Name: 유기체 살충제에 노출된 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하기 위한 실험 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 학습하세요 유기체 살충제에 노출된 HepG2 간세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는 방법을. ATP 수준 및 산소 소비율 측정을 통해 세포 에너지 대사 장애를 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (그랜트 Nos. 81573174, 81570574)에 의해 지원되었다; 장쑤성 우수 청년기금(SBK2014010296); 중국 교육부 연구 프로젝트 (213015A); 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학술 프로그램 개발 (PAPD), 강서 고등 교육 기관의 주력 주요 개발; 및 환경 화학 및 생태 독성학의 국가 핵심 연구소의 오픈 프로젝트 프로그램 (KF2015-01).

모든 실험과 실험 프로토콜은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었으며 난징 의과 대학의 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. TEM에 의한 미토콘드리아 초구조
<ol><li>HepG2 세포 수집<ol>
<li>100mm 접시에 씨앗 HepG2 세포. 37 °C 및 5 % CO2에저장합니다.</li>
		<li>1.5 mLEP 튜브에서 0.25 % EDTA로 세포를 소화합니다.</li>
		<li>실온(RT)에서 3분 동안 1000 x g의 원심분리기. 상부체를 폐기합니다.</li>
		<li>4-6 x 105 HepG2 셀을 수집합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파이펫과 함께 5% 글루타랄데히드(용매: 이중 증류수)의 1mL을 넣고 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>인산염 완충제 1mL의 4가지 변경 사항(Na2HPO4,KH2PO4,NaCl 및 KCl, pH 7.4 포함), 각각 15분으로 세척합니다. 파이펫으로 인산염 버퍼를 빨아.</li>
	<li>1% 오스뮴 (용매 : 이중 증류수)의 200 μm을 추가하고 검은 색 샘플에 대한 2 시간 4 ° C에서 배양. 주의 사항: 오스뮴은 매우 독성이 높고 휘발성 물질입니다. 그것은 신중하게 약물 캐비닛에서 작동해야합니다.</li>
	<li>인산염 완충제 1mL의 2개 변경 내용으로 넣고 세척합니다. 인산염 버퍼를 빨아.</li>
	<li>2h에 대한 1.5 mL EP 튜브에서 2 % 우란 아세테이트 용액 (용매 : 이중 증류수 및 아세트산)에 스테인.</li>
	<li>탈수하고 50% 아세톤, 70% 아세톤, 90% 아세톤(용매: 이중 증류수), 절대 아세톤 2개, 각 15분으로 물에 잠급됩니다.</li>
	<li>RT에서 1.5h에 2방울 아세톤(100%)/임베딩 제(1:1)로 침투합니다. Epon812 포함 제, 조리법은 다음과 같습니다 : Epon812, 62 mL 및 DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL 및 MNA 89 mL. A:B=2:8 (v:v, 겨울), A:B=1:9 (v:v, 여름). 포함 금형에 포함 (체크 그리드부드러운 플라스틱 플레이트).</li>
	<li>12h용 37°C, 12h용 45°C, 48h의 경우 60°C로 순차적으로 배양한다.</li>
	<li>초박형 단면(가장 큰 면적은 0.5mm × 0.3mm)을 초과할 수 없음을 초박한 단면 기계 및 TEM(2 μm 및 500 nm)에 의해 준비하고 관찰합니다.</li>
</ol>2. 미토콘드리아 형광 강도 검출
<ol><li>종자 2x 104 HepG2 셀 6 웰 플레이트. 24h에 β-HCH를 추가합니다.</li>
	<li>1 mM 미토콘드리아 녹색 형광 프로브의 최종 농도를 공식화하는 무수 DMSO를 추가합니다.</li>
	<li>6웰 플레이트의 각 웰에 1mL 미토콘드리아 녹색 형광 프로브 용액(최종 농도: 200 nM)을 추가하고, 45분 동안 37°C에서 배양합니다.</li>
	<li>미토콘드리아 녹색 형광 프로브 용액을 제거하고 이미징 전에 37°C에서 갓 준비된 세포 배양 배지(DMEM)를 추가합니다.</li>
	<li>형광 현미경 (10x)에 의해 미토콘드리아 녹색 형광을 관찰한다. 검출 시 최대 흥분 파장은 490nm이고 최대 방출 파장은 516nm이다.</li>
</ol>3. 셀룰러 ATP 수준의 분석
<ol><li>6웰 플레이트에 종자 HepG2 세포. 24h에 β-HCH를 추가합니다.</li>
	<li>루시파아제-루시페린 ATP 분석 키트에서 200 μL의 용해 버퍼를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 12,000 x g의 원심분리기는 파이펫으로 새로운 튜브로 상류물을 수집합니다.</li>
	<li>ATP 검출 버퍼로 ATP 검출 시약을 1: 5의 비율로 희석합니다.</li>
	<li>표준 곡선 결정 준비: ATP 표준 솔루션의 0.5 mM을 ATP 표준 솔루션의 0.5 mM을 ATP 리시스 버퍼에 의해 10, 5, 1, 0.5, 0.5, 0.01 μM로 희석합니다.</li>
	<li>RT에서 5분 동안 96웰 플레이트에 ATP 검출 버퍼 100μL을 추가하고, 발광계(화학발광 검출기)에 의해 감지되는 100μL의 셀 을 추가합니다. 표준 곡선을 사용하지만 ATP 농도(nmol/L)를 계산합니다.</li>
	<li>멀티 모드 리더와 BCA 단백질 분석 키트에 의해 단백질 농도를 감지합니다.<ol>
