Name: 마우스 Hindbrain 배아 신생 공부에 대 한 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 배우세요 마우스 배아 후뇌를 이용한 신경발생 연구 방법으로, 전 장기 및 조직 분석을 통해 포유류 신경발달 메커니즘을 탐구합니다. 이 기법은 발달 신경생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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우리는 마우스 축산에 대 한 안과의 UCL 학회에 생물 자원 단위의 직원과 타임된 matings 수행에 대 한 Vasiliki Chantzara 감사 합니다. 이 연구는 Wellcome 신뢰 조사 상 095623/Z/11/Z CR에 의해 지원 되었다.

모든 동물 작품 영국 홈 오피스 및 로컬 윤리 지침에 따라 수행 되었다.
1입니다. 단계와 타이밍의 요약
<ol><li>배아 일 (전자) 9.5 e13.5 임신;를 조사 생물학 질문에 대답 하는 적합 한 스트레인에서 성인 쥐의 초과 matings를 수행 12-15 일이 필요합니다.</li>
	<li>선택적으로, 준비 5-브로 모-2'-deoxyuridine (BrdU) / deoxyuridine (듀)-5-ethynyl-2' 솔루션 수행 주입 (프로토콜 섹션 2); 필요 합니다 ~ 전날 또는 듀/BrdU 라벨의 원하는 길이 따라 배아 격리의 하루에 1 시간.</li>
	<li>수행 하는 고립과 hindbrain 절 개 태아 (프로토콜 섹션 3); 필요 합니다 ~ 10 분/태아.</li>
	<li>수행 하는 wholemount 면역 형광 라벨 (프로토콜 섹션 4); 3 일이 필요합니다.</li>
	<li>부동 섹션 면역 형광 라벨 (프로토콜 섹션 4)을 수행 하는 vibratome를 사용 하 여 섹션: 2 일 필요 합니다.</li>
	<li>cryostat를 사용 하 여 섹션과 면역 형광 라벨 cryosections (프로토콜 섹션 5);의 수행 2 일 필요합니다.</li>
</ol>2. 주입 임신 여성 마우스 BrdU 또는 듀 (선택 사항)
<ol><li>분해 BrdU 또는 듀 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS) 10 mg/mL 및 1 mg/mL의 농도에서 각각. 주의: BrdU와 듀는 독성; 적절 한 보호를 착용 하십시오.</li>
	<li>임신 마우스 무게와 계산 BrdU 또는 듀 솔루션 BrdU 100 mg/kg를 도달 하는 관리 되는 볼륨 또는 5 mg/kg에 듀.</li>
	<li>라벨의 필요한 길이 따라 배아를 수집 하기 전에 어느 1 h 또는 1 일 복 경로 통해 BrdU 또는 듀 솔루션을 주입. 참고: S-단계에서 hindbrain 셀 시각화 1 h에 대 한 라벨. 1 일 라벨 시각화 hindbrain NPCs의 자손.</li>
</ol>3. Hindbrains e9.5-e13.5 마우스 배아에서에서의 해 부
<ol><li>(예를 들면, 자 궁 경부 전위) 필요한 임신 단계에서 윤리적으로 승인 된 절차를 사용 하 여 타임-임신 여성 마우스 안락사 날카로운가 위를 사용 하 여 복 막 구멍을 자르면 고 신중 하 게 자 궁을 삭제할. 20 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 하는 60 m m 플라스틱 접시에 배아를 포함 하는 삭제 자 궁을 놓습니다. 참고: 무 균 기술을 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>모든 추가 절 개 해 현미경을 사용 하 여 수행 합니다. Using 시계 집게 번호 5, 배아를 노출, 각 배아 탯 severing 하 여 놓고 노른자위 낭 제거 자 궁 근육 벽 눈물.</li>
	<li>넓은 구멍 열기와 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 깨끗 한 플라스틱 접시에 각 배아를 전송 합니다.</li>
	<li>Using 시계 집게 번호 55, 머리 (그림 1E) 서버.</li>
	<li>필요에 따라 조직 (예를 들어, 노 른 자 삭 또는 약 2mm 꼬리 끝의 ¼) 게놈 DNA 분리 및 후속 유전형의 작은 조각을 유지 합니다.</li>
	<li>Using 시계 집게 번호 55, 삭제할 hindbrain 병렬 하 고 즉시 얼굴 및 개 조직 (그림 1 층)에서 분리 hindbrain neuroepithelium 아래를 포함 하는 조직.</li>
	<li>위치는 hindbrain 및 꼬리 머리 조직 등 쪽 고 얇은 조직 층 (지붕 격판덮개)에 의해 덮여 있는 4번째 심 실 식별. 조심 스럽게 시계 집게 번호 55 (그림 1G)을 사용 하 여 지붕 판 피어스와 집게, rostrally는 중간 선 따라 midbrain, 위로 이동 함께 멀리 초과 조직 껍질 그리고 caudally 후부 hindbrain 척수 (그림 1G 이상 ); hindbrain 이제 오픈 책 준비 (그림 1 H)에 노출 되어야 합니다.</li>
	<li>Hindbrains wholemount immunolabeling (옵션 1)에 대 한 준비.<ol>
<li>Using 시계 집게 번호 55, 신중 하 게 나무 랄 수 멀리 나머지 머리 mesenchyme 및 hindbrain 집게 (그림 1I)를 사용 하 여의 pial 측에 연결 된 모든 meninges. Hindbrain 조직 (그림 1 K)만 두고 midbrain 및 척수 조직 (그림 1J)를 제거 합니다. 참고:이 절차의이 단계 하지 따라야 한다 e9.5 또는 e10.5, 시도 hindbrain neuroepithelium; 손상 가능성이 것 때문에 또한, meninges 제거 되지 않습니다 필수 hindbrain neuroepithelium immunolabeling에 대 한 항 체의 효율적인 침투 수 있도록이 단계에서 충분히 얇은 이기 때문에. 그러나이 단계,, 한다 meningeal 조직 통합, hindbrain neuroepithelium에 항 체 침투를 향상 시킬 때 이후, e11.5에서 따라야. 해 부는 얼음 처럼 차가운 PBS (각 hindbrain에 대 한 사용 깨끗 한 PBS)에서 수행 될 때 가장 쉬운.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hindbrains vibratome 및 cryosectioning (옵션 2)에 대 한 준비<ol>
<li>시계 겸 번호 55를 사용 하면, 제거할 midbrain 및 척수 조직 (그림 1J). 참고: 아니에요 mesenchyme 및 meninges 단면 ( 그림 1I에서 같이)를 위한 hindbrains의 제거 하는 데 필요한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플라스틱 접시에서 둥근 바닥 2 mL 튜브 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 hindbrains를 전송 하 고 모든 PBS, 발음 갓 해 동된 4 %w / v 포 름 알 데히드 PBS에 녹아 있는 부드러운 동요와 4 ° C에서 2 시간에 대 한 수정. 주의: 포름알데히드는 독성이; 적절 한 보호를 착용 하십시오.</li>
	<li>Hindbrains 3 배 시간 PBS와 린스. Immunolabeling 2-3 일 이내에 시작 됩니다 또는-20° C에 저장을 위해 100% 메탄올을 전송 하기 전에 5 분 동안 50% methanol/50% PBS와 PBS를 대체 하는 경우 PBS에 4 ° C에서 저장
</li>
</ol>4. Wholemount 면역 형광 검사
<ol><li>필요한 경우, 순차적으로 감소 하는 5 분 동안 실 온 (RT)에서 (예를 들어, 75% 메탄올, 50% 메탄올, 25% 메탄올) PBS에 메탄올의 희석에 hindbrains를 rehydrate 하 고 PBS에 전송. 참고: 메탄올의 등급된 시리즈는 부드럽게 hindbrains를 rehydrate 하 고 적절 한 조직 보존을 보장 합니다.</li>
	<li>0.1%를 포함 하는 PBS에 4 ° C에서 30 분 동안 hindbrains를 permeabilize Triton X-100 (PBT) 부드러운 동요와 함께.</li>
	<li>PBT 포함 된 부드러운 동요와 함께 10% 열 비활성화 염소 혈 청에서에서 4 ° C에서 1 시간에 대 한 hindbrains를 품 어. 참고: 2 차 항 체에 제기 했다 호스트 종에서 혈 청을 사용 합니다. 염소에 1 차 항 체 혈 청 무료에서 품 어 대 한 단백질 차단, 예를 들어 5% 소 혈 청 알 부 민 PBS 또는 적당 한 상업적인 대안에 ( 재료의 표참조). 이 일반적인 염소에서 1 차 항 체를 사용 하는 경우 자주 관찰 얼룩을 줄일 것입니다.</li>
