유기체 살충제에 노출된 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하기 위한 실험 프로토콜

ATP 수준 및 산소 소비속도와 같은 분야의 기능에 있어 도의 주요 질문에 대한 답변을 요청하는 메서입니다. 새로운 또는 한 페이지 이전, 이 기술은 수행하기 쉽고 세포 미토콘드리아 기능의 특별한 평가를 위해 많은 것입니다. 이 실험을 시작하려면, 씨앗 20, 000 HepG2 세포 유리 바닥 페트리 접시에.

베타 헥사클로클로헥산 또는 B-HCH를 인큐베이터에 섭씨 37도, CO2 5%를 24시간 동안 추가합니다. DMEM 세포 배양 배지에 무수성 DMSO를 추가하여 1밀리머 미토콘드리아 녹색 형광 프로브 용액을 준비한다. 그런 다음 유리 바닥 페트리 접시의 세포에이 솔루션의 접시 당 1 밀리리터를 추가합니다.

그리고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 세포로부터 미토콘드리아 녹색 형광 프로브 용액을 제거한다. 섭씨 37도 DMEM 세포 배양 배지에서 갓 조리한 요리당 1밀리리터를 추가합니다.

미토콘드리아에서 녹색 형광을 검출하려면 공초점 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 세포 ATP의 수준을 평가하기 위해, 6 개의 잘 플레이트에서 20, 000 HepG2 세포에 종자. 베타 HCH를 추가하고 24시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.

각 웰의 셀에 200 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가합니다. 원심분리기는 섭씨 4도에서 5분간 12, 000배 G로, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 상퍼를 수집합니다. 플레이트에 100개의 마이크로리터 ATP 검출 버퍼를 추가합니다.

수집된 셀 상체 100마이크로리터를 실온에서 96웰 플레이트에 추가하고 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 발광계에 의한 세포 ATP를 검출하였다. 미토콘드리아 막 전위 평가를 위해, 이전에 설명한 바와 같이 베타-HCH를 첨가하여 6개의 웰 플레이트에서 HepG2 세포를 성장시킵니다. 섭씨 37도에서 1분 동안 0.5 밀리리터 0.25%EDTA로 소화하여 세포를 수집합니다.

소화를 멈추고 소화된 세포를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기려면 1밀리리터 DMEM을 추가합니다. 튜브를 1000회 G로 3분간 원심분리한 다음 상체를 폐기합니다. 세포 배양 배지의 0.5 밀리리터와 0.5 밀리리터 JC1 미토콘드리아 막 전위 염료로 세포 펠릿을 희석시키십시오.

그리고 섭씨 37도에서 20 분 동안 배양하십시오. 다음으로, 4°C에서 3분 동안 600회 G로 튜브를 원심분리한 다음 텍스트 프로토콜에 따라 세포 펠릿을 세척합니다. 씻은 펠릿을 원심분리한 후 상퍼를 제거합니다.

그리고 JC1 염색 버퍼의 0.5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 유동 세포분석을 통해 JC1 염색된 세포를 분석하여 녹색 및 적색 형광을 감지합니다. JC1 단조량체가 검출되면, 발산 광을 490 나노미터로 설정하고 방출 광을 530 나노미터로 설정합니다.

JC1 폴리머가 검출되면, 발광광을 525나노미터로 설정하고 방출광을 590나노미터로 설정한다. 산소 소비속도를 분석하기 위해, 종자 HepG2 세포는 96개의 잘 세포 배양 플레이트에 있는 밀도4, 500세포의 밀도당 100 마이크로리터당 잘 한다. 섭씨 37도에서 24시간의 배양 후 각 우물의 세포가 중간 크기로 덮여 있는지 확인하십시오.

OCR 소프트웨어를 실행하기 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 카트리지 및 세포 배양 판이 세포 외 플럭스 분석기로 마이크로 플레이트를 로드합니다. OCR 소프트웨어를 열고 앱에서 드롭 다운 메뉴에서 셀 미토 스트레스 테스트 키트를 선택하고 시작 앱 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 실행 응력 테스트 버튼을 클릭합니다.

세포 응력 테스트 화면이 나타나면, 세포 파종 번호 상자에서 잘 파종되는 셀 수와 기초 셀 OCR 상자의 평균 OCR을 입력합니다. 각 시약에 대한 최종 작업 농도를 입력한 다음 시약을 주입합니다. 다음 버튼을 클릭합니다.

그룹 정보 화면이 나타나면 색상을 선택하고 이름을 지정하여 할당되지 않은 우물에 그룹을 할당합니다. 그런 다음 적절한 우물을 클릭합니다. 다음 버튼을 클릭하고 나타나는 스트레스 테스트 주입 레이아웃 화면에서 분석기에서 스트레스 테스트를 실행하려면 시작을 클릭합니다.

실행이 완료된 후 소프트웨어의 프롬프트를 따라 카트리지와 셀 플레이트를 제거하고 버립니다. 미토콘드리아 녹색 형광 염색의 평균 강도는 베타 HCH에 노출된 HepG2 세포에서 감소하였다. 이는 미토콘드리아 수가 감소하고 미토콘드리아가 살충제 농도의 증가와 일치하는 손상된 미토콘드리아의 증가가 있음을 보여준다.

더욱이, HepG2 세포에 있는 ATP 수준은 베타 HCH 노출의 증가한 농도로 감소하, 이 세포에 있는 미토콘드리아의 감소된 기능을 보여주는. 미토콘드리아 막 전위 또는 MMP를 위한 JC1 염색 후, 유동 세포계는 그대로 HepG2 세포에서 높은 빨간색 녹색 JC1 형광을 보였다. 이것은 높은 MMP의 표시인 적색 형광 JC1 응집물의 존재 때문이었습니다.

베타-HCH로 치료된 세포에서, 적색 녹색 JC1 형광은 녹색 형광 JC1 단량의 존재로 인해 감소, 낮은 MMP의 표시. 마지막으로, 산소 소비율은 또한 베타-HCH 노출의 증가 농도와 함께 감소, 이 농약 적절 한 미토 콘 드리 아 기능을 손상 추가 보여주는. 아, 음, 이 절차를 시도, 그것은 중요 하지만, 그것을 테스트 하는 적절 한 해당 세포를 보고 기억.

개발 후, 이것은 확실히 그와 관련된 의료 역할에 관련 유기체를 탐구하는 기본 기능의 분야에서 연구를위한 방법을 포장. 이 비디오를 시청한 후에는 주미 시트 함수에서 양이나 품질, 용량, 현재 회원 또는 잠재력을 감지하는 방법을 잘 이해해야 합니다.