<li>표준 곡선 측정 준비: 단백질 표준 용액 5 mg/mL을 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 mg/mL에 이중 증류수로 희석합니다.</li>
		<li>96웰 플레이트에 셀 의 상체 1 μL을 추가하고 이중 증류수 19 μL을 추가합니다.</li>
		<li>각 웰에 대해 200 μL의 BCA 검출 솔루션을 추가합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 562nm의 멀티 모드 판독기에서 OD(광학 밀도) 값을 감지합니다. 표준 곡선을 사용하지만 단백질 농도(mg/mL)를 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>mg 단백질 농도당 ATP 함량을 수정합니다(단위: ATP 농도/단백질 농도, nmol/mg).</li>
</ol>4. JC-1에 의한 미토콘드리아 막 전위(MMP) 평가
<ol><li>6웰 플레이트에 시드된 HepG2 세포를 수집합니다. 1.5mL EP 튜브에서 0.25% EDTA를 가진 세포를 소화하고, 원심분리기는 1000 x g에서 3분 동안, 상체를 버리고 세포를 수집한다.</li>
	<li>JC-1(200X)의 50μL을 증류수 8mL에 넣고 소용돌이와 혼합합니다. JC-1 검출 솔루션으로 염색 염색 버퍼의 2mL을 추가합니다.</li>
	<li>세포 배양 배지의 0.5mL 및 JC-1 검출 용액의 0.5 mL의 혼합물로 세포를 37°C에서 20분 동안 배양한다.</li>
	<li>4°C에서 3분 동안 600 x g의 원심분리기. 상부체를 폐기합니다.</li>
	<li>JC-1(1X) 염색 버퍼의 1mL의 2가지 변화에서 헹구고, 원심분리기는 600 x g에서 4°C에서 3분 동안 헹구는다. 그리고 상체를 폐기하십시오.</li>
	<li>JC-1 (1X) 염색 버퍼의 0.5 mL에서 세포를 중단하고, 흐름 세포측정을 통해 분석하여 녹색 및 적색 형광을 감지합니다. JC-1 폴리머가 검출되면, 발산 광을 490 nm로 설정하고 방출 광을 530 nm로 설정합니다. JC-1 폴리머가 검출되면, 발산광을 525nm로 설정하고 방출광을 590nm로 설정한다.</li>
</ol>5. 산소 소비율(OCR) 측정
<ol><li>종자 HepG2 세포는 잘 당 4500 세포/100 μL의 밀도에서 96-well의 세포 배양 마이크로 플레이트에 있습니다. 24시간 이후에 각 셀이 잘 덮여 있는지 확인합니다.</li>
	<li>이전문헌(13)에따라 준비된 시약의 적절한 부피를 적절한 사출 포트에 첨가한다. 포트 A: 올리고마이신의 25 μL 1 μM (ATP 커플러); 포트 B: FCCP의 25 μL 0.75 μM (전자 스로틀 제어, ETC 가속기); 포트 C: 25 μL 0.5 의 μM 항마이신 A/로테네론(미토콘드리아 억제제 A 및 미토콘드리아 억제제 B).</li>
	<li>사용할 준비가 될 때까지 CO2가없는 37 ° C 인큐베이터에 카트리지를 저장합니다.</li>
	<li>각 웰에서 실행 매체를 제거하고 새로운 DMEM에 추가하여 세포 판의 중간 변화를 만듭니다. 각 우물의 최종 부피는 180 μL입니다.</li>
	<li>세포판은 분석 전에 1시간 동안 CO2가 없는 37°C 인큐베이터에 보관한다.</li>
	<li>소프트웨어로 OCR을 자동으로 기록합니다.<ol>
<li>OCR 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>앱 드롭다운 메뉴에서 셀 미토 스트레스 테스트 키트를 선택합니다.</li>
		<li>앱 시작 버튼을 클릭합니다.</li>
		<li>스트레스 실행 테스트 버튼을 클릭합니다. 셀 스트레스 테스트 설정 화면이 나타납니다.</li>
		<li>다음 단계를 수행합니다.<ol>
<li>셀 시드 # 상자에 잘 시드된 셀 수를 입력합니다.</li>
			<li>평균 기초 OCR 상자에 평균 OCR을 입력합니다.</li>
			<li>각 시약에 대한 최종 작업 농도를 입력하고 시약을 주입합니다. 참고: 세포 파종 농도에 최적화할 때 최적화 분석서를 실행하기 전에 셀의 평균 기초 OCR 값이 검출되어야 합니다.</li>
			<li>다음 단추를 클릭합니다. 그룹 정보 화면이 나타납니다.</li>
			<li>색상을 선택하고 이름을 지정한 다음 적절한 우물을 클릭하여 할당되지 않은 우물에 그룹을 할당합니다. 참고: 다른 그룹은 세포 미토 스트레스 테스트를 실행하기 전에 다른 치료법으로 정의됩니다. 마이크로 플레이트의 모든 우물은 스트레스 테스트가 실행될 때 동일한 시약 주사를 받게됩니다.</li>
			<li>다음 단추를 클릭합니다. 스트레스 테스트 사출 레이아웃 화면이 나타납니다.</li>
			<li>시작을 클릭합니다. 이제 분석기에서 스트레스 테스트가 실행됩니다. 실행이 끝나면 소프트웨어의 점 s를 따라 카트리지와 셀 플레이트를 제거하고 버립니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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검출 프로토콜의 성공에 중요한 것은 표현형에서 메커니즘에 이르는 연구를 다루어온 다양한 실험 적 방법의 사용입니다. 이 연구에서, HepG2 세포는 페니실린과 연쇄상 구균 및 10% 태아 소 혈청으로 DMEM에서 배양되었습니다. 세포가 40-50% 합류에 도달하면 β-HCH(0, 10, 100 ng/mL)를 24시간 동안 첨가하고 배양하였다. 먼저 대표적인 OCP, β-HCH에 의한 간세포의 초구조적 변화를 보여 미토콘드리아 구조의 손상을 나타내는 TEM을 사용했다(도1)). 더욱이, 형광 염색 분석서(도2),루시파아료-루시페린 ATPFigure 2 (분석(도 3)), JC-1 <strong...