	<li>Hindbrains 1% 열 비활성화 세럼과 부드러운 동요와 1 차 항 체를 포함 하는 PBT에서 4 ° C에서 하룻밤을 품 어 (예를 들어, 토끼 안티 인 히스톤 H3 [pHH3] 희석 1:400). 참고: 염소에서 기본 항 체, 혈 청 하지 않고 PBT를 사용 합니다.</li>
	<li>4 ° c 5는 hindbrains를 씻어 1 h PBT와 배.</li>
	<li>PBT 적절 한 fluorophore 활용 된 이차 항 체 (예를 들면, 염소 안티 토끼 알 렉 사 Fluor 488) PBT 사용 기본 항 체에 대 한 대상에서 1: 200에서 포함에 4 ° C에서 하룻밤 hindbrains를 품 어. Photobleaching에서 fluorophores를 보호 하기 위해 여기 hindbrains 어둠 속에서 계속. 참고: 염소에서 1 차 항 체에 대 한 일반적인 얼룩을 줄이기 위해 2 차 항 체의 항 염소 Fab 조각을 사용 합니다.</li>
	<li>4 ° c 5는 hindbrains를 씻어 1 h PBT와 배.</li>
	<li>항 체 바인딩의 장기 보존을 위한 RT에서 15 분 동안 4% 포름알데히드 PBS에 있는 hindbrains 접미사 짧게 PBS에 두 번 씻어.</li>
	<li>검은 전기 테이프의 2 개의 층으로 유리 현미경 슬라이드 커버 하 고 작은 사각형 하나의 hindbrain를 충분히 큰 주머니를 만들 계층된 테이프에서 삭제할.</li>
	<li>각 hindbrain 파스퇴르 피 펫으로 주머니에 전송, 과잉 액체를 제거 하 고 추가 적절 한 antifade 시 약 주머니는 coverslip에서 트랩 공기 방울을 피하기 위해 유리 coverslip로 천천히 그것을 취재 하기 전에. coverslip 봉인 하 고 매니큐어의 얇은 층을 가진 슬라이드에 부착. 이미지 수집 (프로토콜 섹션 7)까지 어둠 속에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.</li>
</ol>5입니다. Vibratome 단면 및 부동 섹션 면역 형광 검사
<ol><li>4.1 단계에서 설명한 대로 필요한 경우 메탄올에서 hindbrains rehydrate.</li>
	<li>증류수에 녹은 3 %w / v agarose에 hindbrains를 포함 합니다. 참고: 녹은 agarose hindbrain에 열 손상을 방지 하기 위해 포함 하기 전에 짧게 약 55 ° C에 냉각 허용 합니다.</li>
	<li>vibratome을 사용 하 여 70 µ m의 두께로 가로 hindbrain 섹션을 잘라. 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 하는 24-잘 접시의 한 잘에는 붓으로 갓 커트 각 섹션을 전송 합니다.</li>
	<li>4.2-4.7, 단계에서 설명한 대로 부동 섹션 라벨 하지만 단계를 다음과 같이 수정: 세척 부동 섹션 4 ° C에서 3 x PBT와 15 분 각, 2 h, 2 차 항 체에 대 한 보육 시간을 단축 하 고 실시간에 이차 항 체에 품 어</li>
	<li>필요한 경우, 단계 5.4에서에서 설명 된 대로 다른 epitopes에 대 한 항 체와 라벨, 후 듀+ 핵은 듀 라벨 제조업체의 지침에 따라 장비를 사용 하 여 검색. 어둠 속에서 37 ° C에서 30 분 동안 칵테일 반응에서 부동 섹션을 품 어. 세척 hindbrain 섹션 4 ° C에서 15 분 동안 PBT와 3 배.</li>
	<li>필요한 경우, 단계 5.4에서에서 설명 된 대로 다른 epitopes에 대 한 라벨, 후 감지 BrdU+ 핵 다음과 같습니다.<ol>
<li>어둠 속에서 30 분 동안 37 ° C에서 2 N 염 산에 부동 섹션을 품 어.</li>
		<li>두 번 5 분 동안 각 RT에 염 산을 중화 하는 어둠 속에서 0.1 M 나트륨 붕 산 염 버퍼 pH 8.5에서에서 부동 섹션을 품 어.</li>
		<li>부동 섹션 3 짧게 x PBS에 4 ° c.에 세척</li>
		<li>면역 형광 검사 BrdU 단계 5.4에서에서 설명 된 대로 대 한 라벨을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 µ g/mL 4', counterstain 세포 핵에 PBS에서 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)에 실시간에 2 분 동안 부동 섹션을 품 어.</li>
	<li>실시간에서 15 분 동안 4% 포름알데히드에 부동 섹션 후 위</li>
	<li>PBS에서 짧게 부동 섹션을 씻어. 신중 하 게 유리 현미경 슬라이드는 페인트 브러시를 사용 하 여 부동 섹션 전송. 초과 PBS 압 종이 또는 직물을 사용 하 여 섹션 주위를 청소 하십시오.</li>
	<li>섹션 사용 하 여 PBS에 커버 80% 글리세롤 천천히 유리 coverslip 트랩 공기 방울을 피하기 위해 탑재 합니다. 이미지 수집 (7 단계)까지 어둠 속에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.</li>
</ol>6. cryostat 단면화 및 Cryosection 면역 형광 라벨
<ol><li>4.1 단계에서 설명한 대로 필요한 경우 메탄올에서 hindbrains rehydrate.</li>
	<li>Hindbrains cryoprotect hindbrains 동결 이전에 PBS에서 30 %w / v 자당에서 품 어. 참고: Hindbrains 그들은 일반적으로 ≤ 2 h 하는 관의 바닥에 침 몰 하는 때 동결에 대 한 준비가 e9.5 10.5 hindbrains 및 3-6 h e11.5 13.5 hindbrains.</li>
	<li>잠수함 복합 광학 절삭 온도에 hindbrains (10 월) 및-40 ° C와-50 ° C에서 드라이 아이스 냉각 isopentane를 10 월에 hindbrains를 포함 하는 금형을 전송 하 여 신속 하 게 동결. 참고: 고정 된, 포함 된 hindbrains는-20 ° C 단기 및 장기 단면까지 보기 위해-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>Cryostat 및 전송 정전 접착제 현미경 슬라이드를 사용 하 여 10 µ m의 두께로 가로 hindbrain 섹션을 잘라. 참고: Hindbrain cryosections-20 ° C 단기 및 장기 라벨까지 보기 위해-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>슬라이드 슬라이드 섹션 건조 15 분 RT에서 품 어. PBS 가진 cryosections 세척 디졸브 10 월 및 마크 cryosections PAP 펜을 사용 하 여 주위 소수 성 장벽. 5.4-5.8 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>5.10 글리세롤 대신 폴 리 비닐 알코올 기반 설치 매체를 사용 하 여 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>7. 이미지 수집
<ol><li>Epifluorescent 또는 수성 미디어 탑재 슬라이드 및 광학 필터 fluorophores immunolabeling 사용에 대 한 적합 한 적합 한 렌즈를 장착 하는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 이미지 샘플.</li>
	<li>전체 hindbrain 또는 hindbrain 섹션 이미지를 사용 하 여 렌즈를 10 배 확대 (예를 들어, 그림 2B);에 대 한 정량화에 대 한 hindbrains 영역을 시각화 하려면 40 배율 (예를 들어, 그림 2D) X 개별 셀을 시각화, 63 x 확대 (예를 들어, 그림 2C)와 함께 사용 하는 렌즈를 사용 합니다.</li>
</ol>8. 다른 방법
<ol><li>3.8 단계, cytometry 응용 프로그램15에 대 한 단일 세포 현 탁 액을 생산 하기 위해 고정 되지 않은 hindbrains 균질.</li>
	<li>3.8 단계, 실시간 정량 (예를 들어, 16)에 대 한 단일 셀 정지에서 RNA 추출 하 고정된 hindbrains 균질. 참고: 확인 모든 시 약 및 장비 살 균과 RNase-무료 전체 RNA의 저하를 방지 하기 위해 유지 됩니다.</li>
	<li>3.8 단계, NPCs를 격리 하 여 neurospheres hindbrain NPC 행동17의 분석으로 그들을 생체 외에서 전파 고정된 hindbrains 균질. 주: 모든 시 약 및 장비 neurosphere 문화의 세균/곰 팡이 오염을 방지 하기 위해 살 균 보관 됩니다 확인 하십시오.</li>
</ol>

