바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처

이 bio-layer interferometry 또는 BLI assay의 전반적인 목표는 정제된 hEAG1 이온 채널 단백질과 저분자 지질 간의 잠재적인 상호 작용을 측정하는 것입니다. 이 방법은 관심 분자가 이 이온 채널과 직접 상호 작용할 수 있는지 여부 및 상호 작용의 역학은 무엇인지와 같은 이온 채널 약리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 노동력이 없고 처리량이 많은 방법이라는 것입니다.

소량의 고정되지 않은 단백질만 필요합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 성공적인 분석에는 단백질 발현, 정제, 라벨링, 정확하게 조정된 센서 및 데이터 분석을 포함한 여러 단계가 포함되기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. hEAG1을 발현하는 HEK293 T 세포를 2-3일 동안 배양한 후 성장 배지를 제거하여 세포를 수확하고 4ml의 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다.

PBS를 폐기합니다. 세포를 접시당 2mL의 PBS로 스케이프하고 1ml 피펫을 사용하여 15ml 튜브로 세포로 이동합니다. 전지 현탁액을 중력의 420배와 섭씨 4도의 온도에서 5분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 상등액을 디캔팅하고 4ml의 용해 완충액을 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 현탁액을 얼음 위에서 30분 동안 배양하고 10분마다 용해물을 완전히 와류로 배양합니다. 다음으로, 10 분 동안 12의, 000배 중력 및 4 섭씨 온도에 세포 용해물을 분리기

그런 다음 상등액을 5ml 튜브에 옮기고 즉시 사용할 수 있도록 얼음 위에 보관하십시오. anti-FLAG M2 친화성 수지를 준비하려면 anti-FLAG M2 ffinity gel 병이 젤 비드의 균일한 현탁액인지 확인하기 위해 부드러운 반전으로 수지를 철저히 현탁시킵니다. 즉시 400마이크로리터의 현탁액을 냉각된 1.5ml 튜브에 옮깁니다.

다음, 30 초 동안 8의, 000배 중력 그리고 4 섭씨 온도에 현탁액을 분리기, 그리고 저장 완충기를 밖으로 씻기 위하여 주의깊게 상등액을 버리십시오. 수지 펠릿을 재현탁하려면 수지에 500마이크로리터의 단백질 추출물 상등액을 첨가하고 현탁액을 새로운 냉각된 5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 추가로 500마이크로리터의 단백질 추출물을 원래 튜브에 피펫팅하여 남아 있는 비드를 수집하고 추출물을 5ml 튜브로 옮깁니다.

쉐이커에서 8rpm과 섭씨 4도의 온도에서 혼합물을 하룻밤 동안 배양하여 FLAG 융합 단백질을 수지에 결합합니다. 다음, 1, 10 분 동안 4 섭씨 온도에 중력 1,000 시간에 혼합물을 분리기. 상등액을 버리고 펠릿을 500마이크로리터의 1 x PBS로 세 번 세척합니다.

즉시 사용할 수 있도록 얼음 위에 보관하십시오. 390마이크로리터의 PBS에 10마이크로리터의 3 x FLAG 용출 용액을 첨가하여 마이크로리터당 200나노그램의 최종 농도를 얻습니다. 그런 다음 400마이크로리터의 3 x FLAG 용출 용액을 이전에 준비된 겔 비드에 추가합니다.

진탕 인큐베이터에서 8rpm 및 섭씨 4도의 온도에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 8000배 중력에서 30초 동안 수지를 원심분리합니다. 상층액을 1.5밀리리터의 새 튜브에 옮기고 즉시 사용할 수 있도록 섭씨 4도에서 보관하십시오.

정제된 단백질의 농도를 측정하기 위해 제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 분석을 사용하십시오. 그런 다음 anti-Flag 항체와 함께 웨스턴 블롯 분석을 위해 30마이크로리터 샘플을 사용하여 관심 단백질이 정제되었는지 확인합니다. 정제된 단백질을 비오틴으로 라벨링하려면 PBS에서 밀리리터당 5mg의 비오틴 스톡 용액을 준비합니다.

두 개의 바이오센서를 검사할 때마다 정제된 단백질 20마이크로그램에 3배 이상의 비오틴을 추가하여 PBS에서 정제된 단백질의 바람직한 N-말단 비오틴화를 달성합니다. 얼음 위에서 어두운 곳에서 최소 30분 동안 샘플을 배양합니다. 결합되지 않은 비오틴과 완충액을 제거하려면 단백질을 SD 완충액으로 교환하십시오.