생식 간섭, 면역 독성, 대사 변화 등 건강에 대한 유기염소살충제(OCP)의 효과는 이전에1,,2,,3을연구하였다. 세포 대사를 감지하고 미토콘드리아 기능 장애를 알아내는 방법은 과학자들이 미토콘드리아기능(즉)역할을 이해할 수 있게 해 주었다. , 미토콘드리아 STAT3 수준, 젖산, 피루바테, 젖산염-피루바테 비율, 코엔자임 Q10, 미토콘드리아 양성자 누출, 생체 에너지, 생체 발생, 심혈관 기능, 암 및 안전 독성4,,55,6,,7. 이 논문에서는 OCP에 의한 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 방법을 설명합니다.
우리는 HepG2 세포를 β-헥사클로로클로헥산(β-HCH)에 노출시켰다( β-HCH), 하나의 대표적인 OCP, 24h는 인간의 내부 노출에 상응하는 용량으로. 먼저, TEM은 핵, 미토콘드리아 및 내피 성 망상8과같은 간세포의 초구조를 관찰하도록 적용되었다. 일반적인 현미경과 비교하여, TEM은 세포 및 세포 성분 (세포주 또는 조직), 형태학, 화학 조성뿐만 아니라 현대 과학 및 기술에서 중추적 인 역할을하는 천연 또는 인공 물질의 기능을 2D 및 3D 초구조를 탐구 할 수 있습니다. 미토콘드리아 기능은 β-HCH로 배양된 HepG2 세포에서 미토콘드리아 형광 강도, 아데노신 5'-triphosphate(ATP) 수준, 산소 소비율(OCR) 및 미토콘드리아 막 전위(MMP)에 의해 더욱 평가되었다. 미토 트래커 그린은 미토콘드리아 그린 형광 프로브로, 살아있는 세포 미토콘드리아 특이적 형광 염색에 사용할 수 있다. 간세포내의 미토콘드리아는 미토트래커 그린 용액과 미토콘드리아 형광 강도, 수 및 패턴에 의해 염색되어 공초점 현미경9로관찰되었다. 미토콘드리아 녹색 형광 프로브는 살아있는 세포를 얼룩지게 하는 데 사용할 수 있습니다. 로다민 123 또는 JC-1과 비교하여 미토콘드리아 녹색 형광 프로브는 미토콘드리아 염색을 위한 미토콘드리아 막 잠재력에 의존하지 않습니다. ATP 수준은 루시파아제-루시페린 키트에 의해 결정되었고 단백질 농도에 의해 정상화되었다. ATP 분석 키트는 일반적인 해결책, 세포 또는 조직에서 ATP 수준을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 키트는 ATP가 에너지를 제공해야 할 때 형광을 생성하기 위해 형광에 의해 촉매된 반딧불 루시파아제를 기반으로 합니다. 반딧불이 루시파라제와 형광이 과도한 경우, 특정 농도 범위에서, 형광의 생성은 ATP의 농도에 비례한다. 또한 이 키트는 ATP의 화학 발광을 최적화하기 위해 특별히 설계되었습니다. ATP는 가장 중요한 에너지 분자로서 세포의 다양한 생리학적 또는 병리학 적 과정에 중요한 역할을합니다. ATP 수준에 있는 변경은 세포 기능에 있는 결점을 반영할 수 있습니다, 특히 미토콘드리아 에너지 생산. 일반적으로 세포 사멸, 괴사 또는 일부 독성 상태에서, 세포 ATP 수준은 10감소. JC-1을 사용한 MmPs 분석 키트는 JC-1을 형광 프로브로 사용하여 세포, 조직 또는 정제된 MmP를 빠르고 민감하게 감지하는 키트입니다. 그것은 apoptosis의 조기 검출을 위해 사용될 수 있습니다. 양이온염액 JC-1은 녹색 및 적색 형광비의 변화에 의해 표시된 유동 세포측정하에서 분석될 수 있는 MMP를 검출하는 데 사용되는 형광 프로브이다. MMP가 높을 때, JC-1은 적색 형광을 생성하는 중합체(J-aggregates)를 형성하기 위해 미토콘드리아의 매트릭스에 응집된다. MMP가 낮으면 JC-1이 축적될 수 없으며 녹색형광(11)을생성하는 단조량체를 형성한다. 따라서 적색 및 녹색 형광의 비율은 MMP의 수준을 반영할 수 있습니다. 세포의 OCR은 정상적인 세포기능(12)의중요한 지표이다. 미토콘드리아 기능을 연구하기 위한 매개변수로 간주됩니다. 세포 미토 스트레스 테스트 키트는 미토콘드리아 기능의 주요 파라미터를 분석하는 안정적인 방법을 제공합니다. 이 키트는 품질 관리 및 예측 시약뿐만 아니라 세포 미토콘드리아 응력 테스트를 수행하는 표준 방법을 제공합니다. 그것은 1 차세포, 세포주, 중단된 세포를 포함하여 모든 세포 모형을 검출하기 위하여 이용될 수 있고, 또한 섬, 선충, 효모 및 고립된 미토콘드리아를 위해 이용될 수 있습니다.
OCR 측정은 세포의 생리적 상태 또는 변경에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 호흡 기준선, 양성자 누출, 최대 호흡, ATP 회전율 및 예비 용량을 검출하기 위해 세포외 플럭스 분석기로 결정되었습니다. 간단히 말해서, OCR의 기준선 측정 후, OCR은 올리고마이신(ATP 커플러), FCCP(미토콘드리아 산화 인산화 비커플기) 및 항마이신 A/로테네톤(산소 소비 억제제)에 순차적으로 첨가한 후 검출되었다.
시험관내 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하기 위한 보다 구체적인 프로토콜의 개발을 용이하게 하기 위해, 우리는 미토콘드리아 손상 관련 불리한 결과를 연구하는 향후 응용 프로그램과 함께 TEM, 공초점 현미경, 발광계, 유동 세포측정및 세포외 플럭스 분석기의 실험을 여기에 제시한다.

