Name: Zika 바이러스 특정 진단 Epitope 발견 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 학습하세요 지카 바이러스 특정 펩타이드를 고밀도 펩타이드 마이크로어레이를 사용하여 진단용 에피토프로 발견하는 방법을. 이 기술은 IgM 및 IgG 항체 검출을 통해 감염 시점을 파악하여 임산부의 건강 관리에 중요한 정보를 제공합니다.

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현재 지원 NIDCRR44 DE024456에서 SBIR (중소 기업 혁신 연구) 관리 보충 그랜트에 의해 제공 됩니다. 에이즈에 대 한 확실 한 포인트의 의료 진단의 개발에 대 한 NIDCR 부여 U01 DE017855 진화 NIDCR 에이즈 그랜트. 우리는 기꺼이 그녀의 기술 지원 및 지원 종류에 대 한 질 케 Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany)를 인정합니다. 우리는 또한 리 오호 오디세이 이미징 시스템에 대 한 NYU Langone 의료 센터 감사합니다.

이러한 데이터 치과의 뉴욕 대학 대학에서 실시 하는 지속적인 연구의 일부 이며는 뉴욕 대학의과 대학, IRB의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다 # H10 01894. 이 연구에 사용 된 임상 샘플 드 식별된 샘플 진단 및 허가 워 즈 워드 센터의 뉴욕 국무부 건강, 알바 니, 뉴욕의 이전에 사용 했다.
1. 설치 ZIKV 고밀도 펩 티 드 Microarray 슬라이드 특정 보육 용지함에
<ol><li>파우더 프리 글러브를 사용 하 여 가장자리에 의해 유리 슬라이드를 처리 합니다. 유리 슬라이드 크기는 25.0 m m와 1 m m 두께의 75.4 m m입니다. Microarray 표면 위로 향하도록 슬라이드 인큐베이션 트레이에 넣습니다.</li>
	<li>Microarray 인쇄 표면에 아래쪽으로 직면 하는 인감의 광택 면을 놓습니다. 좋은 위치를 보장 하기 위해, 인감 및 베이스 플레이트의 나사 구멍을 겹칩니다.</li>
	<li>Microarray 챔버를 만드는 장소 인감에 용지함의 위쪽 부분.</li>
	<li>강화 하 여 동일 하 게 고정 하는 손잡이 하나 다른 손을 번갈아 패턴 뒤에 오른쪽 아래 왼쪽 위에서 시작 하 여 트레이에 있는 슬라이드를 보안 합니다. 인큐베이션 트레이 뚜껑을 놓습니다.</li>
</ol>2. 배경 상호 작용 탐지: 이차 항 체와 Microarray 얼룩
참고: microarray 챔버의 구석에 솔루션 (표준 및 차단 버퍼, 희석된 이차 항 체)를 입금 하는 피 펫을 사용 합니다.
<ol><li>표준 버퍼 (1 x 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), 0.05% 트윈 20, pH 7.4, 0.45 μ m 필터 필터링) microarray를 품 어 (총 2000 µ L/microarray의 볼륨) 140 rpm에서 궤도 통에 상 온 (RT)에서 15 분.</li>
	<li>Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음으로 표준 버퍼를 제거 합니다. Microarray 슬라이드의 침입을 방지 하기 위해 빈 슬라이드에 빈 슬라이드 홀더 채우십시오.</li>
	<li>Microarray 140 rpm에서 궤도 셰이 커에 RT에서 60 분에 대 한 블로킹 버퍼 (2000 µ L/microarray의 총 볼륨)를 차단 합니다.</li>
	<li>Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음에 의해 블로킹 버퍼를 제거 합니다.</li>
	<li>반대로 인간의 IgM 형광 색소 활용 된 항 체 보조와 microarray를 품 어, 희석된 1: 5000 (2000 µ L/microarray의 총 볼륨)는 얼룩에 140 궤도 셰이 커에 어둠 속에서 RT에서 30 분 (10% 차단 하는 표준 버퍼에서 버퍼) 버퍼 rpm을.</li>
	<li>Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫으로 발음 하 여 이차 항 체를 제거 합니다.</li>
	<li>씻어 microarray 3 x, 1 분 당 세척 표준 버퍼 (2000 µ L/140 rpm에서 궤도 셰이 커에 RT에 microarray의 총 볼륨입니다. 각 세척 후 microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음으로 표준 버퍼를 제거 합니다.</li>
	<li>슬라이드 2를 담가 갓된 찍기 버퍼 (1 mM Tris, pH 7.4)에 x, (200 mL의 총 볼륨).</li>
	<li>건조는 microarray 신중 하 게, 약 1 분 동안 슬라이드 화면을 건드리지 않고 슬라이드의 하단을 위쪽에서 매우 신중 하 게 초과 하는 액체를 발음으로. Microarray 스캐너 리더에서 슬라이드 분석.</li>
</ol>3. 혈 청 호스트 Microarray의 노출
주의: Biosafety 수준 2 (BSL-2) 혈 청 표본의 잠재적인 감염 특성 실험실 안전 조건 하에서이 단계를 수행 합니다. 클래스 II 생물 안전 캐비닛 (BSC) 내에서 작동 합니다.
<ol><li>30 분 동안 56 ° C에서 혈 청 샘플 및 4 ° C13에서 5 분 동안 16000 rcf에 원심 분리기를 비활성화. 참고: microarray 챔버의 구석에 솔루션 (얼룩, 표준 버퍼 및 희석된 혈 청)을 입금 하는 피 펫을 사용 합니다.</li>
