환자에서 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립

외과적으로 절제된 종양 조직에서 파생된 이 인간 전임상 모델의 전반적인 목표는 환자 유래 연조직 육종의 1차 배양을 확립하는 것입니다. 이 방법은 연조직 육종의 병태생리학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 중요한 전임상 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 완전한 인간 전임상 모델이라는 것입니다.

이 기술의 의미는 연조직 육종 치료로 확장되는데, 그 이유는 이 전임상 모델을 기존의 혁신적인 약물로 테스트하여 활성과 작용 메커니즘을 조사할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 연조직 육종에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 암세포 연조직 세포 상호 작용 연구에도 적용할 수 있습니다. 이 방법을 처음 접하는 개인은 종양 조직의 이질성과 종양 세포를 분리하는 데 어려움을 겪을 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 초기 연조직 육종 세포 선택 및 CD 단계에서 숙련도를 달성하기 전에 많은 경험이 필요하기 때문에 매우 중요합니다. 종양 표본은 파라핀 필름으로 밀봉된 50ml의 DMEM 저혈당 배지가 있는 100ml 멸균 소변 용기에 넣어야 합니다. 샘플은 종양 절제 후 최대 3시간 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다.

조직 배양 후드를 70% 에탄올로 살균하고 강철 INOX 핀셋을 70% 에탄올로 살균합니다. 소변 용기에서 파라핀 필름을 제거하고 버립니다. 소변 용기 외부를 70% 에탄올로 청소합니다.

사각형 페트리 접시를 연 다음 소변 용기를 열고 멸균된 강철 INOX 핀셋을 사용하여 종양 표본을 접시에 옮깁니다. PBS를 추가하고 종양 표본을 두 번 세척합니다. 세척 후 종양 표본을 1-2mm 크기의 조각으로 잘게 썰어줍니다.

전체 샘플의 1/4을 2mm 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 TRIzol 시약 1ml를 튜브에 넣고 즉시 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 미세하게 파쇄된 나머지 종양 물질을 15ml 튜브에 모으고 4ml의 콜라겐분해효소 유형 1 용액을 추가합니다.

그런 다음 콜라겐 분해 효소 유형 1 용액을 4 밀리리터의 배양 배지로 희석하고 튜브를 닫은 다음 파라핀 필름으로 밀봉합니다. 섭씨 37도에서 롤링 셰이커에서 15분 동안 배양하여 소화를 활성화합니다. 15분 후 롤링 셰이커가 있는 튜브를 실온에 놓고 밤새 그대로 둡니다.

다음 날, 100미크론 멸균 필터를 통해 세포 현탁액을 50ml 튜브에 부드럽게 여과합니다. 그런 다음 필터를 배양 배지로 세척하고 실온에서 5분 동안 225배 g의 여과액을 원심분리합니다. 튜브를 뒤집어 상층액을 버리고 1-2ml의 배양 배지로 세포를 재현탁합니다.

세포 수를 수행하고 세포 수를 계산한 후 표준 단층 배양에서 평방 센티미터당 80, 000 세포의 밀도로 세포를 플레이트화합니다. cytological 견본을 준비하기 위하여는, 100 의 배양 매체의 200 마이크로리터에 있는 000의 세포를 모으는 것에서 시작한다. 필터가 장착되고 유리 슬라이드가 장착된 일회용 깔때기에 용액을 피펫팅합니다.

세포원심분리기를 열고 샘플을 삽입합니다. 세포 원심분리 후 필터가 장착된 깔때기를 폐기합니다. 그런 다음 슬라이드를 아세톤으로 10분 동안 고정한 다음 클로로포름을 5분 동안 고정합니다.

합류점이 약 90%일 때 STS 세포를 통과시킵니다.PBS로 세포 시트를 세척한 후 PBS에 1X 트립신 2-3ml를 첨가하고 섭씨 37도에서 3-5분 동안 배양합니다. 배양 후 200-1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 분리 된 세포를 수집하고 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 효소 반응을 멈추기 위해 배지 4ml를 첨가합니다.

그런 다음 실온에서 5분 동안 225회 g으로 원심분리합니다. 상등액을 버린 후, 1ml의 배지를 첨가하여 세포 펠릿을 재현탁시키고 세포를 새로운 배양 플레이트 또는 플라스크에 시딩합니다. 종양 세포는 54세 환자로부터 외과적으로 제거된 지방육종에서 분리되었습니다.

환자 조직 표본에서 MDM2 증폭을 검출하기 위해 형광 현장 혼성화를 수행했습니다. 분리된 종양 세포에서 MDM2 증폭에 대한 세포학적 분석을 통해 환자 유래 1차 배양이 확립되었음을 확인할 수 있습니다. 배양물을 이포스파미드(Ifosfamide), 에피루비신(Epirubicin), 이포스파미드(Ifosfamide) 및 에피루비신(Epirubicin), 트라벡테딘(Trabectedin) 및 에리불린(Eribulin)으로 처리했을 때 염기로부터의 형태학적 변화가 유도되었습니다.

각 생존 가능성 실험에 대해 3개의 독립적인 반복실험을 수행했습니다. 그 결과 화학요법에 대한 배양물의 민감성이 확인되었습니다. 가장 적극적인 치료법은 이포스파마이드(Ifosfamide)와 에피루비신(Epirubicin)을 병용한 것으로, 진행성 또는 전이성 ALT-DDLPS에 사용되는 1차 치료법이다.

일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 15-16시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 종양 표본을 잘게 썰어야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 연조직 육종 생물학에 대한 추가 질문에 답하기 위해 유전자 발현 프로파일링, 면역조직화학 분석 또는 세포 독성 분석을 포함한 다양한 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다.

개발 후, 이 기술은 연조직 육종 분야의 연구자들이 제대로 연구되지 않은 악성 종양의 자연사를 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 환자 유래 연조직 육종의 1차 배양을 확립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 생물학적 샘플 및 약물로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용 및 흄 후드 작업과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.