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<li>Tata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+embryonic+neurogenesis+by+germinal+zone+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).</li>
</ol>

작가의 아무도 경쟁 관심사 또는 상반 되는 관심사를 있다.

이 프로토콜 개발 성체의 메커니즘 연구 모델로 마우스 배아 hindbrain를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 다양 한 다른 immunolabeling 메서드를 사용 하 여, hindbrain NPCs 구상 될 수 있다 그리고 그들의 수 정량 조직 섹션에서 나 기관 wholemounts 전. 절 개 플랫 해부학의 용이성은 hindbrain 기관 전체 성체 패턴에 대 한 정보를 수집 하는 '열린 책' 준비에 몇 군데 될 수 보장 합니다.
우리 더는 NPC 형태학 및 세포 주기 관련 NPC 위치 구상 될 수 있다 쉽게 부동에 표시-또는 cryosections는 hindbrain의. 두 동작 이전 포유류 telencephalon20에서 수행 된 새로운 조상 인구 정의 악용 될 수 있습니다. 예를 들어 초기 형성 Sox2+ neuroepithelia 및 Pax6+ 꼭대기 방사형 명과 hindbrain21,22에 존재 하지만 hindbrain 부족 Tbr2+ 기저 창시자3 .
여기에 설명 된 프로토콜 또한 라이브 이미징 및 혈통 추적 고정된 조직에서의 형광 라벨 특정 NPC 모집단의 동작을 관찰 하는 것 적용할 수 있습니다. 이 얻을 수 있습니다, 예를 들어 마우스 들고 tamoxifen을 유도할 수 있는 Sox1 iCreERT2 transgene와 Rosa26tdTomato 기자23에서 hindbrains를 공부 하 여.
Murine 성체의 지식 강화, 이외는 hindbrain 공부 수 있습니다 명료 종에 걸쳐 공유 되는 광범위 하 게 관련 neurogenic 메커니즘은 hindbrain 더 비슷할 것으로 예상 되는 높은 보존된 뇌 영역 이므로 사이는 개 보다 척 추가 있는 종.
Hindbrain 신생 개 신생23보다 비교적 짧은 시간 창 동안에 일어난다, 그것은 적절 하 게 비교 하기 위한 필요 개최 배아를 고려 하는 것이 중요. 따라서, 실험적인 바이어스 계산 하 고 그 hindbrain 분리 이전 배아에 somite 쌍의 수를 기록 하 여 피 한다. Hindbrain 조직 자체는 연약한과 집게 따라서 처리 해야 신중 하 게 머리 mesenchyme meninges;에서 hindbrain 조직 분리 하는 경우 '연습 실행'의 몇 따라서 귀중 한 배아의 해 부를 시도 하기 전에 권장 수 있습니다. 또한, hindbrains (피 펫의 여 수 수 확대의 끝을 절단 하 여 깨끗 한가 위)의 손상을 방지 하려면 집게 대신 넓은 구멍 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 다른 하나의 튜브에서 메시지를 전송 한다. 마지막으로, 비록 드문, S 상 Npc에 듀/BrdU 정관의 범위 수 있습니다 변수, 특히 짧은 (즉, 1 시간) 펄스 동안. 라벨 개선, 듀/BrdU 주사기에는 솔루션을 로드 하기 전에 제대로 해산 확인 하 고 복 막 구멍에 조심 스럽게 삽입 합니다. 사고, 피하 만든 같은 불 쌍 한 주사 지 나 듀/BrdU 솔루션을 트래핑 하 고 순환에 들어가기에서 방지.