	<li>1:1,000 (총 양의 2000 μ/microarray) 희석 시작 얼룩 버퍼에 혈 청 샘플을 희석. 사용 될 때까지 그것은 4 ° C 유지.</li>
	<li>140 rpm에서 궤도 셰이 커에 RT에서 15 분 동안 얼룩 버퍼 (전체 양의 2000 μ/microarray) microarray를 품 어.</li>
	<li>Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫으로 발음 하 여 얼룩 버퍼를 제거 합니다.</li>
	<li>140 rpm에서 궤도 통에 4 ° C에서 하룻밤 희석된 혈 청 샘플 microarray를 품 어.</li>
	<li>Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫으로 발음 하 여 희석된 혈 청 샘플을 제거 합니다.</li>
	<li>씻어 microarray 3 x, 1 분 당 세척 표준 버퍼 (140 rpm에서 궤도 셰이 커에 RT에서 2000 μ/microarray의 총 볼륨입니다. 각 세척 후 microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음으로 표준 버퍼를 제거 합니다.</li>
</ol>4. 2 차 항 체와 레이블된 컨트롤 항 체 얼룩이 지기
참고: microarray 챔버의 구석에 솔루션 (표준 버퍼, 희석 및 레이블 항 체)를 입금 하는 피 펫을 사용 합니다.
<ol><li>얼룩 버퍼에서 이차 항 체 희석. 참고: 사용 방지 인간 IgM 형광 색소 활용 항 체 또는 얼룩 버퍼에 1:5,000 (2000 µ L/microarray의 총 볼륨)의 희석에 안티 인간 IgG 형광 색소 활용 된 항 체.</li>
	<li>혼합 컨트롤 레이블 항 체 (단일 클로 널 안티-하 형광 색소 활용 된) 1:1,000 (전체 양의 2 000 µ L/microarray) 이전 버퍼 얼룩에 희석 이차 항 체와 버퍼를 얼룩에 한 희석에.</li>
	<li>RT에서 140 rpm에서 궤도 셰이 커에 어둠 속에서 30 분 동안 microarray와 품 어.</li>
	<li>Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫으로 발음 하 여 희석 및 레이블 항 체의 혼합을 제거.</li>
	<li>워시 표준 버퍼 (2000 µ L/microarray의 총 볼륨) 3 배. 각 세척 140 rpm에서 궤도 셰이 커에 1 분입니다. 각 세척 후 microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음으로 표준 버퍼를 제거 합니다.</li>
</ol>5입니다. Microarray 검사
<ol><li>슬라이드 2를 담가 갓된 찍기 버퍼 (1 mM Tris, pH 7.4) (200 mL의 총 볼륨)에 x.</li>
	<li>건조는 microarray 신중 하 게, 슬라이드 화면을 건드리지 않고 슬라이드의 하단을 위쪽에서 매우 신중 하 게 발음 하 여 약 1 분.</li>
	<li>Microarray 스캐너의 지침에 따라 스캔. 인쇄 된 표면 위로 향하도록 스캐너에 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>새 프로젝트를 만들고 검색 영역을 선택 합니다. 스캐너 매개 변수 설정: 해상도: 21 µ m, 700와 800 nm 채널에 대 한 강도: 7.0, 스캔 품질: 매체 및 오프셋: 0.8.</li>
	<li>취득 하 고 16 비트 회색조 TIFF 파일 형식으로 스캔 raw 이미지를 저장 합니다.</li>
</ol>6. Microarray 분석 특정 소프트웨어를 사용 하 여
<ol><li>Raw 이미지 (TIFF 이미지)를 엽니다. 배열 그리드 파일을 엽니다.</li>
	<li>컴퓨터의 마우스 또는 키보드 화살표 키 스캔 이미지를 배열 눈금에 맞춥니다.</li>
	<li>각 자리에 대 한 신호 강도, 배경 값 및 해당 펩 티 드 순서를 포함 하는 판독 파일을 만들어 특정 소프트웨어에서 "계량 선택"을 선택 합니다. 참고:이 출력 파일 또한 추가 분석 및 그래프를 스프레드시트 프로그램으로 가져올 수 있습니다.</li>
</ol>7. Microarray 스토리지
<ol><li>산소 무료 질소 또는 아르곤 가스에서 4 ° C에서 어둠 속에 봉인 microarray를 저장 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 프로토콜을 포함 하는 전체 Zika 바이러스 단백질 시퀀스 (프랑스어 폴 리 네 시안 스트레인) 고밀도 펩 티 드 microarray를 이용 하 여 설계 되었습니다. microarray 인쇄 3,423 다른 겹치는 선형 펩 티 드에 의해 제조 되었다. 각 펩 티 드 아미노산 15 이었고 시퀀스 (즉, 14 잔류물 오버랩)에 가까운 이웃에서 한 잔류물에 의해 다양 한. 비록 짧은 겹침 인쇄 될 수 있다, epitope 매핑은 더 이상 중복으로 더 정확한입니다. 각 펩 티 드 안정성 향상을 중복 인쇄 했다.
미리 가능한 배경 상호 작용을 검출 하 고 샘플 특정 신호에서 그들을 차별화 하는 이차 항 체와 microarray 얼룩과 프로세스를 시작 하려면 필수적 이다. 특정 블로킹 버퍼를 사용 하 여도 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 말린 우유 분말 감소 신호 강도 발생할 수 있습니다 같은 다른 차단 버퍼 만큼 중요 하다. ZIKV IgM 항 체에 대 한 유...

