운동 형광 기반 Ca^{2 +} 동원 분석 결과 G 단백질 결합 된 수용 체 주 작동 근, 길 항 근, 그리고 Allosteric 변조기를 식별 하

이 세포 기반 분석의 전반적인 목표는 G 단백질 결합 수용체 매개 세포 내 칼슘 동원을 자극하거나 억제할 수 있는 분자를 식별하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 수용체 매개 세포 내 칼슘체를 변형하는 분자를 스크리닝하는 데 사용할 수 있기 때문에 G 단백질 결합 수용체 약물 발견에 유용한 분석법이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 작용 작용 또는 길항 특성을 가진 분자를 동일한 분석 내에서 식별할 수 있다는 것입니다.

이 분석은 많은 인간 질병에서 역할을 하는 유망한 치료 표적을 약속하는 G 단백질 결합 수용체에 작용하는 새로운 약물 후보를 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 배양 당일, 바닥이 투명한 검은색 폴리스티렌 96웰 플레이트의 각 웰에 0.1% 젤라틴 용액 100마이크로리터로 코팅하고 실온에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 젤라틴이 응고되는 동안 트립신 EDTA 용액을 사용하여 배양 플라스크 바닥에서 관심 세포를 들어 올리고 세포가 분리되면 50ml 원추형 튜브에서 신선한 성장 배지에 세포를 재현탁시킵니다.

계산 후에, 분리기분리에 의하여 세포를 모으고 밀리리터 농도 당 다섯번째 생존 가능한 세포에 1 곱하기 10에 신선한 성장 매체에 있는 펠릿을 refuse. 플레이트가 준비되면 여분의 젤라틴 용액을 버리고 실험실 조직에서 플레이트를 건조시킵니다. 그런 다음 웰을 200마이크로리터의 PBS로 세척하고 웰당 200마이크로리터의 셀로 세척하여 섭씨 37도와 5%이산화탄소에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 아침, 접시를 두드려 우물에서 성장 배지를 버리고 종이 타월로 접시를 거꾸로 말리십시오. 그런 다음 각 웰의 세포에 웰당 100마이크로리터의 로딩 염료 용액을 라벨링하고 실온의 어둠 속에서 45분 동안 플레이트를 배양합니다. 세포가 배양하는 동안 웰당 75마이크로리터의 CXCL12를 케모카인 플레이트에 추가하고 50마이크로리터의 관심 화합물을 화합물 플레이트의 각 웰에 추가합니다.

다음으로, 형광 플레이트 리더의 쿨러 장치를 켠 다음 플레이트 리더 자체를 켭니다. 시스템이 시작될 때까지 몇 분 정도 기다린 후 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니다. 분석 프로토콜을 설정하려면 settings 탭에서 read mode(읽기 모드)를 선택하고 loading dye에 대한 적절한 excitation 및 emission wavelengths를 선택합니다.

복합 플레이트에 있는 화합물의 자동 혼합을 위해 전달 유체가 있는 혼합물 탭을 선택합니다. 이송 유체 탭에서 복합 플레이트의 각 웰을 20마이크로리터씩 측정 플레이트로 옮기고 피펫 팁을 액체 표면 아래 20마이크로리터에 배치합니다. 흡입 속도를 초당 50마이크로리터로, 디스펜싱 속도를 초당 25마이크로리터로 설정하고 전사 유체로 읽기를 클릭합니다.

첫 번째 간격 동안 1초의 판독 간격 시간으로 60개의 판독을 선택하고 화합물이 측정 플레이트에 분주되기 전에 10개의 판독을 기록하고 그 후에 50개의 판독을 완료합니다. 두 번째 간격을 읽기 간격 시간이 30초이고 읽기가 18회인 상태로 설정합니다. 프로토콜에 대해 3회의 팁 세척을 선택하고 각 세척 단계를 설정하여 적절한 세척액, 1회의 세척 주기, 빠른 펌프 속도 및 세척당 5회 스트로크를 포함합니다.