<table><tbody><tr><td>투과 전자 현미경&nbsp;</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2 Spirit Bio TWIN</td><td>고대비, 고해상도 이미징, 저선량 관찰 및 이미징, 저온 관찰, 뛰어난 분석 성능, 편의성과 성능을 위한 자동화</td></tr><tr><td>Mito-Tracker Green</td><td>Beyotime</td><td>C1048</td><td>Mito-Tracker Green은 라이브 셀 미토콘드리아 특이적 형광 염색에 사용할 수 있는 미토콘드리아 녹색 형광 프로브입니다.</td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>700B</td><td>디자인은 컴팩트하고 안정적이며 광 경로는 가장 짧고 높은 광 정밀도, 창의적인 기술 및 정교한 스캐닝 기술을 결합하여 완벽한 3차원 표본 이미지를 생성합니다.</td></tr><tr><td>Enhanced ATP Assay Kit</td><td>Beyotime</td><td>S0027</td><td>Enhanced ATP Assay Kit는 일반적인 용액, 세포 또는 조직에서 ATP(아데노신 5'-트리포스페이트) 수치를 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 세포와 조직 샘플을 분할하여 샘플 준비를 완료할 수 있으며 최대 0.1nmol/L의 검출 감도, 화학 발광을 30분 동안 유지할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>광도계</td><td>Berthold</td><td>Centro LB 960</td><td>광도계는 화학발광 검출기이며 테스트 샘플 자체가 가벼울 수 있으며 자극할 필요가 없습니다. 광도계는 화학발광을 감지하는 기기입니다.</td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>BCA 단백질 분석 키트는 단백질 농도를 감지하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다.</td></tr><tr><td>멀티모드 리더</td><td>TECAN</td><td>InfiniteM200</td><td>멀티모드 리더는 단백질 동의를 감지하는 데 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