Zika 바이러스 (ZIKV) 진단에 따라 임상 증상은 뎅 그 열과 Chikungunya 바이러스 감염1벡터, 지리적 분포와 증상을 공유 하기 때문에 도전 이다. 여자 임신 중 ZIKV 감염에 불리 한 임신 결과 대 한 위험을 감안할 때, 그것은 3 바이러스 사이 구별 하는 것이 중요. 현재 분자 진단 테스트 특정 있지만, 그들은 단지 혈액 이나 타 액에 유용 급성 감염2,3의 상대적으로 짧은 기간 동안. 혈 청 학적인 분석 실험 진단 감염4의이 초기 기간이 필수적입니다.
ZIKV 특정 혈 청 학적인 분석 결과의 개발은 두 가지 이유로 도전: 첫째, 인간의 면역 체계에 응답 Zika 항 현재 알려져 있지 않습니다; 그리고 두 번째, 보존 flaviviruses 아미노산 시퀀스 유도 항 체 분. 우리의 목표는 독특한 ZIKV 특정 펩 티 드 진단에 사용할 수 발견 했다. 다른 방법을 개발 되었으며, 살 균 소, 세균를 포함 하 여 전체 단백질을 다루는 화면 펩타이드 라이브러리 및 효 모 표면 표시5,6,7,,89, 10. 우리의 전략은 신속 하 고 저렴 한 높은 처리량 serological 검사11,12 를 허용 하는 고밀도 펩타이드 microarray를 사용 하 고 이후에 확인 된 펩 티 드 serological 전류를 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다. ZIKV 감염의 탐지를 위한 분석 실험입니다.
이 프로토콜 Zika 바이러스 특정 진단 펩 티 드의 고밀도 펩타이드 microarray (그림 1)를 사용 하 여 검색을 수 있습니다. 고밀도 펩 티 드 microarray 펩 티 드 레이저 인쇄 기술을 사용 하 여 제작 되었다. 프랑스 폴리네시아 스트레인 기반 3,423 아미노산 잔류물의 구성 된 전체 ZIKV 단백질 시퀀스 (은행: KJ776791.2), 표준 유리 슬라이드에 대 한 중복 14 아미노산 잔류물의 중복 15 선형 잔류물의 블록에서에 인쇄 되었다는 총 6,846 펩 티 드 명소입니다. 전체 Zika 단백질 시퀀스 펩 티 드, 이외는 microarray 인플루엔자 조류 활용 (HA) 펩 티 드 내부 통제에 대 한.
Zika 검증 긍정적인 워즈워스 센터 (알바 니, 뉴욕)에서 얻은 혈 청 샘플 특정 면역 글로불린 M (IgM) 및 면역 글로불린 G (IgG) 반응 펩 티 드 식별 하는 데 사용 되었다. 밤새 샘플 잠복기 후에 microarray는 보조 형광 색소 활용 된 항 체 (반대로 인간 IgM 또는 반대로 인간 IgG), 물 고 microarray 스캐너에 분석. 자리 농도 및 펩 티 드 주석의 정량화는 microarray 제조 같은 회사에 의해 제공 하는 특정 소프트웨어와 함께 수행 되었다.

