mL와 함께 바이러스 4 mL 450 m m NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 뒤에 5 mL 주사기를 사용 하 여 마지막으로 500 m m NaCl의 3 mL로 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0. 추출 된 자료를 수집 합니다.</li>
	<li>재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) 농도 대 한 100000 분자량 컷오프와 원심 필터 단위를 추출 된 자료를 한 번에 4 mL를 로드 합니다. 실내 온도에, 흐름을 통해 삭제 5 분 x g 2000에서 각각 4 mL 샘플 원심</li>
	<li>모든 추출된 물질을 원심 필터 단위를 통해 실행 하는 경우 PBS의 4 mL를 추가 하 고 약 250 μ로 혼합물을 원심. RAAVs 제거 (바이러스 titer에 관하여 이어야 한다 2-8x mL 당 1012 바이러스 성 입자) 원심 필터 단위, 약 수와 사용까지-80 ° C에서 저장소에서. 이 단계에서 바이러스는 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3. rAAV 주입 및 성인 마우스 SCN에 광학 섬유 삽입
<ol><li>Circadian 형광 기자 들고 rAAVs는 SCN에 주입<ol>
<li>RAAV의 5 µ L 로드 (바이러스 titer에 대 한은 mL 당 1012 바이러스 입자 x 2-8) 마이크로 주사기로.</li>
		<li>Nembutal (80 mg/kg)을 복 주입을 통해 성인 마우스 (2에 5-달-오래 된, C57BL/6 배경)를 anesthetize. 발가락-핀치 응답의 부족에 의해 마 취의 충분 한 깊이를 확인 합니다.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 마우스의 머리에서 모피를 제거 한 다음 stereotaxic 장치에 마우스를 탑재. 순환 온수 담요 또는 다른 난방 장치를 통해 마 취 동물에 열 소스를 제공 합니다. 참고: 또는, 모피를 제거 하려면 depilatory 크림 또는 전기 머리 깍을 사용 합니다.</li>
		<li>적절 한 소독 작용 외과 사이트를 청소. 예를 들어 포함 살 균 물 또는 알코올 및 요오드 화물, betadine, 또는 스크럽을 번갈아에 액체를 희석 수이. 3 번 이상 반복 합니다. 수술 사이트 드러 워 진.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 두 피에 절 개 하 고 두개골을 노출 시킵니다.</li>
		<li>있도록 bregma 및 람다; 동일한 가로 평면에서 stereotaxic 장치 조정 동일한 가로 평면에서 bregma의 두 개의 대칭 포인트를 확인 합니다.</li>
		<li>멸 균 면봉을 사용 하 여 H2O2/H2O 뇌과 부식에 4%에 배어. 다음 깨끗 한 멸 균 면봉을 사용 하 여 명확 하 고 두개골의 표면 건조.</li>
		<li>마이크로 드릴을 사용 하 여, 게 구멍 약 1 m m 0.46 m m 후부와 0.25 m m 직경에서 측면 bregma.</li>
		<li>
fi 생리 염 분 해결책으로 깨끗 한 멸 균 면봉을 사용 하 여 두뇌의 노출 된 표면에서 뼈 파편을 취소.</li>
		<li>마이크로 주사기의 팁 후부 0.46 m m 되도록 두뇌 및 두개골의 표면에서 bregma, 및 깊은 5.7 m m 0.25 m m 옆에 마이크로 주사기를 삽입 합니다.</li>
		<li>500 주사 rAAV의 완전 한 보급을 보장 하기 위해 주사 후 10 분에 대 한 장소에서 마이크로 주사기를 떠나 SCN에 rAAV (50 nL 분-1)의 nL.</li>
		<li>천천히 마이크로 주사기를 철회 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SCN 지역에 광섬유를 삽입 합니다.<ol>
<li>광섬유 나이프를 사용 하 여, 섬유 17 m m 길이, 눈 섬유의 양쪽이 부드러운 컷.</li>
		<li>광학 섬유 세라믹 깃 봉으로 삽입 하 고 광학 섬유와 세라믹 아무의 표면 플러시 되는지 확인 메 틸 에틸 케 톤 과산화물 (AB 접착제)와 세라믹 아무에 광케이블을 수정.</li>
		<li>차가운 sterilant 솔루션 또는 에틸렌 산화물과 섬유를 청소.</li>
		<li>RAAV 주입 (3.1.11 단계), 후는 SCN에 세라믹 깃 봉 포함 된 광학 섬유를 삽입 합니다.</li>
		<li>세라믹 아무와 광섬유 치과 수 지를 사용 하 여 두개골에 해결 하 고 건조를 허용.</li>
		<li>다시 매니큐어와 치과 수 지의 표면 얼룩. 3.2.5 하 3.1.2, 제어를 위한 rAAV의 실제 주입 생략에 설명 된 절차를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수술 후 관리<ol>
<li>Buprenorphine 2 mg/kg 몸 무게, 같은 수술 후 진통제, 피하, 마우스 제공 하루에 두 번.</li>
		<li>그들은 마 취에서와 서 하는 동안 복구에 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>음식/물 사용 가능한 광고 libitum와 12 h 명암 조건 (빛의 강도 감 금 소의 바닥에서 ~ 100 럭 스)에서 개별적으로 집 쥐. 8 일 더 충분 한 회복 시간을 허용 하 고 최적의 형광 기자 식 되도록 실험 하기 전에 할당 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. vivo에서 형광 신호 모니터링 및 데이터 수집
<ol><li>수술 후 8 일 형광 신호 모니터와 마우스 머리에 섬유를 연결 (예., 유전자 관찰자). 배경 신호를 설정 하려면 컨트롤 마우스의 SCN에 형광 신호를 확인 하십시오. 관찰 및 형광 신호 모니터를 사용 하 여이 신호 측정을 수행 합니다.</li>
	<li>컨트롤 마우스의 동일한 작업과 실험 마우스의 형광 신호를 평가 합니다. 이 가능성이 광 섬유의 끝은 SCN을 놓친 있다 나타냅니다 마우스는 바이러스 성 벡터 받았지만 분석, 배경 신호 표시를 제외 합니다. 이러한 초기 조치 후 자신의 집 새 형광 신호를 안정 시킬 수 있도록 또 다른 3 주 동안에 쥐를 반환 합니다.</li>
	<li>3 주 후 형광 신호 모니터와 마우스를 연결 합니다. 15 형광 측정 s 100 Hz의 주파수에서 매 10 분. 이러한 측정 동안 쥐 음식/물 사용 가능한 광고 libitum와 그들의 감 금 소에 자유롭게 움직이는 있습니다. ~ 100 럭 스의 감 금 소의 바닥에는 빛의 강도 사용 하 여 그리고 15-20 µW 사이 광 섬유의 끝에 레이저 전원.</li>
	<li>모든 녹음 완료 후 4 %paraformaldehyde 마우스를 perfuse 및 제거 하 고 슬라이스는 광케이블의 위치를 확인 하는 머리. 광섬유 팁은 SCN에 제대로 이식 되지 경우에 분석에서 마우스를 제외 합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석 및 프레 젠 테이 션