유기체 살충제에 노출된 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하기 위한 실험 프로토콜

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

이 논문은 간세포에서 환경 유기염소 살충제 (OCP)로 인한 대사 장애의 원인을 더 잘 이해하기 위해 간 미토콘드리아 기능을 검출하는 방법에 대한 자세한 방법을 제시합니다. HepG2 세포는 β-헥사클로로시클로헥산(β-HCH)에 24시간 동안 일반 집단에서 내부 노출의 동등한 용량으로 노출되었다. 간세포내의 초구조는 미토콘드리아의 손상을 나타내기 위해 전염 전자 현미경 검사(TEM)에 의해 검사되었다. 미토콘드리아 기능은 β-HCH로 배양된 HepG2 세포에서 미토콘드리아 형광 강도, 아데노신 5'-triphosphate(ATP) 수준, 산소 소비율(OCR) 및 미토콘드리아 막 전위(MMP)에 의해 추가적으로 평가되었다. 미토콘드리아 녹색 형광 프로브에 의해 염색된 후 미토콘드리아 형광 강도는 형광 현미경검사로 관찰되었다. 루시페린 루시파라제 반응은 ATP 수준을 결정하는 데 사용되었다. MMP는 양이온염 JC-1에 의해 검출되고 유동 세포측정하에 분석되었다. OCR은 세포외 플럭스 분석기로 측정되었다. 요약하자면, 이러한 프로토콜은 미토콘드리아 손상을 조사하기 위해 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하는 데 사용되었습니다.