<table><tbody><tr><td>PEPperCHIP 맞춤형 펩타이드 마이크로어레이</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.001.001</td><td>맞춤형 펩타이드 마이어레이: 당사의 마이크로어레이에는 전체 지카 바이러스 단백질 서열이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>PEPperCHIP 배양 트레이 3/1</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.004.001</td><td></td></tr><tr><td>PEPperCHIP 염색 키트(680nm)(안티HA, 다이라이트 라벨링)</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.037.002</td><td></td></tr><tr><td>PepSLide 분석기</td><td>PEPperPRINT</td><td>PSA.004.001</td><td>Windows Rockland</td></tr><tr><td>차단 버퍼</td><td>Rockland</td><td>MB-070</td><td></td></tr><tr><td>반인간 IgM(뮤 체인) DyLight 800</td><td>Rockland</td><td>609-145-007</td><td></td></tr><tr><td>반인간 IgG Fc DyLight 680</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10138</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey 이미징 시스템</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>궤도 쉐이커 장치</td><td>IKA</td><td>MTS 2/4 디지털 마이크로타이터 셰이커</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltagraph</td><td>Redrocks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zika 바이러스 특정 진단 epitope 발견

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

고밀도 펩타이드 microarrays 단일 표준 현미경 슬라이드에서 6 천 이상의 펩 티 드의 심사를 허용합니다. 이 방법은 약물 발견, 치료 대상 식별 및 개발에 적용할 수 있습니다 진단의. 여기, 선물이 특정 Zika 바이러스 (ZIKV) 진단 펩 티 드 고밀도 펩타이드 microarray를 사용 하 여 발견 하는 프로토콜. 인간의 혈 청 샘플 ZIKV 감염 14-aa 잔류물 중복 3,423 독특한 15 선형 아미노산 (aa) 잔류물으로 번역 전체 ZIKV 단백질을 포함 하는 고밀도 펩 티 드 microarray와 알을 품는 대 한 유효성 검사 중복에서 인쇄. 동일한 배열 내에서 다른 이차 항 체와 얼룩, 우리 면역 글로불린 M (IgM) 및 혈 청에 있는 항 체는 면역 글로불린 G (IgG)에 바인딩되는 펩 티 드를 발견 했습니다. 이러한 펩 티이 드 추가 검증 실험에 대 한 선정 됐다. 이 프로토콜에서 우리는 디자인, 처리, 그리고 고밀도 펩타이드 microarray 분석 전략을 설명 합니다.

설명 된 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과 그림 2 에 표시 된 및 그림 3. 아니 배경 상호 작용 미리 보조 안티 인간 IgM (데이터 표시 되지 않음) microarray 얼룩 때 지적 했다. 공액 배경 녹색 형광 강렬, 이러한 펩 티이 드에 IgM와 호스트 혈 청 샘플 (그림 2)에서 바인딩을 나타내는 위의 여러 분야에서 결과 반대로 인간 IgM와 얼룩. IgG 탐지 (빨간색 형광 신호) 공개만 몇 펩 (그림 2).
제조는 microarray 같은 회사에 의해 제공 하는 특정 소프트웨어 스캔 후는 microarray를...

