마우스 Hindbrain 배아 신생 공부에 대 한 모델

이 절차의 전반적인 목표는 발달 중에 쥐 배아 후뇌의 전체 장기 및 조직학적 분석을 허용하는 것입니다. 이 방법은 포유류 모델 유기체의 뒷뇌에서 신경 발생에 대한 발달을 연구할 수 있게 해줍니다. 발달 중인 생쥐 hindbrain은 전체 장기에 걸쳐 신경 발생 패턴을 관찰할 수 있는 평평한 구조로 인해 신경 전개 활동을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다.

필요한 임신 단계에서 윤리적으로 승인된 절차를 사용하여 시간이 지정된 임신 암컷 마우스를 안락사시키는 것으로 이 절차를 시작합니다. 날카로운 가위를 사용하여 복막강을 잘라내고 조심스럽게 자궁을 절제합니다. 배아가 들어 있는 절제된 자궁을 20밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 60mm 플라스틱 접시에 넣습니다.

해부 현미경을 사용하여 모든 추가 해부를 수행합니다. 워치메이커 5번 집게를 사용하여 자궁 근육 벽을 찢어 배아를 노출시킵니다. 탯줄을 절단하여 각 배아를 방출하고 난황낭을 제거합니다.

얼음처럼 차가운 PBS가 있는 깨끗한 플라스틱 접시에 각 배아를 옮긴 후 워치메이커 집게 55번을 사용하여 머리를 절단합니다. 선택적으로, 게놈 DNA 분리 및 후속 유전형 분석을 위해 작은 조직 조각을 유지합니다. 워치메이커 집게 55번을 사용하여 후뇌 신경 상피와 평행하고 바로 아래에 있는 뒷뇌를 포함하는 조직을 절제하여 안면 및 전뇌 조직과 분리합니다.

뒷뇌와 꼬리 머리 조직을 등쪽이 위로 향하게 배치하고 지붕 판으로 알려진 얇은 조직층으로 덮인 네 번째 뇌실을 식별합니다. 워치메이커 집게 55번을 사용하여 지붕 플레이트를 조심스럽게 뚫고 집게로 여분의 조직을 벗겨내고, 중뇌의 정중선을 따라 배측으로 이동한 다음 후뇌와 척수를 꼬리로 움직입니다. 뒷뇌는 이제 펼쳐진 책 준비에 노출되어야 합니다.

전체 산 면역 라벨링을 위해 뒷뇌를 준비하려면 Watchmaker 겸자 번호 55를 사용하여 중간엽의 나머지 머리와 뒷뇌의 껍질 쪽에 부착된 수막을 조심스럽게 떼어냅니다. 중뇌와 척수 조직을 제거하고 뒷뇌 조직만 남깁니다. 비브라톰 및 냉동 절편을 위해 뒷뇌를 준비하려면 Watchmaker 겸자 번호 55를 사용하여 중뇌와 척수 조직을 제거합니다.

파스퇴르 피펫을 사용하여 플라스틱 접시의 뒷뇌를 둥근 바닥의 2밀리리터 튜브로 옮깁니다. 모든 PBS를 흡인 한 후, PBS에 용해 된 부피 포름 알데히드 당 4 % 무게의 갓 해동 한 부드러운 교반으로 섭씨 4도에서 2 시간 동안 뒷뇌를 고정합니다. 마지막으로 PBS로 뒷뇌를 세 번 헹굽니다.

필요한 경우, 각 농도에서 5분 동안 실온에서 PBS의 메탄올에 대한 망상을 연속적으로 감소시키는 후뇌를 재수화합니다. 그런 다음 뒷뇌로 PBS로 옮깁니다. PBT를 함유한 PBS에서 섭씨 4도에서 30분 동안 뒷뇌를 부드럽게 교반하여

그런 다음 10%의 열 비활성화 염소 혈청을 함유한 PBT에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 뒷뇌를 배양합니다. 다음으로, 1%의 열 불활성화 혈청과 1차 항체를 함유한 PBT에서 이전과 같이 뒷뇌를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 섭씨 4도에서 PBT로 1시간씩 뒷뇌를 씻습니다.

세척 후, 사용된 1차 항체를 표적으로 하는 적절한 형광단 접합 2차 항체가 포함된 PBT에서 섭씨 4도의 뒷뇌를 밤새 배양합니다. 이 시점부터 뒷뇌를 어둠 속에 두어 형광단이 광표백되는 것을 방지하십시오. PBT로 이전과 같이 세척한 후 항체 결합의 장기 보존을 위해 PBS의 4% 포름알데히드에 뒷뇌를 15분 동안 실온에서 수정하십시오.

한편, 유리 현미경 슬라이드를 두 겹의 검은색 전기 테이프로 덮고 겹겹이 쌓인 테이프에서 작은 사각형을 잘라내어 뒷뇌를 담을 수 있을 만큼 큰 주머니를 만듭니다. PBS에서 뒷뇌를 두 번 간단히 헹군 후 파스퇴르 피펫으로 주머니에 옮깁니다. 여분의 액체를 제거하고 주머니에 적절한 퇴색 방지 시약을 추가합니다.