<ol><li>측정 형광 신호 15 매 10 분 1500 데이터 포인트를 100 Hz의 주파수에서 s. 이 1500 점의 평균 주어진된 시간에서 형광 신호를 변환합니다. 시간이 지남에 따라 여러 평균 플로팅 transcriptional의 리듬에 맞춰 Cry1 자유롭게 마우스를 이동는 SCN에 제어 조명 조건 하에서 해당 신호-시간 곡선을 생성 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suprachiasmatic+nucleus%3A+cell+autonomy+and+network+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).</li>
<li>Zhang, E. E., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clocks+not+winding+down%3A+unravelling+circadian+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Clocks not winding down: unravelling circadian networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).</li>
<li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).</li>
<li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li>
<li>Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+jet+lag+in+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus+and+peripheral+circadian+timing+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system.</a> European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).</li>
<li>Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+preparation%2C+organotypic+tissue+culturing+and+luciferase+recording+of+clock+gene+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li>
<li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/35055628">Gene expression: View of a mouse clock gene ticking.</a> Nature. 409, 684-684 (2001).</li>
<li>Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+ultradian+rhythms+of+clock+gene+expression+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice.</a> Science Reports. 5, 12310(2015).</li>
<li>Ono, D., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+PER2%3A%3ALUC+rhythms+in+the+olfactory+bulb+of+freely+moving+mice+depend+on+the+suprachiasmatic+nucleus+but+not+on+behaviour+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms.</a> European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).</li>
<li>Ono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+Per1+and+Bmal1+circadian+rhythms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+in+parallel+with+behavioral+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).</li>
<li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+circadian+timing+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li>
<li>Liu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+function+of+REV-ERBalpha+and+beta+and+non-essential+role+for+Bmal1+cycling+in+transcriptional+regulation+of+intracellular+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms.</a> PLoS Genetics. 4, e1000023(2008).</li>
<li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).</li>
<li>Ukai-Tadenuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+feedback+repression+by+cryptochrome+1+is+required+for+circadian+clock+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function.</a> Cell. 144, 268-281 (2011).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. 57, e3348(2011).</li>
<li>Yamaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+genetically+deficient+in+vasopressin+V1a+and+V1b+receptors+are+resistant+to+jet+lag%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag.</a> Science. 342, 85-90 (2013).</li>
<li>Nagano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abrupt+shift+in+the+day%2Fnight+cycle+causes+desynchrony+in+the+mammalian+circadian+center%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center.</a> Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).</li>
<li>Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Circadian+Entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li>
<li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