이 프로토콜에서 우리 Zika 바이러스 특정 진단 펩 티 드 고밀도 펩타이드 microarray를 사용 하 여 발견 하는 기법을 설명 합니다. 이 프로토콜 readly 다른 신흥 감염 증에 대 한 적응 될 수 있다.

Zika 바이러스 특정 진단 Epitope 발견

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

이 실험의 전반적인 목표는 지카 바이러스 항체를 검출하기 위한 진단 분석에 사용할 지카 바이러스 특이적 펩타이드를 식별하는 것입니다. 바이러스는 약 10일 안에 혈액에서 사라지는 반면 항체는 수년 동안 남아 있기 때문에 이는 매우 중요합니다. 이 방법을 통해 전체 지카 단백질체의 마이크로어레이를 활용하여 항원과 에피토프를 식별하여 감염된 개인의 혈청 샘플에서 IgM 또는 IgG 항체를 포획하는 펩타이드를 식별할 수 있습니다.초기 항체인 IgM과 후기 항체인 IgG를 모두 검출하는 데 있어 가장 큰 장점은 임상의에게 감염 타임라인을 제공하는 것입니다. 그리고 이것은 임산부에게 특히 중요합니다. 이 프로토콜은 지카 바이러스 감염의 원인에 대한 통찰력을 제공하지만, 단백질 염기서열이 알려진 경우 해당 병원체에 특이적인 마이크로어레이를 사용하여 다른 병원체에 적용할 수 있습니다.가루가 없는 장갑을 사용하여 유리 슬라이드의 가장자리를 다루십시오. 유리 슬라이드 치수는 75.4mm x 25.0mm이며 두께는 1mm입니다. 마이크로어레이 표면이 위를 향하도록 하여 슬라이드를 배양 트레이에 놓습니다.마이크로어레이 슬라이드가 파손되는 것을 방지하기 위해 빈 슬라이드 홀더를 빈 슬라이드로 채웁니다. 씰의 광택 면이 아래쪽을 향하도록 마이크로어레이 인쇄된 표면에 놓습니다. 좋은 위치를 확보하려면 씰의 나사 구멍과 베이스 플레이트를 겹치십시오.트레이의 윗부분을 씰에 놓아 마이크로어레이 챔버를 만듭니다. 나비 나사를 교대로 손으로 차례로 동일하게 조여 트레이에 슬라이드를 고정합니다. 왼쪽 위에서 시작하여 오른쪽 아래로 진행합니다.배양 트레이에 뚜껑을 놓습니다. 마이크로어레이 표면이 긁히지 않도록 마이크로어레이를 조심스럽게 취급하는 것이 필수적입니다. 용액은 마이크로어레이 챔버의 모서리에 첨가된 다음 제거됩니다.마이크로어레이를 건조하는 것도 양호한 스캔 이미지를 제공하는 데 중요합니다. 2, 140 rpm에 궤도 셰이커에 실온에 15 분 동안 microarray 당 표준 완충액의 000 microliters를 가진 microarray를 배양하십시오. 마이크로어레이 챔버 모서리에서 피펫으로 흡입하여 표준 버퍼를 제거한 다음 140rpm의 오비탈 셰이커에서 실온에서 60분 동안 블로킹 버퍼로 마이크로어레이를 차단합니다.마이크로어레이 챔버의 모서리에서 피펫으로 흡입하여 블로킹 버퍼를 제거합니다. 염색 완충액에서 1:5, 000으로 희석된 anti-human IgM fluorochrome conjugated secondary antibody를 마이크로어레이에 추가합니다. 그런 다음 140rpm의 오비탈 셰이커에서 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 마이크로어레이를 배양합니다.피펫을 사용하여 마이크로어레이 챔버의 모서리에서 흡인하여 2차 항체를 제거합니다. 140rpm의 오비탈 셰이커에서 실온에서 마이크로어레이당 표준 버퍼를 사용하여 2000마이크로리터로 마이크로어레이를 1분 동안 세척합니다. 시연된 기술을 사용하여 표준 버퍼를 제거하고 세척을 두 번 반복합니다.다음으로, 슬라이드를 갓 준비한 디핑 버퍼 200ml에 두 번 담그십시오. 슬라이드 표면을 건드리지 않고 슬라이드의 상단에서 하단으로 과도한 유체를 매우 조심스럽게 흡입하여 약 1분 동안 마이크로어레이를 조심스럽게 건조시킵니다. 이 비디오의 뒷부분에 설명된 대로 마이크로어레이 스캐너 리더의 슬라이드를 분석합니다.혈청 샘플을 섭씨 56도에서 30분 동안 비활성화합니다. 다음 16, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 RCF에 표본을 원심 분리하십시오. 사용할 때까지 샘플을 섭씨 4도에서 유지하십시오.그런 다음 140rpm의 오비탈 셰이커에서 실온에서 15분 동안 염색 완충액과 함께 마이크로어레이를 배양합니다. 피펫으로 마이크로어레이 챔버의 모서리에서 흡입하여 염색 완충액을 제거합니다. 혈청 샘플과 염색 완충액을 1:1, 000 희석으로 희석합니다.