Name: 소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 배우세요 무급지대 시스템을 이용한 murine NK 세포 대량 생산 방법을. 이 기술은 고순도 NK 세포를 생산하여 선천면역 및 암면역 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 연구-CUHK (2016.035), 및 홍콩 학자에 대 한 연구 보조금 위원회의 홍콩 (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) 및 혁신 및 기술 기금의 홍콩 (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), 직접 보조금에 의해 지원 되었다 프로그램입니다.
H. Y.L. 설계 및 모든 실험을 감독 및 원고 준비에 기여. 오후-K.T. 실험 수행, 데이터 분석 및 원고 준비에 기여. 시공-T. 토니, 재-F.C., M.W.-대표-C., 반장 님, 질문, 및 G. Y.L. 동물 샘플을 수집 하 고 동물 실험에 참가 했다. 제, 엑스-상대습도, K. 무정 지형 원고 준비에 기여.

프로토콜 및 골 수 유래 NK 분화 세포 (BM-NK)에 대 한 이전 게시 방법20,,2122에 기반. 쥐와 모든 절차는 여는 동물 윤리 실험 위원회 (AEEC) 홍콩의 중국 대학에 승인 되었습니다.
1입니다. 준비 OP9 조건부 매체의
<ol><li>알파-MEM 20 %FBS, 100 U/mL 페니실린 G 및 공기/CO2 의 습도 분위기에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 스 murine 기질 세포 라인 OP9 문화 (95%: 5%).<ol>
<li>Hemocytometer, 다음 씨앗 2 x 106 OP9 각 75 cm2 문화 플라스 크에 세포의 중간의 15 mL와 함께 셀을 계산 합니다. 48 h에 대 한 문화입니다.</li>
		<li>문화에는 80% 합류에 도달 하면, PBS의 10 mL로 플라스 크를 씻고 고 플라스 크 당 (FBS와 항생제) 없이 일반 알파 가상 매체의 20 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 h 문화 플라스 크에서 OP9 조건 매체를 수집 하 고 0.25 µ m polyethersulfone (PES) 필터 셀 파편 청소 4 ° C (사용 2 주 이내)에서 보존.</li>
</ol>2입니다. 마우스 골 수 세포의 고립
<ol><li>Pentobarbitone 과다 (100 mg/kg, 복 주사)와 함께 12 주 된 C57BL/6J 마우스 안락사 호흡의 부족에 의해 죽음을 확인 다음 뼈 사이 접속점에 수술 칼 커팅으로 대 퇴 골 뼈를 수확 하 고 부드러운 긁 적 하 여 블레이드와 나머지 근육을 제거 합니다.</li>
	<li>냉장된 멸 균 알파-MEM를 포함 하는 50 mL 원심 분리기 튜브에 뼈를 놓고 biosafety 내각에서 다음 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>알파-MEM 매체를 삭제 하 고 30 대 70% 에탄올과 뼈를 씻어 s.</li>
	<li>두 번을 나머지 에탄올 차가운 살 균 PBS 가진 뼈를 씻어.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 PBS의 5 mL를 포함 하는 박격포에서 뼈를 전송 하 고는 유 봉과 뼈를 부드럽게 fragmentize (할 하지 격파 그들).</li>
	<li>교 반 하십시오 뼈 부드럽게 골 수 세포는 PBS에 풀어 유 봉 소용돌이 의해. 새로운 50 mL 원심 분리기 튜브로 PBS 포함 하 골 수 세포를 수집 합니다.</li>
	<li>뼈 조각 단단한 흰색 색상에 될 때까지 4 번 2.6에 대 한 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>465 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 관을 원심 다음 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>18 mL의 멸 균 증류수와 펠 릿을 resuspend 하 고 그것은 30 서 적혈구를 제거 하는 s.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 10의 2 개 mL를 추가 X PBS는 반응 중지 하는 다음 lysed 적혈구를 제거 하려면 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 혼합물을 필터링.</li>
	<li>465 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 관을 원심 얼음 처럼 차가운 PBS의 20 mL와 펠 릿 resuspend</li>
	<li>2.11 단계를 두 번 반복 하 여 세포를 씻어.</li>
	<li>100 m m 멸 균 페 트리 접시에 단계의 1.2 OP9 조건부 매체의 10 mL와 20로 보충 셀 펠 릿을 전송 %FBS 0.5 ng/mL의 혼합물 murine 일리노이-7, 30 ng/mL 마우스 SCF와 100 U/mL murine flt3L.</li>
	<li>품 어 2 h. 전송에 대 한 5% CO2 와 37 ° C에서 접시 첨부 되지 않은 셀 5 x 105 가능한 셀/mL (trypan 블루 제외과 hemocytometer 여 수 세포)의 밀도에 새로운 문화 컨테이너로 단계 2.13 에서처럼 동일한 중간 수식 5% CO2와 37 ° C에서 품 어와.</li>
	<li>하루에 4, 변경 OP9 조건부 매체 문화 상태 20 %FBS 및 2000 U/mL murine 일리노이-2의 보충.</li>
	<li>새로 문화 매체 매 3 일; NK 세포로 성숙 7 일 여 하 고 섹션 4에서 자격을 갖춘 수 있습니다.</li>
</ol>3. NK 세포 분화의 유전자 Silencing siRNA 중재
<ol><li>제품 설명서에 따라 transfection 에이전트와 siRNA 또는 넌센스 제어 (NC) 공기로</li>
