Zika 바이러스 특정 진단 Epitope 발견

이 실험의 전반적인 목표는 지카 바이러스 항체를 검출하기 위한 진단 분석에 사용할 지카 바이러스 특이적 펩타이드를 식별하는 것입니다. 바이러스는 약 10일 안에 혈액에서 사라지는 반면 항체는 수년 동안 남아 있기 때문에 이는 매우 중요합니다. 이 방법을 통해 전체 지카 단백질체의 마이크로어레이를 활용하여 항원과 에피토프를 식별하여 감염된 개인의 혈청 샘플에서 IgM 또는 IgG 항체를 포획하는 펩타이드를 식별할 수 있습니다.

초기 항체인 IgM과 후기 항체인 IgG를 모두 검출하는 데 있어 가장 큰 장점은 임상의에게 감염 타임라인을 제공하는 것입니다. 그리고 이것은 임산부에게 특히 중요합니다. 이 프로토콜은 지카 바이러스 감염의 원인에 대한 통찰력을 제공하지만, 단백질 염기서열이 알려진 경우 해당 병원체에 특이적인 마이크로어레이를 사용하여 다른 병원체에 적용할 수 있습니다.

가루가 없는 장갑을 사용하여 유리 슬라이드의 가장자리를 다루십시오. 유리 슬라이드 치수는 75.4mm x 25.0mm이며 두께는 1mm입니다. 마이크로어레이 표면이 위를 향하도록 하여 슬라이드를 배양 트레이에 놓습니다.

마이크로어레이 슬라이드가 파손되는 것을 방지하기 위해 빈 슬라이드 홀더를 빈 슬라이드로 채웁니다. 씰의 광택 면이 아래쪽을 향하도록 마이크로어레이 인쇄된 표면에 놓습니다. 좋은 위치를 확보하려면 씰의 나사 구멍과 베이스 플레이트를 겹치십시오.

트레이의 윗부분을 씰에 놓아 마이크로어레이 챔버를 만듭니다. 나비 나사를 교대로 손으로 차례로 동일하게 조여 트레이에 슬라이드를 고정합니다. 왼쪽 위에서 시작하여 오른쪽 아래로 진행합니다.

배양 트레이에 뚜껑을 놓습니다. 마이크로어레이 표면이 긁히지 않도록 마이크로어레이를 조심스럽게 취급하는 것이 필수적입니다. 용액은 마이크로어레이 챔버의 모서리에 첨가된 다음 제거됩니다.

마이크로어레이를 건조하는 것도 양호한 스캔 이미지를 제공하는 데 중요합니다. 2, 140 rpm에 궤도 셰이커에 실온에 15 분 동안 microarray 당 표준 완충액의 000 microliters를 가진 microarray를 배양하십시오. 마이크로어레이 챔버 모서리에서 피펫으로 흡입하여 표준 버퍼를 제거한 다음 140rpm의 오비탈 셰이커에서 실온에서 60분 동안 블로킹 버퍼로 마이크로어레이를 차단합니다.

마이크로어레이 챔버의 모서리에서 피펫으로 흡입하여 블로킹 버퍼를 제거합니다. 염색 완충액에서 1:5, 000으로 희석된 anti-human IgM fluorochrome conjugated secondary antibody를 마이크로어레이에 추가합니다. 그런 다음 140rpm의 오비탈 셰이커에서 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 마이크로어레이를 배양합니다.

피펫을 사용하여 마이크로어레이 챔버의 모서리에서 흡인하여 2차 항체를 제거합니다. 140rpm의 오비탈 셰이커에서 실온에서 마이크로어레이당 표준 버퍼를 사용하여 2000마이크로리터로 마이크로어레이를 1분 동안 세척합니다. 시연된 기술을 사용하여 표준 버퍼를 제거하고 세척을 두 번 반복합니다.

다음으로, 슬라이드를 갓 준비한 디핑 버퍼 200ml에 두 번 담그십시오. 슬라이드 표면을 건드리지 않고 슬라이드의 상단에서 하단으로 과도한 유체를 매우 조심스럽게 흡입하여 약 1분 동안 마이크로어레이를 조심스럽게 건조시킵니다. 이 비디오의 뒷부분에 설명된 대로 마이크로어레이 스캐너 리더의 슬라이드를 분석합니다.

혈청 샘플을 섭씨 56도에서 30분 동안 비활성화합니다. 다음 16, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 RCF에 표본을 원심 분리하십시오. 사용할 때까지 샘플을 섭씨 4도에서 유지하십시오.

그런 다음 140rpm의 오비탈 셰이커에서 실온에서 15분 동안 염색 완충액과 함께 마이크로어레이를 배양합니다. 피펫으로 마이크로어레이 챔버의 모서리에서 흡입하여 염색 완충액을 제거합니다. 혈청 샘플과 염색 완충액을 1:1, 000 희석으로 희석합니다.