희석된 시료를 140rpm의 오비탈 셰이커에서 섭씨 4도의 마이크로어레이로 밤새 배양합니다. 입증된 기술을 사용하여 희석된 혈청 샘플을 제거합니다. 그런 다음 이전과 같이 마이크로어레이를 세 번 세척합니다.염색 완충액에서 2차 항체를 희석합니다. 염색 완충액에서 1:5, 000의 희석으로 anti-human IgM fluorochrome conjugated antibody 또는 anti-human IgG fluorochrome conjugated antibody를 사용합니다. 그런 다음 염색 완충액에서 1:1000 희석으로 대조군 표지 항체를 희석된 2차 항체와 혼합합니다.마이크로어레이를 사용하여 실온에서 어두운 곳과 140rpm의 오비탈 셰이커에서 30분 동안 배양합니다. 마이크로어레이 챔버의 모서리에서 피펫으로 흡인하여 희석된 2차 항체와 표지된 항체의 혼합물을 제거합니다. 그런 다음 표준 버퍼로 마이크로어레이를 세 번 세척합니다.각 세척은 140rpm의 오비탈 셰이커에서 1분 동안 진행됩니다. 마지막으로, 이전과 같이 마이크로어레이 챔버에서 세척 버퍼를 제거합니다. 마이크로어레이 스캔을 수행하려면 슬라이드를 갓 준비한 200ml의 디핑 버퍼에 두 번 담그십시오.슬라이드 표면을 건드리지 않고 슬라이드의 위에서 아래로 매우 조심스럽게 흡인하여 약 1분 동안 마이크로어레이를 건조시킵니다. 스캐너의 지시에 따라 마이크로어레이를 스캔합니다. 인쇄면이 위를 향하도록 하여 슬라이드를 스캐너에 놓습니다.새 프로젝트를 만들고 스캔 영역을 선택합니다. 21미크론의 해상도, 700 및 800 나노미터 채널 모두에 대해 7.0의 강도, 중간의 스캔 품질 및 0.8의 오프셋으로 스캐너 매개변수를 설정합니다. 스캔 그리기 이미지를 16비트 그레이스케일 TIF 파일 형식으로 획득하고 저장합니다.데이터를 분석하려면 원시 이미지를 엽니다. 그런 다음 배열 그리드 파일을 엽니다. 어레이 그리드를 컴퓨터의 마우스 또는 키보드 화살표 키를 사용하여 스캔 이미지에 맞춥니다.특정 소프트웨어에서 Quantify selection을 선택하면 각 스폿에 대한 신호 강도, 배경 값 및 해당 펩타이드 염기서열이 포함된 판독 파일이 생성됩니다. 마지막으로, 마이크로어레이를 섭씨 4도의 암흑 속에 밀봉하여 무산소 질소 또는 아르곤 가스 아래에 보관합니다. 여기에 표시된 것은 1:250으로 희석된 특정 지카 바이러스 혈청 샘플로 배양한 후 마이크로어레이를 항인간 IgG로 염색하는 원시 형광 이미지입니다.HA 제어 펩타이드는 마이크로어레이를 구성합니다. IgG에 강하게 반응하는 펩타이드가 확대/축소 패널에 표시됩니다. 유사하게, 여기에 표시된 것은 1:250으로 희석된 특정 지카 바이러스 혈청 샘플로 배양한 후 마이크로어레이를 항인간 IgM으로 염색하는 원시 형광 이미지입니다.다시, HA 제어 펩타이드는 마이크로어레이를 구성합니다. IgM에 강하게 반응하는 펩타이드가 확대/축소 패널에 표시됩니다. 여기에 표시된 것은 숙주 혈청 샘플 펩타이드에서 IgM과 반응하는 대표적인 지카 바이러스 에피토프 합의 서열입니다.에피토프 합의 염기서열(epitope consensus sequence)의 펩타이드는 빨간색으로 강조 표시되며, 형광 강도가 가장 높은 펩타이드는 굵게 표시됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 고밀도 펩타이드 마이크로어레이를 처리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 24시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 마이크로어레이 표면이 긁히지 않도록 마이크로어레이를 조심스럽게 다루는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명 결합 분석법과 같은 다른 방법을 수행하여 식별된 펩타이드가 다른 Flavivirus 항체가 아닌 Zika 바이러스 항체에 특이적으로 결합하는지 확인할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 혈청 및 타액 검체를 사용하여 진단 펩타이드를 발견하기 위한 진단 분야의 연구자들을 위한 길을 열 것입니다.지카 바이러스와 같은 감염원을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 혈청 샘플을 가열로 비활성화하고 생물 안전 레벨 2 시설에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