Ex vivo 방법, 동물 살해는 요구, 슬라이스 문화4,5, RT-PCR16, 제자리 교 잡17, 등 달리는 vivo에서 메서드를 기록 수 있습니다. 살아있는 동물에 circadian 유전자 발현 연구 조사. 따라서,이 기술은 신경 circadian 시계에 다른 물리적 섭 (예를 들어, 수 면 부족, 스트레스, 음식 섭취, 등)의 효과 평가 하는 능력을 제공 한다. Vivo에서 생물 발광7,8,만 지속적인 어두운 조건에서 일할 수 있는10 방법 달리는 형광 vivo에서</...

포유류에서 suprachiasmatic 핵 (SCN) 외 인 환경 변화 (예를 들면, 빛, 온도, 스트레스, 등)1개인의 응답을 조정 전체 신체의 circadian 리듬을 제어 합니다. 코어 클록 구성 요소 Per1-3, Cry1 2, Clock, Bmal1의 구성 하 고 각 셀의 circadian clock을 조절에 중추적인 역할. 각 셀은 SCN에 transcriptional 활성 제, 시계/BMAL1, 당의 표현을 유도에 heterodimer 역할 포함 및 외침. 당 / 울 복잡 한 다음 시계/BMAL1 완료2,3약 24 h는 녹음 방송 번역 피드백 루프를 형성 하기의 기능을 억제.
이전 연구는 SCN에 비보 전 SCN 슬라이스 문화 방법4,,56 주로 고용 하 고, 한계가 우리의 능력을 저해는 동안이 접근은 귀중 한 정보를 제공 하 고, SCN에 다른 뇌 핵의 영향 뿐만 아니라이 중요 한 영역에 있는 셀에 외 인 자극 (예를 들면, 빛)의 효과 대 한 데이터를 가져옵니다. 2001 년에, 히토시 오카무라의 그룹 자유롭게 이동 마우스7에서 SCN에 vivo에서 모니터 circadian 시계 유전자 발현을 생물 발광 시스템을 사용 하는 첫번째 이었다. 켄 이치 혼 마의 그룹은 지난 몇 년 동안에는 생물 발광에서 vivo에서 SCN8,,910녹화 시스템 개발 지출 했습니다. 함께, 이러한 연구는 지속적인 암흑 또는 빛 펄스 후 circadian 시계를 모니터링 하는 기능 연구를 제공 합니다. 그러나, 때문에 생물 발광 너무 희미 한 명암 주기 동안 지속적인 모니터링 사실 빛 circadian 시계11, SCN 중재 진입에 필요한 주된 신호 함께 있도록입니다. 생물 발광 녹화와 관련 된 한계를 극복 하는 실험 방법의 개발에 대 한 수요 증가. 현재 보고서는 circadian 시계는 SCN에서 vivo에서 자유롭게 이동 하는 쥐에서의 모니터링을 건립 되었다 형광 기반 시스템을 설명 합니다. 이 사용 하기 쉬운 메서드 명암 주기 동안 지속적인 모니터링을 허용 하 고 실시간 및 높은 시간 해상도에서 SCN에 circadian 시계 유전자의 녹음 방송의 장기 관찰에 대 한 허용.