	<li>0부터 시간 언제 든 지 3.1 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>추가 50 nM siRNA 또는 단계 2.14에서에서 셀에 NC 혼합물의.</li>
	<li>실험 끝 지점까지 모든 중간 다과 (예를 들어, 0, 4, 및 7 일)에 3.1 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>4. NK 세포 분화 Cytometry 사용의 분석
<ol><li>적절 한 시간에서 세포 분화의 정지를 수집 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS로 세척.</li>
	<li>제품 설명서에 따라 셀 고정 버퍼와 셀을 수정 합니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 PBS 가진 고정된 셀을 세척 하 고 resuspend Flow Cytometry 얼룩 버퍼 포함 Cy3 활용 된 반대로 마우스 NKp46의 100 µ L에 1 x 106 셀과 1: 100 희석 비율에 반대로 마우스 CD244 항 체 PE 활용.</li>
	<li>샘플 2 h에 대 한 실 온에서 어둠 속에 얼룩.</li>
	<li>Resuspend, PBS의 300 µ L로 얼룩진된 샘플 다음 FACS 데이터 및 Cytobank 플랫폼20 (http://cytobank.org/)와 분석.</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
<li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li>
<li>Rusakiewicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+infiltrates+are+prognostic+factors+in+localized+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).</li>
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<li>Rubnitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKAML%3A+a+pilot+study+to+determine+the+safety+and+feasibility+of+haploidentical+natural+killer+cell+transplantation+in+childhood+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia.</a> J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).</li>
<li>Curti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transfer+of+alloreactive+haploidentical+KIR+ligand-mismatched+natural+killer+cells+after+infusion+in+elderly+high+risk+acute+myeloid+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients.</a> Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+acute+myeloid+leukemia+by+haploidentical+natural+killer+cells+is+improved+using+IL-2+diphtheria+toxin+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein.</a> Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).</li>
<li>Stringaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-induced+phenotypic+and+functional+defects+in+natural+killer+cells+predict+failure+to+achieve+remission+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).</li>
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<li>Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+tumor+suppression+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression.</a> Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).</li>
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<li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li>
<li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-%CE%B3+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li>
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<li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+NK1.1%2B%2C+Ly49%2B+NK+cells+from+flt3%2B+multipotent+marrow+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li>
<li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677(2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