지카 바이러스(ZIKV)는 신종 병원체로, 태아 발달 이상 및 소두증과 관련이 있습니다. 효과적인 감염성 세포 배양 시스템의 구축은 ZIKV 복제 연구와 백신 및 약물 개발에 매우 중요합니다. 본 연구에서는 ZIKV와 관련된 다양한 바이러스 분석을 설명하고 논의합니다.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

여기에서 저자는 도트-블롯 하이브리드화를 통해 정제된 단클론 항체와 펩타이드 스캐닝을 사용하여 선형 항원 항원결정기를 정의하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 그런 다음 식별된 항원결정기를 치료 및 진단 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

이 프로토콜은 두 개의 플라스미드 감염성 cDNA 클론으로부터 감염성 Zika 바이러스의 회수를 설명합니다.

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

Zika 바이러스 (ZIKV) 감염에 대 한 Ifnar1-/- murine 모델의 immunoprivileged 장기에 항 원 특정 T 세포 응답을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 보호의 셀룰러 메커니즘 및 immunopathogenesis ZIKV 백신의 조사에 대 한 중추적인 이며 또한 그들의 효능 평가 위한 귀중 한.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

우리는, 사용 하 여 인간의 혈 청 기본 인간 세포 감염 부 량 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 Zika 바이러스 감염에 뎅기열 바이러스에 대 한 기존의 면역의 효과 평가 하는 방법을 설명 합니다.

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

프로토콜의 목표는 감염 다음 마우스에 있는 다중 기관에서 Zika 바이러스를 격리하고 정량화하여 바이러스성 질병을 조사하기 위하여 이용된 기술을 설명하는 것입니다.

마우스의 여러 장기에서 Zika 바이러스의 격리 및 정량화

제시된 프로토콜은 봉쇄 환경에서 Zika와 같은 주어진 바이러스에 대한 Aedes aegypti 모기 집단의 벡터 역량을 결정할 수 있다.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

이 작품에서, 우리는 높은 처리량 선별 형식으로 Zika 바이러스 복제의 억제제를 선별하기 위하여 보충 기지를 둔 바이러스성 효소 기지를 둔 분석에서 이용된 프로토콜을 기술합니다.

지카 바이러스 복제억제제에 대한 화면에 높은 처리량 항 바이러스 적 소사

다중 형광 면역분석법은 혈청학 검사의 참고 자료가 되고 있습니다. 그러나 이들의 적용은 복잡성과 시간이 많이 걸리는 비드-분석물 결합 공정으로 인해 제한됩니다. 이 보고서는 결과 도출 시간을 크게 단축하면서 표준 방법과 비교할 수 있는 반자동 재현 가능한 다중 마이크로스피어 비드 커플링 프로토콜을 제시합니다.

아르보바이러스에 대한 항체 반응 검출을 위한 다중 혈청학적 분석

학습하세요 지카 바이러스 특정 펩타이드를 고밀도 펩타이드 마이크로어레이를 사용하여 진단용 에피토프로 발견하는 방법을. 이 기술은 IgM 및 IgG 항체 검출을 통해 감염 시점을 파악하여 임산부의 건강 관리에 중요한 정보를 제공합니다.

Zika 바이러스 특정 진단 Epitope 발견

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