그런 다음 커버 슬립 아래에 기포가 갇히지 않도록 유리 커버 슬립으로 뒷뇌를 천천히 덮습니다. 커버슬립을 밀봉하고 매니큐어를 얇게 펴 슬라이드에 부착합니다. 이미지를 획득할 때까지 슬라이드를 섭씨 4도의 어둠 속에서 보관하십시오.

증류수에서 준비된 부피당 3%중량으로 용융된 아가로스에 뒷뇌를 내장합니다. 절단은 진동을 사용하여 뒷뇌 절편을 70미크론 두께로 전달합니다. 붓으로 갓 자른 각 부분을 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 24웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다.

텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 부동 섹션에 레이블을 지정한 후 PBS에서 잠시 세척합니다. 붓을 사용하여 떠 있는 부분을 유리 현미경 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다. 압지나 티슈를 사용하여 섹션 주변의 여분의 PBS를 닦아냅니다.

PBS에서 80% 글리세롤을 사용하는 섹션이 아닙니다. 그리고 기포가 갇히지 않도록 유리 커버슬립으로 천천히 덮으십시오. 이미지를 획득할 때까지 슬라이드를 섭씨 4도의 어둠 속에서 보관하십시오.

얼기 전에 뒷뇌를 동결하기 전에 뒷뇌를 보호하기 위해 섭씨 4도의 PBS에서 부피당 30% 무게로 자당을 배양합니다. 뒷두뇌를 광학 절단 온도 화합물 또는 OCT에 담그십시오. 그런 다음 뒷비가 포함된 곰팡이를 드라이 아이스에서 섭씨 40도에서 50도 사이로 냉각된 이소펜탄으로 옮겨 빠르게 얼립니다.

다음으로, 저온 유지 장치를 사용하여 전달 후뇌 절편을 10미크론 두께로 절단합니다. 뒷뇌 절편을 정전기 접착 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 슬라이드를 실온에서 15분 동안 배양하여 슬라이드 섹션을 건조시킵니다.

그런 다음 PBS로 극저온 절편을 세척하여 OCT를 용해합니다. PAP 펜을 사용하여 극저온 절편 주위에 소수성 장벽을 표시합니다. 수성 매체에 적합한 렌즈, 장착된 슬라이드, 면역 라벨링에 사용되는 형광단에 적합한 광학 필터가 장착된 Epi-fluorescent 또는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다.

전체 후뇌 또는 후뇌 단면을 이미지화하려면 렌즈를 사용하여 10배 확대합니다. 정량화를 위해 후뇌 영역을 시각화하려면 40배 배율을 사용합니다. 그리고 개별 세포를 시각화하려면 63배 배율의 렌즈를 사용하십시오.

여기에 표시된 것은 심실 영역에서 분열하는 신경 전구 세포를 관찰하기 위해 wholemount immuno labeled hindbrains의 대표적인 결과입니다. 이러한 이미지는 연속적인 발달 단계에서 유사분열 마커 phospho histone H3를 사용하여 얻었습니다. EdU의 1시간 펄스 후에 횡방향 진동 절편을 라벨링하여 심실 표면에서 유사분열 인산-히스톤 H3 양성 세포뿐만 아니라 inter-kinetic 핵 이동을 겪고 있는 hindbrain 신경 전구 세포를 강조했습니다.

자가 재생 신경 전구 세포의 전체 비율은 BrdU 투여 하루 후 배아의 횡방향 후뇌 냉동 절편에서 빨간색과 노란색의 모든 BrdU 양성 세포 중 노란색의 Ki67 BrdU 이중 양성 세포의 비율을 계산하여 결정할 수 있습니다. Hindbrain vibratome 절편은 RC-2라고도 하는 중간 필라멘트 단백질 Nespin에 대한 항체로 면역 라벨링되어 신경 전구 세포, 말단 부위 및 돌출부를 시각화할 수도 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 편평한 산 제제 또는 뒷뇌의 횡조직 절편을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

한 번 숙달하면 1시간 이내에 최대 10개의 뒷뇌를 해부할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 먼저 후뇌 미세 박리에 익숙해지는 경우 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하는 것이 중요한데, 이는 조직 보존을 보장하는 것 외에도 수막에서 분리를 용이하게 하기 때문입니다. 이 절차에 따라 후뇌의 단일 세포 현탁액에 대해 유세포 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 신경 전구 세포를 다른 세포 유형과 분리할 수 있습니다.

이 기술의 확립은 발달 신경생물학 분야의 연구자들이 전통적으로 사용된 척수 및 전뇌 모델의 대안으로 뒷뇌를 사용하여 포유류 신경 발생의 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 방법은 포유류의 뒷뇌 신경 발생에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 종 간의 구조적 및 분자적 유사성의 정도를 감안할 때 다른 발달 중인 척추 동물에도 적용할 수 있습니다. 이 기술은 신경 발생을 제어하는 새로운 메커니즘을 발견하는 데 도움이 될 수 있으며 축의 다른 곳에서 확인된 메커니즘이 척추동물 뇌의 이 부분에서 다시 요약되는지 여부를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.