현재 작업에서 우리는 murine NK 세포 골 수 파생 에 시험관을 생산 하는 새로운 방법을 설명 했습니다. 원래 시스템21,22 에 셀 피더 성공적으로 크게 차별화 시스템의 안정성을 증가 OP9 셀의 조건부 매체에 의해 대체 됩니다. 또한, 시스템 높은 수량을 생산할 수 있는 고 순도 성숙한 NK의 세포 생체 외에서 뿐 아니라 대 한 vivo에서 분석 실험, 인간 질병에 있는 NK 세포의 변환 연구 뿐만 아니라 기계 연구를 촉진할 수 있다.
설명된 방법 TGF-β1 NK 세포 억제 암 개발23동안에 신호의 규제 역할을 조사를 위해 사용 되었습니다. 피더 세포에서 아무런 영향을 확인 하 고는, 억제제 중재 억제 뿐 아니라 중재 하는 siRNA 유전자 최저 효율 크게 개선 되었습니다. ...

암 진행은 종양 microenvironment1,2, 호스트에서 파생 된 immunocytes, 예를 들면, NK 세포에 크게 의존 합니다. 여러 학문의 intratumoral NK 세포는 종양 진행3,4부정적인 상관 관계를 설명 했다. 또한, 임상 연구 보여주었다 NK 세포 입양 치료 암5,6,7,,89에 대 한 가능한 전략 이다. NK 세포 기반 암 immunotherapy 최근 단단한 종양을 위한 치료 선택권으로 제안 되었다 하지만 면역 억제 cytokines의 분 비와 고체 종양 의 microenvironment에 ligands 활성화 downregulation 존재 하는 과제 10,11. 변형 시키는 성장 인자-β (TGF-β) 발암에 진압 역할을 제안 하고있다 하지만 역설적으로 암 세포는 또한 TGF-β1 종양 개발12,,1314 를 지원 하기 위해 생산 , 15. 인터페론 응답 다운 규제 및 CD16-중재 인터페론-감마 (IFN-γ) 생산 체 외에서16,17를 통해 NK 세포의 cytolytic 활동을 억제 수 있습니다 TGF-β 신호 18.
TGF-β 신호 종양 microenvironment에의 중단 될 수 있지만 암 제거 가능한 방법, 완전히 TGF-β 신호를 차단 하면 항 염증 기능을 인해 자가 면역 질환의 개발에 의해 입증 부작용 등 조직의 염증, 심장 결함, 그리고 마우스에 면역19모델. 따라서, TGF-β-중재 면역 억제의 작동 메커니즘을 이해 이어질 것입니다 암 치료에 대 한 접근 치료 대상의 식별.
NK 세포 개발에 필요한 분자 이벤트 명료 하 윌리엄스 외 20세포 NK로 murine 골 수 조 혈 줄기 세포 분화에 대 한 생체 외에서 시스템 설립. 이 시스템은 크게 NK 세포21의 소설 창시자의 식별을 포함 하 여 NK 세포 개발의 기계 론 적인 연구를 촉진 한다. 그러나, 골 수 창시자로 피더 레이어20,21, OP9 stromal 세포를 지 원하는 시스템에서 경작 한다 그리고이 다른 유형의 세포 인구는 주로 유전자 방해의 추가 응용 프로그램 제한 도구 (예를 들어, 중재 하는 siRNA 유전자 침묵) 차별화 NK 세포에 구체적으로 적용.
여기, 우리 더 윌리엄스 외20의 생체 외에서 시스템을 수정 하 여 개발 된 피더 무료 시스템을 설명 합니다. 우리의 시스템에 OP9 stromal 피더 세포는 필요 하 고 대신 조건부 매체 최근 NK 세포에 생체 외에서그리고이의 차별화를 영향을 주지 않고 사용 OP9 TGF-β는 암 진행을 통해 홍보할 수 밝히기 위해서 우리를 끌 종양 microenvironment22에 E4bp4 종속 NK 세포 개발 억제 이 새로운 시스템 성공적으로 elucidating 특정 조건 하에서 NK 세포 개발의 분자 메커니즘에 대 한 배경 없는 메서드를 제공 합니다 (예를 들어, 높은 TGF-β1, 중재 하는 siRNA 유전자 침묵, 등.) 생체 외에서.

<table><tbody><tr><td>OP9 세포주</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CRL-2749&trade; </td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, 뉴클레오시드 없음</td><td>Gibco</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-7</td><td>PEPROTECH</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 Flt3-Ligand</td><td>PEPROTECH</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>재조합 뮤린 IL-2</td><td>PEPROTECH</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX 트랜스펙션 시약</td><td>Invitrogen</td><td>1377815</td><td></td></tr><tr><td>IC 고정 버퍼&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-8222-49</td><td></td></tr><tr><td>플로우 사이토메트리 염색 완충액&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>PE-conjugated anti-mouse CD244</td><td>eBioscience</td><td>12-2441-83</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-conjugated anti-mouse NKp46</td><td>Bioss</td><td>bs-2417R-cy3</td><td></td></tr><tr><td>Nonsense control (NC)</td><td>Ribobio</td><td>siN05815122147</td><td></td></tr><tr><td>siRNA against mouse E4BP4 mRNA</td><td>Ribobio</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& 프라임;</td></tr></tbody></table>