포유류 배아 개발 하는 동안 Npc '성체'를 불리는 과정에서 새로운 신경 세포를 생성 하는 심 실 (VZ)와 확장 neuroepithelium의 subventricular (SVZ) 지역에 분할. 새로운 신경 세포와 그들의 NPC 선구자의 세대는 조사 광범위 하 게1개 더 적은 다른 지역에서이 프로세스에 대 한 알려져 있다 하는 동안.
개는 복잡 하 고 복잡 하 게 접힌 구조는 크게 조직 단면, 후 조직학 방법으로 공부를 시키는 이해 성체 패턴 전체 기관에 걸쳐 도전 이다. 또한, 개 신생의 연구는 반드시 다른 뇌 영역 또는 척수 neurogenic 행동의 예측. 예를 들어 측면 절 예 하, 하지만 드라이브에 자체-갱신 NPCs의 홍보는 속눈썹 neurotrophic 요인 및 백혈병 금지 요인 관찰 단서 별개의 CNS 영역에 걸쳐 서로 다른 응답을 이끌어내는 수 신호, 척수 창시자2분화 NPCs는 대뇌 피 질의1 의 확장에 크게 기여 하 고 개발 개 채울의 하위 클래스는 또한, hindbrain 및 척수3에서. 반대로, 그것은 생각할 수 있는 척수와 hindbrain 피 질에는 없음 대체 NPC 하위 포함입니다.
마우스 배아 hindbrain 포유류 두뇌의 진화의 가장 오래 된 지역 이며, 소 뇌 및 brainstem 생성. 종에 걸쳐 그것의 보존에도 불구 하 고 상대적으로 작은 hindbrain 성체, 전인대 하위 또는 그들의 규칙을 포함 하 여에 대 한 알려져 있다. 마우스에서 hindbrain 연구의 대부분은 조직 세분화, Hox 유전자4, 포스트 mitotic 신경5의 패턴화에 의해 구동 하는 과정에 집중 했다. 또한,는 hindbrain 발달 신생6의 메커니즘 연구 모델로 사용 되었습니다.
마우스 hindbrain 달리 zebrafish hindbrain NPC 차별화와 척추 모델 생물 (예를 들어,7,8)에서 계보 진행에 따라 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다. 병아리 hindbrain 또한 척추 개발 (예를 들어,9,10) 동안 성체를 공부 고용 되었습니다. Zebrafish hindbrain11와 마찬가지로 여자 hindbrain 수 라이브12시간 동안 NPC 행동 규정을 공부 하 고 몇 군데. 라이브 영상에 의해 유사한 경도 관측 불가능 현재 포유류 유기 체에서 개발 하기 때문에 utero. 또한, 살아있는 zebrafish 태아 나 병아리 태아에서 비켜에서 (예를 들어,13), electroporation를 쉽게 적용할 수 있지만 이러한 기술은 또한 더 도전 에와 같은 기술을 통해 조작 대상으로 utero.
그럼에도 불구 하 고, 마우스 배아 hindbrain은 정교 하 게 성체를 제어 하는 분자 및 세포 메커니즘 정의 적합 합니다. 첫째, 마우스 hindbrain의 분석, 많은 경우에 정보를 제공할 더 낮은 척추 동물을 공부를 통해 얻은 것 보다 인간 개발에 관련 된. 또한, 유전자 변형된 마우스 긴장의 광대 한 수 있습니다 사용할 수 있는 하나 운명 murine NPCs 매핑 또는 관련 유전자의 제정 또는 조건부 돌연변이 체 대립 유전자와 규제 메커니즘을 변경. 마지막으로, 그것은 최근에 보였다 그 microinjection 창시자 비보 전 심 실 hindbrain의 hindbrain 전인대 속도 론14의 적어도 간단한 검사를 허용. 그러나, 현재, 아주 작은 spatiotemporal 조직 및 전체 기관 컨텍스트에서 hindbrain NPCs의 행동에 대 한 알려져 있다.
여기, wholemount 준비와 조직 섹션에서 포유류 NPC 행동을 분석 하기 위한 강력한 모델로 hindbrain 사용할 간단 하 고 빠른 방법을 설명 합니다. 우리는 추가 프로토콜을 사용 하 여 immunolabeling 다른 신생 매개 변수를 공부에 대 한 프로세스 hindbrain 샘플 추가 양적 역전사 (qRT) 등 다운스트림 분자 응용 프로그램에 대 한 제공-PCR.