β-HCH에 노출된 HepG2 세포의 미토콘드리아 크리스테가 현저하게 손상되었다. 산란된 미토콘드리아는 약간 팽창하여 불규칙한 모양으로, 미토콘드리아 능선은 비교적 비정상적인 미토콘드리아아키텍처(도 1)로사라졌다.
미토콘드리아를 나타내는 평균 미토콘드리아 녹색 형광 강도는 β-HCH(도2)에노출된 HepG2 세포뿐만 아니라 ATP 수준(도3)에서감소하였다. 형광 강도와 ATP 수준은 노출 농도가 증가함에 따라 서서히 감소했습니다. 잠재적으로, 미토콘드리아 수의 감소, 또는 손상된 미토콘드리아, 관찰된 미토콘드리아 형광 강도를 일으키고, 결과적으로 ATP의 생산이 감소되었다.
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간세포에서 미토콘드리아 기능에 대한 환경 유기염소농약(OCP)의 영향을 이해하는 것은 대사 장애를 일으키는 OCP의 메커니즘을 탐구하는 데 중요합니다. 이 논문은 간 미토콘드리아 기능을 검출하는 방법에 대한 자세한 방법을 제시합니다.

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

ATP 수준 및 산소 소비속도와 같은 분야의 기능에 있어 도의 주요 질문에 대한 답변을 요청하는 메서입니다. 새로운 또는 한 페이지 이전, 이 기술은 수행하기 쉽고 세포 미토콘드리아 기능의 특별한 평가를 위해 많은 것입니다. 이 실험을 시작하려면, 씨앗 20, 000 HepG2 세포 유리 바닥 페트리 접시에.베타 헥사클로클로헥산 또는 B-HCH를 인큐베이터에 섭씨 37도, CO2 5%를 24시간 동안 추가합니다. DMEM 세포 배양 배지에 무수성 DMSO를 추가하여 1밀리머 미토콘드리아 녹색 형광 프로브 용액을 준비한다. 그런 다음 유리 바닥 페트리 접시의 세포에이 솔루션의 접시 당 1 밀리리터를 추가합니다.그리고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 세포로부터 미토콘드리아 녹색 형광 프로브 용액을 제거한다. 섭씨 37도 DMEM 세포 배양 배지에서 갓 조리한 요리당 1밀리리터를 추가합니다.미토콘드리아에서 녹색 형광을 검출하려면 공초점 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 세포 ATP의 수준을 평가하기 위해, 6 개의 잘 플레이트에서 20, 000 HepG2 세포에 종자. 베타 HCH를 추가하고 24시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.각 웰의 셀에 200 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가합니다. 원심분리기는 섭씨 4도에서 5분간 12, 000배 G로, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 상퍼를 수집합니다. 플레이트에 100개의 마이크로리터 ATP 검출 버퍼를 추가합니다.수집된 셀 상체 100마이크로리터를 실온에서 96웰 플레이트에 추가하고 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 발광계에 의한 세포 ATP를 검출하였다. 미토콘드리아 막 전위 평가를 위해, 이전에 설명한 바와 같이 베타-HCH를 첨가하여 6개의 웰 플레이트에서 HepG2 세포를 성장시킵니다. 섭씨 37도에서 1분 동안 0.5 밀리리터 0.25%EDTA로 소화하여 세포를 수집합니다.소화를 멈추고 소화된 세포를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기려면 1밀리리터 DMEM을 추가합니다. 튜브를 1000회 G로 3분간 원심분리한 다음 상체를 폐기합니다. 세포 배양 배지의 0.5 밀리리터와 0.5 밀리리터 JC1 미토콘드리아 막 전위 염료로 세포 펠릿을 희석시키십시오.그리고 섭씨 37도에서 20 분 동안 배양하십시오. 다음으로, 4°C에서 3분 동안 600회 G로 튜브를 원심분리한 다음 텍스트 프로토콜에 따라 세포 펠릿을 세척합니다. 씻은 펠릿을 원심분리한 후 상퍼를 제거합니다.그리고 JC1 염색 버퍼의 0.5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 유동 세포분석을 통해 JC1 염색된 세포를 분석하여 녹색 및 적색 형광을 감지합니다. JC1 단조량체가 검출되면, 발산 광을 490 나노미터로 설정하고 방출 광을 530 나노미터로 설정합니다.JC1 폴리머가 검출되면, 발광광을 525나노미터로 설정하고 방출광을 590나노미터로 설정한다. 산소 소비속도를 분석하기 위해, 종자 HepG2 세포는 96개의 잘 세포 배양 플레이트에 있는 밀도4, 500세포의 밀도당 100 마이크로리터당 잘 한다. 