<table><tbody><tr><td>KOD Plus Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td>시약</td></tr><tr><td>pVENUS-N1</td><td>addgene</td><td>#61854</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pcDNA3.3_d2eGFP</td><td>addgene</td><td>#26821</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA</td><td>addgene</td><td>#20297</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>MluI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0564</td><td>시약</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>시약</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E2611s</td><td>시약</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>12566014</td><td>시약</td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>0.45&nbsp; &마이크로; 엠&nbsp;</td></tr><tr><td>HiTrap 헤파린 컬럼</td><td>gelifesciences</td><td>17-0406-01</td><td>1 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Amicon ultra-4 원심 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>&nbsp; UFC810024</td><td>100,000 MWCO</td></tr><tr><td>벤조나제 뉴클레아제 시</td><td>그마-알드리치</td><td>E1014</td><td>시약</td></tr><tr><td>소듐 데옥시콜레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>D5670</td> 각 배치 마우스 입체택시 장치에 <td>대한 새로운 솔루션 만들기</td></tr><tr><td></td><td>B& E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>장비</td></tr><tr><td>펜토바르비탈</td><td>SigmaAldrich</td><td>#1507002</td><td>시약</td></tr><tr><td>마우스 입체 장치</td><td>B& E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>장비</td></tr><tr><td>과산화수소 용액</td><td>SigmaAldrich</td><td>#216763</td><td>시약</td></tr><tr><td>광섬유</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>FT200EMT 0.39 NA, &Oslash; 200 &마이크로; m</td></tr><tr><td>마이크로 주사기 펌프</td><td>나노리터 2000 인젝터, WPI</td><td></td><td>장비</td></tr><tr><td>세라믹 페룰</td><td>상하이 Fiblaser</td><td></td><td>230&thinsp; &뮤; m 내경, 2.5mm 외경</td></tr><tr><td>Gene Observer</td><td>BiolinkOptics</td><td></td><td>장비</td></tr></tbody></table>

vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 suprachiasmatic 핵에서 circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

이 기술을 기반으로 하는 재조합 형 adeno 관련 바이러스 유전자 기자 들의 정확한 납품 광섬유 중재 형광 녹음을 결합합니다. 이 새로운 및 사용 하기 쉬운 vivo에서 형광 모니터링 시스템 개발 되었다 자유롭게 마우스를 이동의 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 시계 유전자, Cry1의 transcriptional 리듬을 기록 하. 이렇게 하려면, Cry1 전사 형광 기자 설계와 Adeno 관련 바이러스로 포장. 정제, 집중 바이러스 SCN 광케이블은 두뇌의 표면에 고정 후 삽입 하 여 다음 마우스에 주입 했다. 동물 자신의 집 새를 반환 하 고 충분 한 기자 식 되도록 1 개월 수술 회복 기간을 허용 했다. 형광 다음 자유롭게는 vivo에서 우리의 기관에서 만들어진 시스템 모니터링을 통해 마우스를 이동에 기록 되었다. 대 한 vivo에서 녹화 시스템, 488 nm 레이저는 동등한 힘의 4 개의 레이저 구동 출력으로 빛을 분할 한 1 × 4 빔-스플리터와 결합 했다. 이 설치 프로그램 4 동물에서 동시에 레코드를 사용할 수 있습니다. 각 내보낸된 형광 신호 광 전 증폭 관 관 및 데이터 수집 카드 통해 수집 되었다. 반면 이전 생물 발광 vivo에서 circadian 시계 기록 기술,이 형광에서 vivo에서 녹화 시스템 허용 빛 주기 circadian 시계 유전자 발현의 기록.