단백질을 분자가 30킬로달톤으로 절단된 한외여과 장치로 옮깁니다. 다음, SD 완충기를 추가하고 12의, 000배 중력 및 10 분 동안 4 섭씨 온도에 표본을 원심 분리하십시오. 원심분리기 튜브에서 한외 여과액을 제거합니다.

200마이크로리터의 SD 버퍼를 필터 장치에 추가하고 샘플을 다시 원심분리합니다. 이 과정을 최소 세 번 반복합니다. 여과 장치를 뒤집어 완충액 교환된 샘플을 수집하고 1.5ml 튜브에 넣습니다.

5 분 동안 2의, 000배 중력 및 4 섭씨 온도에 표본을 원심 분리하십시오. 즉시 사용할 수 있도록 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. BLI 분석을 수행하려면 연구 30분 전에 기기를 켜서 장비를 예열하십시오.

기기 상태 창을 확인하여 시작하기 전에 기계가 준비 상태인지 확인하십시오. 데이터 수집 소프트웨어를 열기 전에 기기의 도어가 닫혀 있는지 확인하고 실험 마법사에서 New Kinetics Experiment를 선택합니다. 96 well 플레이트에 사용할 wells를 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 buffer, load, s를 선택합니다. sample.

샘플 웰의 경우 PIP2의 농도 단위를 어금니로 입력해야 합니다. 분석 단계를 정의하려면 단계를 선택하고 해당 열을 두 번 클릭합니다. 분석 정의의 복제본은 제어 센서에 대해 설정됩니다.

rpm을 1, 000으로 설정합니다. 기준 단계로 1분을 선택하고 로드, 연결 및 분리에 대해 각각 5-10분을 선택합니다. 실온에서 테스트를 수행합니다.

센서가 포함된 열을 클릭하고 채우기를 클릭하여 센서 트레이에서 센서의 위치를 나타냅니다. 계획된 모든 단계를 검토하여 실수를 확인하고 다시 돌아가서 수정합니다. BLI 분석의 전체 작업에서 계획된 모든 단계를 검토하는 단계는 연구자에 의해 무시될 수 있습니다.

그러나 계획된 모든 단계가 올바른지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 데이터 파일의 위치를 설정하고 이동을 클릭하여 분석을 시작합니다. 분석을 실행하고 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다.

hEAG1을 안정적으로 발현하는 HEK293 T 세포에서의 이 패치 클램프 실험에서 볼 수 있듯이, 전압 의존적 외부 칼륨 전류는 기능적 hEAG1 채널이 세포에서 많이 발현됨을 시사합니다. anti-FLAG 항체를 사용하여 정제된 단백질 샘플에서 hEAG1의 이 웨스턴 블롯은 정제된 단백질의 품질과 특이성을 나타냅니다. 정제된 채널 단백질을 비오틴화하여 실시간 BLI 분석을 사용하여 지질 PIP2와의 상호 작용 분석을 수행했습니다.

hEAG1과 PIP2 사이의 일반적인 결합 곡선이 여기에 나와 있습니다. hEAG1은 농도 의존적 방식으로 PIP2에 바인딩됩니다. PIP2의 누적 농도는 바이오센서의 데이터 추적에 해당합니다.

이 대표적인 분석법은 PIP2의 다양한 농도에서 광학 간섭의 변화를 보여줍니다. 마지막으로, 서로 다른 PIP2 농도에서 측정된 광학 간섭 신호의 피크 값에서 Hill 방정식을 사용한 곡선 맞춤을 얻고 hEAG1과 PIP2 사이의 평형 해리 상수를 결정했습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 1시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때 이 절차가 올바른지 확인하기 위해 계획된 모든 단계를 검토하는 것을 기억하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차에 따라 작은 분자에 결합한 후 이 이온 채널의 기능을 식별하는 것과 같은 추가 질문에 답하기 위해 패치 클램프와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 이온 채널의 리간드 스크리닝 분야의 연구자들이 이온 채널 약물 발견에서 새로운 리간드를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 BLI 분석법을 사용하여 이온 채널 단백질을 준비하는 방법과 소분자와의 상호 작용을 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.