<table><tbody><tr><td>둥근 바닥 시약 튜브, 2.0 ml (Safe-Lock)</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td>다른 상용 공급업체에서도 구할 수</td></tr> 있음 <tr><td>플라스틱 세포 배양 접시, 60mm</td><td>Thermo Fisher</td><td>150288</td><td>다른 상용 공급업체에서도 구할</td></tr> 수 있음 <tr><td>세포 배양 플레이트, 12웰</td><td>Thermo Fisher</td><td>150628</td><td>다른 상용 공급업체에서도 구할 수</td></tr> 있음 <tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Copan</td><td>200C</td><td>다른 상용 공급업체에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>Dumont Watchmaker 집게, no. 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Watchmaker 집게, no. 55</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>29G 바늘/주사기</td><td>BD</td><td>Micro-Fine +1ml</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-histone H3 primary</td><td>antibody Millipore</td><td>06-570</td><td>Goat, dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anti-BrdU 1차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>Rat, 희석 1:400</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 1차 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>550609</td><td>Mouse, 희석 1:400</td></tr><tr><td>Anti-RC2 1차 항체</td><td>개발 연구 Hybridoma Bank</td><td>RC2</td><td>Mouse(IgM), 희석 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit 2차 항체</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11029</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary anti</td> anti <td>Oxygen Thermo Fisher</td><td>A11037</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM 2차 항체</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21042</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary anti anti</td><td>Therapy Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat 2 차 항체</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11007</td><td>Dilution 1 : 200</td></tr><tr><td>4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td> <td>Sigma</td><td>D9542</td><td>10 &mu에서 사용; g per mL</td></tr><tr><td>5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)</td><td>Sigma</td><td>900584</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-2&acute;-deoxyuridine (BrdU)</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 이미징 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10086</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 염소 혈청</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DAKO 단백질 블록 무혈청</td><td>Agilent</td><td>X0909</td><td></td></tr>, <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>다른 상용 공급업체에서도 구할 수</td></tr> 있음 <tr><td>인산염 완충액 식염수</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>다른 상용 공급업체에서도 구할 수</td></tr> 있음 <tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>다른 상용 공급업체에서도 구할</td></tr> 수 <tr><td>있음 나트륨 테트라 보레이트</td><td>시그마</td><td>B9876</td><td>다른 상용 공급 업체에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>S0389</td><td>다른 상용 공급 업체에서도 사용</td></tr><tr><td>가능 아가로 스</td><td>시그마</td><td>A9539</td><td>다른 상용 공급 업체에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>Super PAP 펜 액체 차단제</td><td>Ted Pella, Inc..</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Antifade Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>S-2828</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>10337700</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Millipore</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Scigen</td><td>4583</td><td>다른 상용 공급업체에서도 구할 수</td></tr> 있습니다. <tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td>다른 상용 공급업체에서도 구할 수 있습니다. 다른 상용 공급업체에서도 구할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Thermo Fisher</td><td>10675112</td><td>다른 상용 공급 업체에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>염산</td><td>Thermo Fisher</td><td>10316380</td><td>다른 상용 공급 업체에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>631-0912</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>온도계</td><td>VWR</td><td>620-0858</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경, Leica MZ16</td><td>Leica</td><td>적용되지</td><td></td>않음</tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경&nbsp; LSM710</td><td>Zeiss</td><td>해당 없음</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 hindbrain 배아 신생 공부에 대 한 모델

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

마우스 배아 개 개발 중 포유류 성체를 공부 하는 가장 일반적으로 고용된 시스템입니다. 그러나, 높게 접힌된 개 neuroepithelium wholemount 분석 검사 기관 전체 성체 패턴을 의무가 아니다. 또한, 개 신생의 메커니즘을 정의 하지 않습니다 반드시 신생; 뇌의 다른 부분에서의 예측 등으로 인해 개 특정 조상 하위의 존재. 마우스 hindbrain 배아 신생 의무가 wholemount 분석, 뿐만 아니라 조직 단면도 spatiotemporal 유통 및 신경 창시자의 동작을 관찰 하는 공부에 대 한 대체 모델을 제공 합니다. 또한, 그것은 쉽게 세포 격리 또는 분자 생물학 분석 같은 다른 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 해 부. 마우스 hindbrain 세포 계보 기자 및 제공 되는 돌연변이 마우스 긴장의 광대 한 수에 쉽게 분석할 수 있습니다, 그것은 공부는 포유류 발달 성체의 세포 및 분자 메커니즘에 대 한 강력한 모델을 제공 합니다. 유기 체입니다. 여기, 우리가 마우스 배아 hindbrain wholemount 준비와 조직 섹션에서 포유류 신경 조상 세포 (NPC) 동작을 분석 하는 데 사용 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.

