4: 밀도 그라데이션 초원심분리

밀도 그라데이션 극심분리는 생체 분자및 세포 구조를 분리하고 정화하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다. 이 기술은 서스펜션에서 용매보다 밀도가 높은 입자가 퇴적물일 것이고, 밀도가 떨어지는 입자가 떠다니는 다는 사실을 악용합니다. 고속 초원심분리기는 원심분리관에서 밀도감소의 액체를 겹쳐서 확립할 수 있는 밀도 그라데이션 내에서 생체분자를 분리하기 위해 이 과정을 가속화하는 데 사용된다.

이 비디오는 샘플 준비, 자당 그라데이션 생성, 초원심 분리 및 분획된 별문 컬렉션을 보여주는 절차를 포함하여 밀도 그라데이션 초원심 분리의 원리를 다룹니다. 응용 분야는 다중 단백질 복합체의 분리, 핵산 복합체의 분리, 세슘 염화물 밀도 그라데이션을 사용하여 분리에 대해 설명합니다.

밀도 구배 초원심분리는 생화학 실험을 위해 세포 구조를 분리하고 정제하는 일반적인 접근 방식입니다. 이 기술은 고속 또는 초경량 원심분리기를 사용하여 밀도 구배에서 세포 구성 요소를 비파괴적으로 분리합니다. 이 동영상은 밀도 구배 초원심분리의 원리를 설명하고, 자당 구배를 사용하는 일반적인 절차를 제공하며, 몇 가지 응용 분야에 대해 설명합니다.

먼저 초원심분리기와 밀도 구배의 원리를 살펴보는 것으로 시작하겠습니다. 현탁액은 액체 용매에 입자를 포함합니다. 중력 때문에 용매보다 밀도가 높은 입자는 침전물이 나오고 용매보다 밀도가 낮은 입자는 떠다닙니다. 입자와 용매 사이의 밀도 차이가 클수록 분리 속도가 빨라집니다.

초원심분리기에는 로터라고 하는 장치가 포함되어 있으며, 이 장치는 고도로 제어된 속도로 회전하여 강한 중력장을 시뮬레이션합니다. 이 필드 내에서 입자와 용매 사이의 밀도 차이가 확대됩니다.

필드의 강도는 회전 속도에 따라 다릅니다. 상대적으로 낮은 회전 속도의 작은 회전자조차도 지구의 중력장보다 수천 배 더 강한 힘을 생성할 수 있습니다.

튜브에 밀도가 다른 여러 액체가 포함되어 있는 경우 원심분리는 밀도 순으로 액체를 별도의 층으로 유지하고 가장 밀도가 높은 액체가 베이스에 가장 가깝습니다. 이러한 여러 액체의 층을 "밀도 구배"라고 합니다. 두 가지 유형이 있습니다. 계단식 구배에서는 밀도가 감소하는 액체가 서로 조심스럽게 겹쳐집니다. 연속적인 구배에서는 액체가 다양한 비율로 혼합되므로 밀도가 바닥에서 위쪽으로 부드럽게 감소합니다.

세포 소기관은 "isopycnic density-gradient centrifugation"을 통해 계단식 구배를 사용하여 분리할 수 있습니다. 이것은 가장 간단하고 일반적인 원심분리 절차입니다.

이 절차는 세포 구조를 분리하는 데 사용됩니다. 세포 소기관이 조밀할수록 더 멀리 내려갑니다 - 미토콘드리아는 위쪽에, 핵산은 아래쪽에 있습니다.

이제 이 기법의 원리를 알았으니 실험실에서 확인해 보겠습니다.

절차를 시작하기 전에 제조업체의 속도 및 밀도 등급을 기록하고 초원심분리기의 부식 여부를 확인해야 합니다. 이 절차는 스윙 버킷 로터를 사용합니다.

첫째, 세포 물질은 세포를 균질화하여 준비되며, 이는 세포소기관을 비파괴적으로 방출합니다. 균질산염은 저밀도 성분을 제거하기 위해 예비 저속 원심분리를 통해 분별할 수 있습니다. 다음으로, 자당 용액을 준비합니다.

자당은 점점 더 많은 양으로 첨가되므로 각 용액은 이전 용액보다 더 농축되어 밀도가 높아집니다. 용액의 정확한 밀도는 분리할 구성 요소에 따라 달라지며, 이는 유기체마다 다릅니다. 용액은 분리할 성분의 밀도 사이에 밀도가 있어야 하며, 마지막 용액은 분석물의 가장 밀도가 높은 성분보다 밀도가 높아야 합니다. 핵산과 같이 자당보다 밀도가 높은 성분을 분리하는 기술이 응용 프로그램에 설명되어 있습니다.