피펫터 일시 중지 기능을 사용하여 300초의 피펫터 일시 중지를 포함하고 전달 유체와 혼합 설정을 사용하여 케모카인 플레이트 내에서 CXCL12 용액을 자동으로 혼합할 수 있습니다. 후속 전달 유체 탭에서 측정 플레이트로 이송할 케모카인 플레이트의 각 웰에서 25마이크로리터를 설정하고 팁을 액체 표면에서 20마이크로리터 아래에 배치합니다. 흡입 속도를 초당 50마이크로리터로 설정하고 디스펜싱 속도를 초당 25마이크로리터로 설정합니다.

read with transfer fluid(전달 유체로 읽기) 버튼을 사용하여 145초의 읽기 간격 시간으로 1개의 읽기를 포함하도록 첫 번째 간격을 설정합니다. 두 번째 간격을 6초의 읽기 간격 시간과 20회 읽기로 설정합니다. 세척 팁 주기를 세 번 더 선택하십시오.

그런 다음 단계 온도 설정을 클릭하고 장치 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. 로딩 염료 배양이 끝나면 측정 플레이트에서 버퍼를 버리고 실험실 조직에서 플레이트를 건조시킵니다. 분석 버퍼 웰당 150마이크로리터로 셀을 세척하고 2분 후에 버퍼를 80마이크로리터의 분석 버퍼로 교체합니다.

측정 플레이트를 판독 위치에, 복합 플레이트를 소스 2 위치에, 케모카인 플레이트를 소스 3 위치에, 검은색 팁 상자를 소스 1 위치에 놓습니다. 장치를 닫고 프로토콜 신호 테스트를 클릭하여 플레이트에 대한 배경 상대 조명 단위와 형광 변화를 확인합니다. 팝업 창에서 테스트 신호를 선택합니다.

8, 000에서 10, 000 상대 조명 단위의 배경 값이 얻어지면 업데이트를 선택하고 저장을 클릭하여 기본 프로토콜을 저장합니다. 그런 다음 run을 눌러 분석을 시작합니다. 이 그래프에서는 칼슘 방출의 용량 의존적 증가와 관련된 형광의 용량 의존적 증가를 관찰할 수 있습니다.

CXCL12 유도 형광의 수준이 증가하면 케모카인 추가 후 첫 번째 측정과 프로토콜의 최종 측정 사이의 기준선에 대한 최소 및 최대 반응 간의 차이를 기반으로 용량 반응 곡선을 생성할 수 있습니다. 해당 기능성 케모카인 수용체 CXCR4가 결핍된 세포를 사용했을 때 고농도에서도 CXCL12에 의해 형광 칼슘 관련 반응이 유발되지 않았으며, 이는 CXCL12 유발 측정의 수용체 특이성을 입증했습니다. 이 세포 기반 분석법의 주요 응용 분야는 사전 배양 후 반응을 억제하지 않는 대조군 비활성 화합물과 비교하여 세포에서 CXCL12 유도 칼슘 동원을 의존적으로 억제하는 작은 분자를 식별하는 것입니다.

소분자의 억제 효능을 결정하기 위해 비선형 회귀를 사용하여 억제 분자에 대한 용량 반응 곡선을 생성할 수 있습니다. 이 분석법은 추가 최적화가 없거나 최소한으로 다른 G 단백질 결합 수용체를 연구하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 다른 케모카인 수용체인 CCR5를 천연 케모카인 작용제 CCL5로 자극했을 때 형광의 용량 의존적 증가가 관찰된 이 실험에서도 사용할 수 있습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 수용체 활성화 시 세포 내 칼슘 이온의 동원을 통해 신호를 보내는 다른 많은 G-단백질 결합 수용체를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 이 세포 분석을 사용하여 CXCL4 케모카인 수용체의 작용제와 길항제를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.