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 murine 자연 킬러 세포의

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

자연적인 살인자 (NK) 세포는 타고 난 면역 계통에 속해 있으며 첫 번째 라인 항 암 면역 방어; 그러나, 그들은 종양 microenvironment에서 억제 되 고 기본 메커니즘은 아직 크게 알려진. NK 세포의 일관 되 고 신뢰할 수 있는 소스의 부족 NK 세포 면역의 연구 진행을 제한합니다. 여기, 우리가 시험관에서 시스템 높은 품질과 급지대 무료 조건 murine NK 세포 골 수 유래의 수량을 제공할 수 있는 보고 합니다. 더 중요 한 것은, 우리는 또한 그 중재 하는 siRNA 유전자 침묵이 시스템을 사용 하 여 E4bp4 종속 NK 세포 성숙 억제 성공적으로 보여 줍니다. 따라서,이 소설 체 외에서 NK 세포 분화 시스템 면역 연구를 위한 소재 솔루션입니다.

대표 결과 설명된 프로토콜에 따라 얻을 수 있습니다. 총 골 현 탁 액 셀 피더 무료 차별화 시스템에서 11 일; 재배 했다 확산 속도에 상당한 증가 하루 7 일 0 (그림 1A)에 총 셀 개수와 비교 하 여 관찰 되었다. 높은 세포질에 핵 비율 및과 립 풍부한 세포질 형태학 NK 세포로 성숙 시스템 (그림 1B)에서 6 일에 의해 발견 됐다.
TGF-β1/Smad3 신호 NK 세포 분화, 세포 E4bp4 mRNA (siE4bp4, 그림 2와 같이 E4bp4 mRNA 레벨을 효과적으로 억제) 또는 말도 안 되는 siRNA와 페 했다 골 수에서에서...

여기, 선물이 murine NK 세포 유전자 침묵 시키기 기계 연구 생체 외 및 생체 내에서피더 무료 차별화 시스템을 사용 하 여 대량 생산 하는 프로토콜.

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

이 새로운 feeder-free 시스템의 전반적인 목표는 in vitro 및 in vivo 분석을 위한 고순도 천연 살해 세포를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 자연살해세포 발달 및 암 면역을 포함한 선천면역학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이 새로운 feeder-free 시스템이 생산된 자연 살해 세포의 순도를 크게 증가시킬 수 있다는 것입니다.이는 다음과 같은 in vitro 및 in vivo 분석을 크게 촉진합니다. 이 기술의 적응증은 자연 살해 면역으로 확장되는데, 이는 개인 면역 요법을 위한 분석 및 변형을 위해 암 환자의 골수에서 쥐 자연 살해 세포를 대량 생산할 수 있기 때문입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 소비된 배지를 부하 상 성장을 겪고 있는 OP9 셀에서 수집해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.골수 지시 단계는 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 얼굴 시연은 매우 중요한데, 뼈는 생존력을 보존하기 위해 최적의 시간으로 에탄올로 무균 상태가 되어야 하기 때문입니다. 이 절차를 시작하려면 배양 플라스크에서 OP9 세포를 수집합니다. FBS를 추가하여 트립신 분해를 중지합니다.OP9 세포를 채취하고 중력의 465배에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 셀 펠릿을 다시 현탁하십시오. 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.그런 다음 75cm 정사각형 배양 플라스크에 15ml의 알파-멤 배지에 10-6개의 세포를 2회 파종하고 48시간 동안 배양합니다. 세포가 80% 융합되면 10mm의 인산염 완충 식염수로 세포를 세척하고 항생제와 소 태아 혈청이 없는 20ml의 일반 알파-멤 배지를 세포에 첨가합니다. 24시간 동안 배양합니다.다음 날, 필터로 세포 파편을 제거하여 OP9 컨디셔닝 배지를 수집하고 섭씨 4도에서 보존합니다. 12주 된 쥐를 안락사시키기 위해 펜토바르비톤 복강내 100mg을 과다 투여합니다. 호흡 곤란을 확인한 후 수술용 칼로 대퇴골을 절제합니다.칼날로 부드럽게 긁어 남아있는 근육을 제거하십시오. 냉장된 멸균 알파-멤 배지로 채워진 50ml 원심분리기 튜브에 뼈를 옮기고 생물 안전 캐비닛에 보관합니다. 그런 다음 알파 - 멤 배지를 배출하고 30 초 동안 70 % 에탄올로 뼈를 씻습니다.다시 말하지만, 얼음처럼 차가운 멸균 인산염 완충 식염수로 뼈를 두 번 씻어 남아 있는 에탄올을 제거합니다. 씻은 후,

a-novel-feeder-free-system-for-mass-production-murine-natural-killer

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기 우리는 효율적으로 확장하고 정화 인간 NK 세포의 큰 숫자를하고 기능을 평가하는 방법을 설명합니다.