이 섹션에서는 wholemount 및 조직 섹션 분석을 통해 마우스 배아 hindbrain에 성체를 공부 하면 얻을 수 있는 결과의 예를 보여 줍니다.
우리는 mitotic 마커 pHH3 시각화 나누어 NPCs VZ ( - 를그림 2B D)에 대 한 항 체와 microdissected hindbrain의 wholemount immunolabeling 그를 보여줍니다. 우리 쇼 pHH3+ NPCs 유사 분열 (그림 2C)의 여러 단계를 강조 하 고 확대. 우리는이 표기 방법은이 기관 (그림 2D)에 있는 NPC 유사 분열의 시간 과정을 관찰 하 hindbrain 개발의 여러 가지 연속 단계에 걸쳐 수행 적합 하 그림 있다.
우리는 분열 방향 mitotic NPCs (그림 3B), 순환의 pseudostratified, interkinetic 핵 이동 패턴의 시각화 듀 주입 후 가로 immunolabeled vibratome 섹션 hindbrain 1 h의 이미징 쇼 창시자18 (그림 3B, D), 그리고 전반적인 VZ 구조 (그림 3B - D). 참고 그 mitotic pHH3+ NPCs는 심 실 표면에만 존재 하 고 하지 더 basally (그림 3C)는 대조19개 더 전념된 NPCs의 기저 부 패턴.
우리는 또한 어떻게 사이클링 NPCs 및 차별화 된 그들의 자손 수 있습니다 표시 평가 NPC 혈통 진행 (그림 4) BrdU 또는 듀 보여 줍니다. 마우스 hindbrain BrdU와 Ki67 BrdU 주입 후 1 일의 가로 cryosections immunolabeling수와 사이클링 NPCs (그림 4A, B), neuroepithelium에 의하여의 수의 위치를 보여 줍니다 자동 갱신 NPCs Ki67의 비율을 계산 하 여 정의할 수 있습니다+ + BrdU (그림 4A, C) BrdU+ 셀 사이 세포.
마지막으로, 우리는 r c 2는 신경 관련 중간 필 라 멘 트 NPC endfeet (그림 5B)와 프로세스 (그림 5C) 시각화 nestin에 항 원에 대 한 hindbrain vibratome 섹션의 immunolabeling의 예를 보여줍니다. 얇은 cryosections, 보다는 오히려 Vibratome 섹션, 높은 분기 NPCs의 그리고 또한 전체 neuroepithelial 구조 향상 된 관측을 허용 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig1.jpg"> 그림 1 : 키 e11.5 마우스 배아에서 한 hindbrain의 해 부에 단계. (A - D) Hindbrain 서의 도식 묘사입니다. (A) 꼬리 머리 조직 빨간 점선 따라 절단 하 여 제거 됩니다. (B) 지붕 판 피어 싱 이며 다음 중간 선 (빨간색 세로선)를 따라 rostral와 꼬리 방향에서 떨어져 찢 어 그리고 hindbrain neuroepithelium을 옆으로. (C)는 neuroepithelium 두 구조 사이 집게를 삽입 한 후 meninges에서 들어올려서는 고 midbrain 및 척수 조직 빨간 점선 따라 집게와 조직을 절단 하 여 제거 됩니다. (D)이이 절차는 병합된 hindbrain을 생성합니다. (KE-) 이미지 캡처 hindbrain 서 절차의 주요 단계. (E) 태아는 점선을 따라 절단 하 여 참입니다. (F)는 hindbrain 지붕 접시로 4번째 심 excised 및 점선 따라 severing 하 여 머리에서 분리. 작은 구멍은 지붕 판 (별표)에 피어 싱 전에 (G) 4번째 심 실 방향의 위쪽입니다. 구멍은 중간 선 (화살표)는 hindbrain 노출에 따라 신중 하 게 rostrally와 caudally 조직을 박 리 하 여 확대 됩니다. hindbrain 이며 아래로 위치 pial 쪽 오픈 책 준비에 접어 왼쪽 (H; 블랙 화살촉 나타냅니다 hindbrain 신경 조직). hindbrain에 필요한 경우 wholemount immunolabeling, pial 막 부드럽게 캐 겸 자 (나)를 사용 하 여 주변의 meningeal 세포 막에서 hindbrain neuroepithelium에 의해 제거 됩니다. 초과 midbrain (mb) 및 척수 (sc) 조직 제거 (점선 J에)은 hindbrain (K)을. 눈금 막대: 500 µ m (E), (F - K) 300 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig2.jpg"> 그림 2 : Wholemount immunolabeling는 hindbrain에 걸쳐 NPC mitoses 척도를 사용할 수 있습니다. (A) 회로도 hindbrain 심 실 계층에 mitotic NPCs의 en 얼굴 이미지를 보여주는 V, 심 실 hindbrain 쪽; P, pial hindbrain 측면입니다. (B) 공초점 타일 스캔 z 스택 e10.5 hindbrain mitotic 마커 pHH3 (빨간색)에 대 한 wholemount immunolabeling 다음의. 백색 상자 (D)에 두 번째 패널에 높은 확대에 표시 된 영역을 나타냅니다. (C) 사전 anaphase (흰색 화살표) 및 anaphase (검은 화살표) mitotic 수치 mitotic NPCs. (D) 시간 과정 wholemount pHH3 e9.5-13.5에서 라벨의 전체 코 호트 내에서 구별할 수 있습니다. 스케일 바: (B); 500 µ m 20 µ m (C); (D) µ 하 m 100 이다 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig3.jpg"> 그림 3 : Rostral hindbrain에 그들의 새싹 내 자전거 NPCs. (A) 회로도 mitotic (녹색)와 S-위상 (레드) Npc hindbrain 실의 표면에 뇌 영역에서의 위치를 각각 묘사 hindbrain 통해 가상 횡단면 더 높은 확대 오른쪽에 표시 됩니다. 검은색 화살표 차별화 영역으로 세포 주기 종료 NPC 자손의 이동의 방향을 나타냅니다. 1 h 듀 펄스; 받은 배아에서 부동 e11.0 hindbrain 섹션의 (B) 공초점 z 스택 immunolabeling pHH3와 듀 각각 mitotic (녹색)와 S-위상 (레드) Npc를 시각화 하기 위해 사용 되었다. Hindbrain 표면 점선;로 표시 됩니다. V, 심 실 hindbrain 쪽; P, pial hindbrain 측면입니다. 흰색 상자에 표시 된 지역 삽입; 더 높은 확대에 표시 됩니다. 화살표는 심 실 표면에 상대적인 anaphase에서 NPC의 분열 비행기를 나타냅니다. (C) 단일 채널 pHH3 immunolabeling만을 표시. Mitotic NPCs; 시안색 화살촉으로 표시 됩니다. 기저 부의 부족은 Δ. (D) 단일 채널 듀 라벨만 표시로 표시 됩니다. 듀+ NPCs 채택 그들의 interkinetic 핵 이동으로 인해 pseudostratified 배포 합니다. 대표 주황색 선으로 표시 된 대로 NPCs 실의 표면에서 이동 거리를 측정할 수 있습니다. 스케일 바:에 100 µ m (B -D); (B)에서 삽입에 개의 하 µ 10 m <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig4.jpg"> 그림 4 : Hindbrain NPC 자체 갱신 용량을 확인 Ki67 라벨와 함께 결합 BrdU. (A) Confocal z 스택 Ki67 (녹색) BrdU (빨간색) BrdU 1 일 다음 펄스에 대 한 라벨링 후 e10.5 hindbrain cryosection의. 심 실 영역에서 두 배 긍정적인 세포 Ki67 라벨에 표시 된 대로 BrdU를 통합 하 고 아직도 세포 주기를 통해 이동 하는 Npc는. 총 BrdU+ 인구 사이 이중 표시 된 셀의 비율 자체 갱신 NPCs. (B, C)의 비율을 나타냅니다 단일 채널 Ki67 표시 (B)와 (C) BrdU immunolabeling만. BrdU+ 셀을 Ki67 부족 하 고 따라서 세포 주기 종료 가능성이 (A,C) 시안색 화살촉으로 표시 됩니다. Hindbrain 표면 점선;로 표시 됩니다. V, 심 실 hindbrain 쪽; P, pial hindbrain 측면입니다. 눈금 막대: 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig5.jpg"> 그림 5 : Nestin immunolabeling 시각화 NPC 프로세스와 endfeet. A - ( C) RC2 nestin 신경 중간 필 라 멘 트에는 epitope를 인식에 대 한 면역 형광 hindbrain neuroepithelium에 걸쳐 NPC 형태를 보여 줍니다. RC2 immunolabeling; 다음 e11.5 hindbrain에서 부동 섹션의 (A) Confocal z 스택 박스형된 영역에서 더 높은 확대에 표시 됩니다 (B, B', 꼭대기/심 실 지역)와 (C, C'; 기저 지역). Hindbrain 표면 점선;로 표시 됩니다. V, 심 실 hindbrain 쪽; P, pial hindbrain 측면입니다. (B, C) (A); 박스형 영역의 confocal z 스택 단일 광학 섹션에 표시 됩니다 (B', C'), 각각. 심 실 표면에 고정 하는 NPC 꼭대기 endfoot (B')에 화살표로 표시 됩니다. 단일 및 fasciculated NPC 프로세스에서 흰색과 검은색 화살촉으로 표시 됩니다 (C'), 각각. 스케일 바: 100 µ m, (A); (B, C)에 대 한 개의 하 µ 25 m <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 문서 양측 검정 전체 기관에 조직 섹션 준비 발달 신생 공부 모델 마우스 배아 hindbrain를 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