희석된 시료를 140rpm의 오비탈 셰이커에서 섭씨 4도의 마이크로어레이로 밤새 배양합니다. 입증된 기술을 사용하여 희석된 혈청 샘플을 제거합니다. 그런 다음 이전과 같이 마이크로어레이를 세 번 세척합니다.

염색 완충액에서 2차 항체를 희석합니다. 염색 완충액에서 1:5, 000의 희석으로 anti-human IgM fluorochrome conjugated antibody 또는 anti-human IgG fluorochrome conjugated antibody를 사용합니다. 그런 다음 염색 완충액에서 1:1000 희석으로 대조군 표지 항체를 희석된 2차 항체와 혼합합니다.

마이크로어레이를 사용하여 실온에서 어두운 곳과 140rpm의 오비탈 셰이커에서 30분 동안 배양합니다. 마이크로어레이 챔버의 모서리에서 피펫으로 흡인하여 희석된 2차 항체와 표지된 항체의 혼합물을 제거합니다. 그런 다음 표준 버퍼로 마이크로어레이를 세 번 세척합니다.

각 세척은 140rpm의 오비탈 셰이커에서 1분 동안 진행됩니다. 마지막으로, 이전과 같이 마이크로어레이 챔버에서 세척 버퍼를 제거합니다. 마이크로어레이 스캔을 수행하려면 슬라이드를 갓 준비한 200ml의 디핑 버퍼에 두 번 담그십시오.

슬라이드 표면을 건드리지 않고 슬라이드의 위에서 아래로 매우 조심스럽게 흡인하여 약 1분 동안 마이크로어레이를 건조시킵니다. 스캐너의 지시에 따라 마이크로어레이를 스캔합니다. 인쇄면이 위를 향하도록 하여 슬라이드를 스캐너에 놓습니다.

새 프로젝트를 만들고 스캔 영역을 선택합니다. 21미크론의 해상도, 700 및 800 나노미터 채널 모두에 대해 7.0의 강도, 중간의 스캔 품질 및 0.8의 오프셋으로 스캐너 매개변수를 설정합니다. 스캔 그리기 이미지를 16비트 그레이스케일 TIF 파일 형식으로 획득하고 저장합니다.

데이터를 분석하려면 원시 이미지를 엽니다. 그런 다음 배열 그리드 파일을 엽니다. 어레이 그리드를 컴퓨터의 마우스 또는 키보드 화살표 키를 사용하여 스캔 이미지에 맞춥니다.

특정 소프트웨어에서 Quantify selection을 선택하면 각 스폿에 대한 신호 강도, 배경 값 및 해당 펩타이드 염기서열이 포함된 판독 파일이 생성됩니다. 마지막으로, 마이크로어레이를 섭씨 4도의 암흑 속에 밀봉하여 무산소 질소 또는 아르곤 가스 아래에 보관합니다. 여기에 표시된 것은 1:250으로 희석된 특정 지카 바이러스 혈청 샘플로 배양한 후 마이크로어레이를 항인간 IgG로 염색하는 원시 형광 이미지입니다.

HA 제어 펩타이드는 마이크로어레이를 구성합니다. IgG에 강하게 반응하는 펩타이드가 확대/축소 패널에 표시됩니다. 유사하게, 여기에 표시된 것은 1:250으로 희석된 특정 지카 바이러스 혈청 샘플로 배양한 후 마이크로어레이를 항인간 IgM으로 염색하는 원시 형광 이미지입니다.

다시, HA 제어 펩타이드는 마이크로어레이를 구성합니다. IgM에 강하게 반응하는 펩타이드가 확대/축소 패널에 표시됩니다. 여기에 표시된 것은 숙주 혈청 샘플 펩타이드에서 IgM과 반응하는 대표적인 지카 바이러스 에피토프 합의 서열입니다.

에피토프 합의 염기서열(epitope consensus sequence)의 펩타이드는 빨간색으로 강조 표시되며, 형광 강도가 가장 높은 펩타이드는 굵게 표시됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 고밀도 펩타이드 마이크로어레이를 처리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 24시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 마이크로어레이 표면이 긁히지 않도록 마이크로어레이를 조심스럽게 다루는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명 결합 분석법과 같은 다른 방법을 수행하여 식별된 펩타이드가 다른 Flavivirus 항체가 아닌 Zika 바이러스 항체에 특이적으로 결합하는지 확인할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 혈청 및 타액 검체를 사용하여 진단 펩타이드를 발견하기 위한 진단 분야의 연구자들을 위한 길을 열 것입니다.

지카 바이러스와 같은 감염원을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 혈청 샘플을 가열로 비활성화하고 생물 안전 레벨 2 시설에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.