섭씨 37도에서 24시간의 배양 후 각 우물의 세포가 중간 크기로 덮여 있는지 확인하십시오.OCR 소프트웨어를 실행하기 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 카트리지 및 세포 배양 판이 세포 외 플럭스 분석기로 마이크로 플레이트를 로드합니다. OCR 소프트웨어를 열고 앱에서 드롭 다운 메뉴에서 셀 미토 스트레스 테스트 키트를 선택하고 시작 앱 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 실행 응력 테스트 버튼을 클릭합니다.세포 응력 테스트 화면이 나타나면, 세포 파종 번호 상자에서 잘 파종되는 셀 수와 기초 셀 OCR 상자의 평균 OCR을 입력합니다. 각 시약에 대한 최종 작업 농도를 입력한 다음 시약을 주입합니다. 다음 버튼을 클릭합니다.그룹 정보 화면이 나타나면 색상을 선택하고 이름을 지정하여 할당되지 않은 우물에 그룹을 할당합니다. 그런 다음 적절한 우물을 클릭합니다. 다음 버튼을 클릭하고 나타나는 스트레스 테스트 주입 레이아웃 화면에서 분석기에서 스트레스 테스트를 실행하려면 시작을 클릭합니다.실행이 완료된 후 소프트웨어의 프롬프트를 따라 카트리지와 셀 플레이트를 제거하고 버립니다. 미토콘드리아 녹색 형광 염색의 평균 강도는 베타 HCH에 노출된 HepG2 세포에서 감소하였다. 이는 미토콘드리아 수가 감소하고 미토콘드리아가 살충제 농도의 증가와 일치하는 손상된 미토콘드리아의 증가가 있음을 보여준다.더욱이, HepG2 세포에 있는 ATP 수준은 베타 HCH 노출의 증가한 농도로 감소하, 이 세포에 있는 미토콘드리아의 감소된 기능을 보여주는. 미토콘드리아 막 전위 또는 MMP를 위한 JC1 염색 후, 유동 세포계는 그대로 HepG2 세포에서 높은 빨간색 녹색 JC1 형광을 보였다. 이것은 높은 MMP의 표시인 적색 형광 JC1 응집물의 존재 때문이었습니다.베타-HCH로 치료된 세포에서, 적색 녹색 JC1 형광은 녹색 형광 JC1 단량의 존재로 인해 감소, 낮은 MMP의 표시. 마지막으로, 산소 소비율은 또한 베타-HCH 노출의 증가 농도와 함께 감소, 이 농약 적절 한 미토 콘 드리 아 기능을 손상 추가 보여주는. 아, 음, 이 절차를 시도, 그것은 중요 하지만, 그것을 테스트 하는 적절 한 해당 세포를 보고 기억.개발 후, 이것은 확실히 그와 관련된 의료 역할에 관련 유기체를 탐구하는 기본 기능의 분야에서 연구를위한 방법을 포장. 이 비디오를 시청한 후에는 주미 시트 함수에서 양이나 품질, 용량, 현재 회원 또는 잠재력을 감지하는 방법을 잘 이해해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

샘플 간의 미토콘드리아 막 전위를 비교하면 세포 상태에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광을 사용하여 미토콘드리아를 분리하고 억제제 및 언커플러에 대한 반응을 평가하기 위한 자세한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 방법과 유용성은 세포 배양 및 세포 스트레스의 동물 모델을 사용하여 설명됩니다.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

드 노보 지방 생성 및 β - 지방산 산화는 간세포의 주요 대사 경로, 지방간 질환 등 여러 가지 대사 장애에 교란되는 경로를 구성한다. 여기에서 우리는 마우스 차 간세포의 분리를 보여와 β-지방산 산화 및 지방 생성의 정량화를 설명합니다.

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모델 유기체인 Caenorhabditis elegans에서 미토콘드리아 억제제의 효과를 생체 내에서 검출하고 잠재적인 강화 화합물을 식별하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 미토콘드리아 기능을 조절하는 화합물에 대한 약물 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

Screenable<em&gt; 생체</em&gt; 형질 전환 발광 생물을 사용 미토콘드리아 변조기에 대한 분석<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

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유기체 살충제에 노출된 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하기 위한 실험 프로토콜

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