Cry1 의 형광 기자 디자인 그림 1A에 게재 했다. 500 이상 상세한 접근을 사용 하 여 (Cry1)-intron336-rAAV-P의 nL 금성-NLS-d 2는 성인 마우스의 SCN에 성공적으로 주입 했다 그리고 강력한 금성 식 (그림 1B, 1c) 전시. 12 h/12 h 명암 (LD)와 어둠/어두운 (DD) 조건 (그림 2)에서 기록 하는 형광 신호 두 조건에서 강력한 circadian 리듬 나왔고. 마지막으로, 형광 신호는 길고 짧은 photoperiod 조건 (그림 3)에 기록 되었다.
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이 새로 개발된 된 형광 기반 기술을 통해 자유롭게 이동 하는 쥐 실시간 및 높은 시간 해상도 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 circadian 시계 유전자의 녹음 방송을의 장기 모니터링 됩니다.

Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

이 방법은 자유롭게 움직이는 마우스에서 높은 시간 해상도로 실시간으로 일주기 시계 유전자 발현을 모니터링하는 방법을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 일주기 시계 연구에 매우 중요한 명암 및 어둡고 어두운 조건에서 작동한다는 것입니다. 광섬유 나이프를 사용하여 17mm 길이의 섬유를 자릅니다.광섬유의 각 면이 매끄러운지 확인하십시오. 광섬유를 세라믹 페룰에 삽입하고 메틸 에틸 케톤 과산화물이 있는 세라믹 페룰에 광섬유를 고정합니다. 광섬유 및 세라믹 깃봉의 표면이 평평하다는 것을 보증.75% 에탄을 적신 면봉으로 광섬유를 청소합니다. 그리고 삽입할 준비가 될 때까지 깨끗하게 유지하십시오. 먼저 5마이크로리터의 재조합 AAV를 마이크로주사기에 주입하여 주입 절차를 시작합니다.그런 다음 기관에서 승인한 프로토콜을 사용하여 성인 쥐를 마취한 후 발가락 꼬집음 반응이 없는지 충분한 마취 깊이를 확인합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 마우스 머리의 털을 제거합니다. 그런 다음 마우스의 머리를 입체 장치에 장착합니다.두피를 절개한 후 두개골을 노출시킵니다. 그리고 브레그마와 람다가 동일한 수평면에 있도록 입체 장치를 조정합니다. 그런 다음 4% 과산화수소와 물에 적신 면봉을 사용하여 뇌 골막을 부식시킵니다.그런 다음 깨끗한 면봉으로 두개골 표면을 청소하고 건조시킵니다. 정위 팔을 사용하여 브레그마 뒤쪽 0.46mm, 측면 0.25mm의 수술 부위를 식별합니다. 그런 다음 마이크로 드릴을 사용하여이 시점에서 직경 약 1mm의 구멍을 만듭니다.생리식염수가 묻은 투명한 면봉을 사용하여 노출된 뇌 표면에서 뼈 조각을 제거합니다. 그런 다음 두개골 표면에서 5.7mm 깊이까지 뇌에 마이크로 주사기를 삽입합니다. 그리고 분당 50 나노리터의 속도로 500 나노리터의 재조합 AAV를 SCN에 주입합니다.재조합 AAV의 완전한 확산을 보장하기 위해 주입 후 10분 동안 마이크로 주사기를 제자리에 두십시오. 10분 후 마이크로 주사기를 천천히 빼냅니다. 재조합 AAV 주입 직후 광섬유가 포함된 세라믹 페룰을 SCN에 삽입합니다.그런 다음 치과 용 레진을 사용하여 세라믹 페룰과 광섬유를 두개골에 고정하고 건조시킵니다. 건조 후 치아 수지 표면에 검은 매니큐어를 바르십시오. 마우스를 따뜻한 회복 케이지에 넣고 마취에서 나올 때 모니터링합니다.동물이 흉골 누운 자세를 회복하면 단독 수용 후 12시간 명암 주기로 수용실로 돌아갈 수 있습니다.

in-vivo-monitoring-circadian-clock-gene-expression-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

성인 마우스 hypothalamic suprachiasmatic 핵 (SCN), 그리고 문화에 빠른 방법 organotypic 문화 상태에있는 SCN의 조직을 포함 준비 슬라이스의 절차가보고됩니다. 또한, 동적 루시페라제 리포터 기술을 사용하여 oscillatory 시계 유전자 단백질 표현의 측정이 설명되어 있습니다.