마우스 Hindbrain 배아 신생 공부에 대 한 모델

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

이 절차의 전반적인 목표는 발달 중에 쥐 배아 후뇌의 전체 장기 및 조직학적 분석을 허용하는 것입니다. 이 방법은 포유류 모델 유기체의 뒷뇌에서 신경 발생에 대한 발달을 연구할 수 있게 해줍니다. 발달 중인 생쥐 hindbrain은 전체 장기에 걸쳐 신경 발생 패턴을 관찰할 수 있는 평평한 구조로 인해 신경 전개 활동을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다.필요한 임신 단계에서 윤리적으로 승인된 절차를 사용하여 시간이 지정된 임신 암컷 마우스를 안락사시키는 것으로 이 절차를 시작합니다. 날카로운 가위를 사용하여 복막강을 잘라내고 조심스럽게 자궁을 절제합니다. 배아가 들어 있는 절제된 자궁을 20밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 60mm 플라스틱 접시에 넣습니다.해부 현미경을 사용하여 모든 추가 해부를 수행합니다. 워치메이커 5번 집게를 사용하여 자궁 근육 벽을 찢어 배아를 노출시킵니다. 탯줄을 절단하여 각 배아를 방출하고 난황낭을 제거합니다.얼음처럼 차가운 PBS가 있는 깨끗한 플라스틱 접시에 각 배아를 옮긴 후 워치메이커 집게 55번을 사용하여 머리를 절단합니다. 선택적으로, 게놈 DNA 분리 및 후속 유전형 분석을 위해 작은 조직 조각을 유지합니다. 워치메이커 집게 55번을 사용하여 후뇌 신경 상피와 평행하고 바로 아래에 있는 뒷뇌를 포함하는 조직을 절제하여 안면 및 전뇌 조직과 분리합니다.뒷뇌와 꼬리 머리 조직을 등쪽이 위로 향하게 배치하고 지붕 판으로 알려진 얇은 조직층으로 덮인 네 번째 뇌실을 식별합니다. 워치메이커 집게 55번을 사용하여 지붕 플레이트를 조심스럽게 뚫고 집게로 여분의 조직을 벗겨내고, 중뇌의 정중선을 따라 배측으로 이동한 다음 후뇌와 척수를 꼬리로 움직입니다. 뒷뇌는 이제 펼쳐진 책 준비에 노출되어야 합니다.전체 산 면역 라벨링을 위해 뒷뇌를 준비하려면 Watchmaker 겸자 번호 55를 사용하여 중간엽의 나머지 머리와 뒷뇌의 껍질 쪽에 부착된 수막을 조심스럽게 떼어냅니다. 중뇌와 척수 조직을 제거하고 뒷뇌 조직만 남깁니다. 비브라톰 및 냉동 절편을 위해 뒷뇌를 준비하려면 Watchmaker 겸자 번호 55를 사용하여 중뇌와 척수 조직을 제거합니다.파스퇴르 피펫을 사용하여 플라스틱 접시의 뒷뇌를 둥근 바닥의 2밀리리터 튜브로 옮깁니다. 모든 PBS를 흡인 한 후, PBS에 용해 된 부피 포름 알데히드 당 4 % 무게의 갓 해동 한 부드러운 교반으로 섭씨 4도에서 2 시간 동안 뒷뇌를 고정합니다. 마지막으로 PBS로 뒷뇌를 세 번 헹굽니다.필요한 경우, 각 농도에서 5분 동안 실온에서 PBS의 메탄올에 대한 망상을 연속적으로 감소시키는 후뇌를 재수화합니다. 그런 다음 뒷뇌로 PBS로 옮깁니다. PBT를 함유한 PBS에서 섭씨 4도에서 30분 동안 뒷뇌를 부드럽게 교반하여 투과시킵니다.그런 다음 10%의 열 비활성화 염소 혈청을 함유한 PBT에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 뒷뇌를 배양합니다. 다음으로, 1%의 열 불활성화 혈청과 1차 항체를 함유한 PBT에서 이전과 같이 뒷뇌를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 섭씨 4도에서 PBT로 1시간씩 뒷뇌를 씻습니다.세척 후, 사용된 1차 항체를 표적으로 하는 적절한 형광단 접합 2차 항체가 포함된 PBT에서 섭씨 4도의 뒷뇌를 밤새 배양합니다. 이 시점부터 뒷뇌를 어둠 속에 두어 형광단이 광표백되는 것을 방지하십시오. PBT로 이전과 같이 세척한 후 항체 결합의 장기 보존을 위해 PBS의 4% 포름알데히드에 뒷뇌를 15분 동안 실온에서 수정하십시오.한편, 유리 현미경 슬라이드를 두 겹의 검은색 전기 테이프로 덮고 겹겹이 쌓인 테이프에서 작은 사각형을 잘라내어 뒷뇌를 담을 수 있을 만큼 큰 주머니를 만듭니다. PBS에서 뒷뇌를 두 번 간단히 헹군 후 파스퇴르 피펫으로 주머니에 옮깁니다. 여분의 액체를 제거하고 주머니에 적절한 퇴색 방지 시약을 추가합니다.그런 다음 커버 슬립 아래에 기포가 갇히지 않도록 유리 커버 슬립으로 뒷뇌를 천천히 덮습니다. 커버슬립을 밀봉하고 매니큐어를 얇게 펴 슬라이드에 부착합니다. 이미지를 획득할 때까지 슬라이드를 섭씨 4도의 어둠 속에서 보관하십시오.증류수에서 준비된 부피당 3%중량으로 용융된 아가로스에 뒷뇌를 내장합니다. 절단은 진동을 사용하여 뒷뇌 절편을 70미크론 두께로 전달합니다. 붓으로 갓 자른 각 부분을 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 24웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다.텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 부동 섹션에 레이블을 지정한 후 PBS에서 잠시 세척합니다. 붓을 사용하여 떠 있는 부분을 유리 현미경 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다. 압지나 티슈를 사용하여 섹션 주변의 여분의 PBS를 닦아냅니다.PBS에서 80% 글리세롤을 사용하는 섹션이 아닙니다. 그리고 기포가 갇히지 않도록 유리 커버슬립으로 천천히 덮으십시오. 이미지를 획득할 때까지 슬라이드를 섭씨 4도의 어둠 속에서 보관하십시오.얼기 전에 뒷뇌를 동결하기 전에 뒷뇌를 보호하기 위해 섭씨 4도의 PBS에서 부피당 30% 무게로 자당을 배양합니다. 뒷두뇌를 광학 절단 온도 화합물 또는 OCT에 담그십시오. 그런 다음 뒷비가 포함된 곰팡이를 드라이 아이스에서 섭씨 40도에서 50도 사이로 냉각된 이소펜탄으로 옮겨 빠르게 얼립니다.다음으로, 저온 유지 장치를 사용하여 전달 후뇌 절편을 10미크론 두께로 절단합니다. 뒷뇌 절편을 정전기 접착 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 슬라이드를 실온에서 15분 동안 배양하여 슬라이드 섹션을 건조시킵니다.그런 다음 PBS로 극저온 절편을 세척하여 OCT를 용해합니다. PAP 펜을 사용하여 극저온 절편 주위에 소수성 장벽을 표시합니다. 수성 매체에 적합한 렌즈, 장착된 슬라이드, 면역 라벨링에 사용되는 형광단에 적합한 광학 필터가 장착된 Epi-fluorescent 또는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다.전체 후뇌 또는 후뇌 단면을 이미지화하려면 렌즈를 사용하여 10배 확대합니다. 정량화를 위해 후뇌 영역을 시각화하려면 40배 배율을 사용합니다. 그리고 개별 세포를 시각화하려면 63배 배율의 렌즈를 사용하십시오.여기에 표시된 것은 심실 영역에서 분열하는 신경 전구 세포를 관찰하기 위해 wholemount immuno labeled hindbrains의 대표적인 결과입니다. 이러한 이미지는 연속적인 발달 단계에서 유사분열 마커 phospho histone H3를 사용하여 얻었습니다. EdU의 1시간 펄스 후에 횡방향 진동 절편을 라벨링하여 심실 표면에서 유사분열 인산-히스톤 H3 양성 세포뿐만 아니라 inter-kinetic 핵 이동을 겪고 있는 hindbrain 신경 전구 세포를 강조했습니다.자가 재생 신경 전구 세포의 전체 비율은 BrdU 투여 하루 후 배아의 횡방향 후뇌 냉동 절편에서 빨간색과 노란색의 모든 BrdU 양성 세포 중 노란색의 Ki67 BrdU 이중 양성 세포의 비율을 계산하여 결정할 수 있습니다. Hindbrain vibratome 절편은 RC-2라고도 하는 중간 필라멘트 단백질 Nespin에 대한 항체로 면역 라벨링되어 신경 전구 세포, 말단 부위 및 돌출부를 시각화할 수도 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 편평한 산 제제 또는 뒷뇌의 횡조직 절편을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.한 번 숙달하면 1시간 이내에 최대 10개의 뒷뇌를 해부할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 먼저 후뇌 미세 박리에 익숙해지는 경우 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하는 것이 중요한데, 이는 조직 보존을 보장하는 것 외에도 수막에서 분리를 용이하게 하기 때문입니다. 이 절차에 따라 후뇌의 단일 세포 현탁액에 대해 유세포 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 신경 전구 세포를 다른 세포 유형과 분리할 수 있습니다.이 기술의 확립은 발달 신경생물학 분야의 연구자들이 전통적으로 사용된 척수 및 전뇌 모델의 대안으로 뒷뇌를 사용하여 포유류 신경 발생의 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 방법은 포유류의 뒷뇌 신경 발생에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 종 간의 구조적 및 분자적 유사성의 정도를 감안할 때 다른 발달 중인 척추 동물에도 적용할 수 있습니다. 이 기술은 신경 발생을 제어하는 새로운 메커니즘을 발견하는 데 도움이 될 수 있으며 축의 다른 곳에서 확인된 메커니즘이 척추동물 뇌의 이 부분에서 다시 요약되는지 여부를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

