소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

이 새로운 feeder-free 시스템의 전반적인 목표는 in vitro 및 in vivo 분석을 위한 고순도 천연 살해 세포를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 자연살해세포 발달 및 암 면역을 포함한 선천면역학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이 새로운 feeder-free 시스템이 생산된 자연 살해 세포의 순도를 크게 증가시킬 수 있다는 것입니다.

이는 다음과 같은 in vitro 및 in vivo 분석을 크게 촉진합니다. 이 기술의 적응증은 자연 살해 면역으로 확장되는데, 이는 개인 면역 요법을 위한 분석 및 변형을 위해 암 환자의 골수에서 쥐 자연 살해 세포를 대량 생산할 수 있기 때문입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 소비된 배지를 부하 상 성장을 겪고 있는 OP9 셀에서 수집해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

골수 지시 단계는 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 얼굴 시연은 매우 중요한데, 뼈는 생존력을 보존하기 위해 최적의 시간으로 에탄올로 무균 상태가 되어야 하기 때문입니다. 이 절차를 시작하려면 배양 플라스크에서 OP9 세포를 수집합니다. FBS를 추가하여 트립신 분해를 중지합니다.

OP9 세포를 채취하고 중력의 465배에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 셀 펠릿을 다시 현탁하십시오. 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.

그런 다음 75cm 정사각형 배양 플라스크에 15ml의 알파-멤 배지에 10-6개의 세포를 2회 파종하고 48시간 동안 배양합니다. 세포가 80% 융합되면 10mm의 인산염 완충 식염수로 세포를 세척하고 항생제와 소 태아 혈청이 없는 20ml의 일반 알파-멤 배지를 세포에 첨가합니다. 24시간 동안 배양합니다.

다음 날, 필터로 세포 파편을 제거하여 OP9 컨디셔닝 배지를 수집하고 섭씨 4도에서 보존합니다. 12주 된 쥐를 안락사시키기 위해 펜토바르비톤 복강내 100mg을 과다 투여합니다. 호흡 곤란을 확인한 후 수술용 칼로 대퇴골을 절제합니다.

칼날로 부드럽게 긁어 남아있는 근육을 제거하십시오. 냉장된 멸균 알파-멤 배지로 채워진 50ml 원심분리기 튜브에 뼈를 옮기고 생물 안전 캐비닛에 보관합니다. 그런 다음 알파 - 멤 배지를 배출하고 30 초 동안 70 % 에탄올로 뼈를 씻습니다.

다시 말하지만, 얼음처럼 차가운 멸균 인산염 완충 식염수로 뼈를 두 번 씻어 남아 있는 에탄올을 제거합니다. 씻은 후, 뼈를 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수 5ml가 들어 있는 절구에 옮기고 유봉으로 뼈를 조각화합니다. 유봉을 부드럽게 휘저어 골수 세포를 인산염 완충 식염수로 방출합니다.

골수 세포를 포함하는 인산염 완충 식염수를 새로운 50ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 중력의 465배로 튜브를 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 버리십시오.

최대 수확량을 얻기 위해 뼈가 하얗게 변할 때까지 추출합니다. 그런 다음 18ml의 멸균 증류수로 펠릿을 다시 현탁시키고 적혈구를 제거할 때까지 30초 동안 기다립니다. 그런 다음 10X 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수 2ml를 첨가하여 반응을 멈춥니다.

70마이크로미터 세포 여과기를 사용하여 용해된 적혈구를 제거합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 중력의 465배로 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수 20ml에 다시 현탁시킵니다.

세포를 한 번 더 원심분리하십시오. 다음으로, 10ml의 OP9 조건부 배지가 포함된 100ml 멸균 페트리 접시에 세포 펠릿을 옮기고 추가 시약을 보충합니다. 페트리 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5% 이산화탄소와 함께 2시간 동안 옮깁니다.

OP9 조건부 배지를 함유한 새로운 배양 접시에 부착되지 않은 모든 세포와 씨앗을 제거하고 섭씨 37도의 인큐베이터에 5분 동안 넣습니다. 제 4 일에서는, 20%fetal 둔감한 혈청 및 2로 보충된 OP9 조건부 매체로 배양 매체를 대체하십시오, 쥐 interleukin 2의 밀리리터 당 000 단위. 성숙한 자연 살해 세포를 얻기 위해 7일째까지 3일마다 배양 배지를 계속 교체하십시오.

제품 설명서에 따라 배지 변경 후 0일째, 4일째 및 7일째에 실험 종말점까지 작은 간섭 RNA 또는 nonsense control을 transfection 시약과 사전 혼합합니다. 중간 다과 동안 부착되지 않은 세포에 50 나노 몰의 작은 간섭 RNA 또는 넌센스 혼합물을 추가합니다. 적절한 시점에 분화 세포를 수집합니다.

중력의 465배에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수로 세척합니다. 고정된 세포를 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수로 세척한 후 SY3 접합 항체를 포함하는 100마이크로리터의 유세포 분석 염색 완충액에 세포를 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 팩스 분석을 위해 300마이크로리터의 인산염 완충 식염수에 샘플을 다시 현탁시킵니다. feeder-free 시스템에서 자연살해세포로 분화되는 골수 세포의 증식 속도를 보여주는 대표적인 성장 곡선. 그래프는 7일째까지 세포의 증식 속도가 크게 증가했음을 보여줍니다.

새로운 feeder-free 시스템에서 분화된 자연 살해 세포를 보여주는 대표적인 명시야 이미지. 성숙한 자연살해세포(natural killer cell)는 과립형 세포질 형태학(granular cytoplasmic morphology)을 가진 높은 핵 대 세포질 비율을 나타냈다. 6일째에 자연살해세포로 분화되는 골수 세포에 대한 작은 간섭 RNA의 효과를 보여주는 대표적인 막대 플롯.

이 그래프는 대조군에 비해 E4bp4 mRNA 수치와 작은 간섭 RNA 처리 자연 살해 세포가 크게 감소했음을 보여줍니다. TGF beta-1 Smad3 의존적 방식으로 골수 유래 자연 살해 세포의 분화에 대한 침묵된 E4bp4의 효과를 입증하는 대표적인 유세포 분석 데이터. 데이터에 따르면 E4bp4 mRNA의 녹다운은 넌센스 대조군에 비해 6일째에 성숙한 자연살해세포 생산이 크게 감소합니다.

자연 살해 세포의 작은 간섭 RNA 매개 생산 감소는 작은 간섭 RNA 형질 주입 그룹과 비교하여 하나의 마이크로몰 SIS3 Smad3 억제제로 TGF beta-1 Smad3를 억제함으로써 구출되는 것으로 나타났습니다. 일단 숙달되면 이 연구를 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 유전자 잠금 및 과발현과 같은 유전자 변형을 수행하여 자연 살해 세포 활성에 대한 조절 메커니즘 및 발달과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

첫 번째는 제가 이 방법에 대한 아이디어를 떠올린 것은 이전 시스템에서 자연살해세포를 확장했을 때였습니다. 태아 세포의 존재는 관심 유전자에 대한 siRNA의 부하와 효율을 감소시켰습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이 국소 시스템에서 체외에서 대량의 고품질 자연 살해 세포를 생산하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

RNA 추출 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.