이제 깨끗한 원심분리기 튜브에서 자당 그래디언트가 생성됩니다. 피펫은 가장 농축 된 자당 용액을 추출하는 데 사용됩니다. 튜브를 똑바로 세운 상태에서 피펫 팁을 벽에 높게 놓고 액체를 꾸준히 아래로 분배합니다. 작업 영역에 진동 및 기타 방해 요소가 없는 것이 중요합니다.

팁을 교체한 후 나머지 용액은 밀도가 감소하는 순서로 추가됩니다. 그들은 뚜렷한 층을 형성하고 혼합을 피하기 위해 조심스럽게 분배됩니다. 마지막으로, 약 50 밀리리터의 세포 샘플을 구배(gradient) 위에 추가하고 튜브의 무게를 측정합니다. 이것은 프로세스의 다음 단계인 중량 분포의 균형을 맞추는 데 사용됩니다.

원심분리는 가능한 한 빨리 시작해야 합니다. 튜브는 로터에 배치된 다음 반대쪽 슬롯에 동일한 무게의 빈 용액을 배치하여 균형을 이룹니다. 로터는 초원심분리기에 배치되고 시스템이 밀봉됩니다. 온도와 회전 속도 및 시간이 설정됩니다. 일반적인 값은 4입니까? C 16시간 동안 100,000 x g 이상의 힘으로 .

원심분리 후 튜브를 로터에서 빼내고 똑바로 세우고 방해받지 않도록 주의합니다. 서로 다른 세포 구성 요소는 용액 층 사이의 개별 띠로 분별되었습니다. 분획은 주사기로 수집할 수 있습니다. 또는 튜브의 바닥을 미세하고 멸균된 바늘로 구멍을 뚫고 멸균 튜브에 모인 유출물을 만들 수 있습니다. 이제 세포 구성 요소가 분리되었습니다. -80 ?C에서 저장할 수 있습니다.

이제 기본 절차를 보았으므로 몇 가지 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.

일반적인 응용 분야는 식물 세포에서 다중 단백질 복합체를 분리하는 것입니다. 이 예에서는 순환 전자 흐름을 담당하는 복합체가 광합성에서 광 반응 부위인 틸라코이드에서 분리되고 있습니다. 이 절차는 14 내지 45% 자당의 개별 용액을 사용합니다. 원심분리는 100,000 x g 이상에서 4 °C에서 14시간 동안 발생합니다.

핵산은 자당보다 밀도가 높기 때문에 동피CNIC 원심분리는 핵산을 세포소기관에서 비파괴적으로 분리할 수 없습니다.

"rate-zonal centrifugation"으로 알려진 다른 기술이 사용됩니다. 그것은 침강 속도에 따라 소기관을 분리하며, 이는 밀도뿐만 아니라 형태에 따라 달라집니다. 연속 그래디언트는 이 속성을 기반으로 구성 요소를 분리하는 데 사용됩니다.

절차 단계는 isopycnic 사례의 단계와 유사합니다. 이 예에서 RNA-리보솜 복합체는 230,000 x g에서 원심분리된 5%에서 20%의 연속 그래디언트를 사용하여 분리됩니다. 원심분리는 동시 침전을 방지하기 위해 몇 시간 후에 중단됩니다.

핵산 가닥은 밀도에 따라 서로 분리될 수 있습니다.

이는 구아닌과 시토신이 풍부한 가닥이 아데닌과 티아민이 풍부한 가닥보다 밀도가 높기 때문입니다. 이 경우, 자당은 핵산보다 밀도가 낮기 때문에 구배를 자당으로 만들 수 없습니다. 대신, 일반적으로 1.65 - 1.75 g/mL의 염화세슘 구배가 사용되는데, 이는 충분한 밀도와 낮은 점도를 갖기 때문입니다.

여기에서 우리는 플랑크톤 DNA가 연속적인 염화 세슘 구배를 사용하여 정제되는 것을 볼 수 있습니다. 원심분리는 진공 상태에서 18시간 동안 1,000,000 x g 이상에서 발생합니다.

방금 자당 밀도 구배를 사용한 초원심분리에 대한 JoVE의 비디오를 시청했습니다. 이제 밀도 구배가 작동하는 방식, 계단 구배를 구성하는 방법, 초원심분리기를 로드하고 작동하는 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!