E12.5 murine 배아 midbrain에서 organotypic 조각을 생성하는 방법을 설명합니다. organotypic 슬라이스 문화가 dopaminergic 신경이나 다른 복부 midbrain의 뉴런의 행동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

이 비디오는 마우스 배아 줄기 세포에서 피질 중간뉴런 전구체를 생성하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 줄기세포의 증식 및 배아체(EB)로의 응집을 촉진하는 특정 소분자 억제제를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 수반합니다. 그 후, EB는 효소와 해리되고 접착 단백질로 코팅된 배양 플레이트 웰에 도금되어 피질 중간뉴런 전구체로의 분화를 촉진합니다.

Generating Cortical Interneuron Precursors from Mouse Embryonic Stem Cells(마우스 배아 줄기세포에서 피질 중간뉴런 전구체 생성)

발달 신경 생물학의 근본적인 문제는 어떻게 신경 네트워크가 배아 뇌에 설립되어있다. 여기에서 우리는 크레 / 훈제 연어 - 플라스미드와 지느러미의 interneurons 레이블을 다양한 발달 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 추적하는 조류 후뇌의 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템과 같은 새로운 유전 도구와의 electroporation 기술을 결합했다.

병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

시상 하부의 기능 및 의료 중요성에도...

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

NF-κB에 의존하는 성인의 해마 신경의 조작 및 분석을위한 방법이 설명되어 있습니다. 자세한 프로토콜은 마우스의인지 결과의 조사를 위해 치아 이랑 (dentate gyrus)에 의존하는 행동 테스트 (공간 패턴 분리 - 바네스의 미로라고합니다)에 제공된다. 이 기술은 또한 다른 실험 설정에서 조사를 활성화하는 데 도움이됩니다.

NF-κB에 의존하는 성인 신경 발생의 변조 및 분석을위한 방법

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

배아 신경 세포는 신경 튜브의 심실 영역에서 태어 났지만, 적절한 목표에 도달하기 위해 마이그레이션됩니다. 얼굴 branchiomotor (FBM) 신경 세포는 신경 세포의 이동을 연구하기위한 유용한 모델이다. 이 프로토콜은 FBM 이동을 조절하는 메커니즘을 조사하기 위해 마우스 배아 hindbrains의 wholemount 생체 문화를 설명합니다.

마우스 후뇌<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 문화 얼굴 Branchiomotor 신경 세포의 마이 그 레이션을 연구하는

새로운 두뇌 지구에서 젊은 신경 도전 어떻게 환경 sculpts 신경 운명과 성숙에 중요 한 통찰력을 밝힐 수 있다. 이 프로토콜 interneuron 선구자 특정 두뇌 지역에서 수확 하 고 그들에 게 어느 homotopically를 이식 하는 절차에 설명 합니다 또는 출생 후 새끼의 뇌에 heterotopically.

이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식

이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

배우세요 마우스 배아 후뇌를 이용한 신경발생 연구 방법으로, 전 장기 및 조직 분석을 통해 포유류 신경발달 메커니즘을 탐구합니다. 이 기법은 발달 신경생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

마우스 Hindbrain 배아 신생 공부에 대 한 모델

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