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

이 비디오는 피더 세포주를 사용하여 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 직접 자연살해(NK) 세포를 증식하는 기술을 보여줍니다. PBMC는 막결합 인터루킨-21(mIL-21)을 발현하는 유전자 변형 림프모세포 공급세포와 공동 배양되며, 배양액에는 사이토카인 인터루킨-2(IL-2) 및 인터루킨-15(IL-15)가 보충됩니다. 이 리간드의 칵테일은 함께 고순도의 NK 세포의 장기간 증식으로 이어집니다.

말초 혈액 단핵 세포에서 자연 살해 세포의 생체 외 확장

이 프로토콜의 개발, 확대, hESCs에와 유도 만능에서 파생 된 NK 세포의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

이 연구에서는 Flt3 리간드가 있는 상태에서 AC-6 공급세포와 공통 림프구 전구세포를 공동 배양하여 pDC를 효율적으로 생성할 수 있는 체외 배양 시스템을 제시합니다.

AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

여기에서는 쥐의 비장에서 많은 수의 쥐 불변 자연 살해 T 세포를 생성하는 데 사용할 수 있는 적응된 프로토콜을 제시합니다. 의정서는 비장 iNKT 세포가 한정된 수의 동물 및 시약을 사용하여 시험관 내에서를 위해 풍성하게 하고, 고립되고 확장될 수 있는 접근 방식을 개략적으로 설명합니다.

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

우리는 마우스 비장에서 불변 자연 킬러 T (iNKT) 세포를 풍부하게하고 체외 및 생체 내 연구에 적합한 숫자로 시험관 내에서 확장하기 위해 신속하고 강력한 프로토콜을 설명합니다.

체외 및 생체 내 연구를 위한 마우스 불변 천연 킬러 T 세포의 정화 및 확장

여기에서는 말초혈액자연살해(PBNK), 간 조직으로부터 NK세포, 말초혈액단핵세포(PBMC) 또는 제대혈(CB)에서 유래한 키메라 항원 수용체(CAR)-NK세포를 확장시키는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 확장된 NK 세포의 최적화된 순도 외에도 221-mIL-21 영양세포를 사용하는 NK 및 CAR-NK 세포의 확장을 보여줍니다.

멤브레인 결합-IL-21-변형 B 세포주를 이용한 자연살해(NK) 및 CAR-NK 세포 확장 방법

본 프로토콜은 3D 및 2D 배양 조건 모두에서 인간 확장 전위 줄기 세포 (hEPSC)로부터 경미한 세포 독성을 갖는 CD3- / CD45 + CD56 + 세포를 구별하는 방법을 보여줍니다. 이를 통해 복잡한 미세 환경을 파괴하지 않고 일상적인 표현형 검증이 가능합니다.

인간 확장 잠재적 줄기 세포로부터 자연 살해 세포 생성

자연살해세포유래 세포외 소포체(NK-EV)는 암 바이오치료제로서 유망한 잠재력을 가지고 있습니다. 이 방법론 기반 연구는 대량의 고순도 NK-EV를 지속적으로 생산하고 분리하도록 설계된 확장 가능한 폐쇄 루프 바이오제조 워크플로를 제시합니다. 공정 중 제어 테스트는 바이오 제조 워크플로 전반에 걸쳐 수행되어 EV가 제품 출시를 위한 품질 표준을 충족하는지 확인합니다.

자연 살해 세포 유래 세포외 소포체 기반 암 바이오치료제를 생산 및 분리하기 위한 확장 가능한 바이오제조 워크플로우

이 프로토콜은 기체 투과성 급속 증식(G-Rex) 장치를 사용하여 채택 세포 치료(ACT) 제품인 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포와 사이토카인 유도 킬러(CIK) 세포의 확장 가능성을 설명하며, 임상적으로 중요한 환경에서 효율적이고 견고한 성장을 입증합니다.

GMP 확장 가능한 장치에서 CAR-T 및 사이토카인 유도 킬러 세포의 효율적이고 빠른 생성

배우세요 무급지대 시스템을 이용한 murine NK 세포 대량 생산 방법을. 이 기술은 고순도 NK 세포를 생산하여 선천면역 및 암면역 연구에 활용할 수 있습니다.

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

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