슬라이스 준비, Organotypic 조직 Culturing과 Suprachiasmatic 핵의 시계 유전자 활동의 루시페라제 녹음

Circadian 시계는 개별 세포 내 기능, 즉, 그들은 세포 자율적 있습니다. 여기, 우리는 비 침습적, 루시 페라 기반의 실시간 bioluminescence 기술을 사용하여 셀 자치 클럭 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 리포터 전지는 circadian 생물학을 공부를위한 다루기 쉬운, 기능 모델 시스템을 제공합니다.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

주기성 시계는 애기 사체의 제에 대한 규제 만 계시로 피드백 유전자의 비율은 알 수없는 남아 있습니다. 여기에서 우리는 신속하게 일시적으로 원형질체에 표시되는 주기성 기자의 발광 이미지를 사용하여 애기 장대의 돌연변이 라인에서 일주기 표현형을 평가하는 방법을 시각화.

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

여기에서는 생체 일주기 발광과 인간 섬 세포 및 일차 근관의 분비 활동을 병렬로 모니터링하기 위한 설정에 대해 설명합니다. 이를 위해 루시페라제 코어 클럭 리포터의 렌티바이러스 유전자 전달을 사용한 후, 연속적인 세포 주혈에 의한 유출 매질의 체외 동기화 및 수집을 수행했습니다.

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

생체 외에서 생물 발광 분석 결과 유 방 상피 세포에서 세포 circadian 리듬을 결정 하기 위해 제공 됩니다. 이 메서드는 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 정한 luciferase 표현 하는 포유류 세포 기자 플라스 미드를 활용 합니다. 그것은 다른 세포 유형 circadian 리듬에 기관 특정 효과 평가 하 게 적응 될 수 있다.

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

유전자 인코딩된 luciferase 유전자 발현의 인기 있는 비-침략 적 기자입니다. 자동된 경도 luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징의 사용에는 다양 한 조건에서 발광 세포에서 경도 녹음 수 있습니다. 여기 우리가 어떻게 악어 circadian 리듬 연구의 맥락에서 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

신경 줄기/전구 세포는 세포 이벤트의 다른 결과로 이끌어 내는 노치 신호 분대의 각종 표현 역학을 전시합니다. 이러한 동적 발현은 유전자 발현의 급격한 변화를 시각화할 수 있는 매우 민감한 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 정적 분석이 아닌 실시간 모니터링을 통해 밝혀질 수 있습니다.

뮤린 신경 발생 시 노치 신호 역학의 실시간 생물 발광 이미징

대부분의 유기체에 존재하는 일주기 리듬은 생물학적 과정의 시간적 조직을 조절합니다. 3D 오가노이드는 최근 생리학적으로 유의미한 in vitro 모델로 부상했습니다. 이 프로토콜은 생물 발광 리포터를 사용하여 오가노이드의 일주기 리듬을 관찰하는 방법을 설명하며, 이를 통해 다세포 시스템의 일주기 리듬에 대한 체외 조사를 가능하게 합니다.

Organoids에서 Bioluminescence Reporter를 사용한 Circadian Oscillations 모니터링

이 연구는 신뢰할 수 있는 주간 생체 위상 이동을 가능하게 하는 화학유전학 및 보라색 빛 기반 전략을 도입합니다.

화학유전학적 및 스펙트럼적 접근법을 이용한 주간 생체 위상 변화 유도

배우세요 생쥐 시상교차상핵에서 형광 기자를 이용한 생체 내 생체시계 유전자 발현 실시간 모니터링 방법을. 광섬유 시스템과 AAV 주입을 통해 광-암 및 암-암 조건에서 고해상도 측정이 가능합니다.

Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

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