포토메트릭 단백질 결정

샘플에서 단백질의 농도를 측정하는 것은 많은 생화학 분석에서 기본 단계입니다. 측광 측정은 작은 표본 크기로 수행할 수 있습니다. 샘플에 빛을 흡수하는 물질이 많이 포함되어 있을수록 샘플을 통해 투과되는 빛이 줄어듭니다. 이것은 흡수 물질의 정량적 측정을 제공합니다. 이러한 개념은 과학에 매우 근본적이어서 두 가지 기술을 소개한 기사는 역사상 가장 많이 인용된 세 편의 논문에 포함되어 있습니다. 이 비디오는 가장 일반적인 측광 단백질 측정 기법 중 일부의 개념, 수행 방법 및 수집된 데이터를 분석하는 방법을 보여줍니다.

광도 측정 단백질의 측정은 농도와 광 흡수성 간의 관계를 기반으로 합니다. 이것은 Beer-Lambert 법칙으로 알려져 있으며, 이는 빛을 흡수하는 종의 농도가 흡수도에 비례한다는 것을 나타냅니다.

이 원리는 모든 측광 단백질 측정 방법의 기초가 됩니다.

직접 흡수 분석을 위해 변경되지 않은 단백질 샘플의 흡광도 값을 측정합니다. 방향족 측쇄로 인해 트립토판과 티로신 잔기는 280nm의 파장에서 가장 높은 흡광도 판독값을 제공합니다.

그러나 단백질에서 가장 드물게 발견되는 두 가지 아미노산은 모든 단백질에 다른 양으로 존재하므로 각 결정은 고유합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 이러한 아미노산에 의존하지 않는 보다 복잡한 분석법이 개발되었습니다.

한 가지 예는 유색 염료를 샘플에 첨가하는 Bradford Assay입니다. Coomassie Blue로 알려진 염료는 단백질이 많을수록 염료와의 결합 이벤트가 더 많아집니다.

그런 다음 594nm에서 빛을 흡수하는 결합된 Coomassie Blue 염료의 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 측정합니다. 그러나 Bradford 분석은 짧은 범위의 농도에서 선형이므로 분석 전에 희석이 필요한 경우가 많습니다.

Lowry Method는 펩타이드 결합과 반응하는 구리 이온의 알칼리성 용액인 Biuret 시약과 방향족 단백질 잔류물을 산화시키는 Folin-Cioc?lteu 시약을 결합합니다. 샘플의 결과 색상 변화는 단백질 농도에 비례합니다.

환원된 폴린 시약의 흡광도는 750nm에서 측정할 수 있습니다. 직접 흡수와 마찬가지로 각 단백질은 고유한 반응을 가지고 있으며 관심 단백질에 맞게 보정해야 합니다. 지금까지 가장 일반적인 몇 가지 분석의 기본 원리를 살펴보았으므로 이제 직접 흡수와 Bradford 분석이 어떻게 수행되는지 살펴보겠습니다.

직접 흡수 분석을 시작하기 위해 분광 광도계는 제로 흡광도를 결정하기 위해 블랭크로 보정됩니다. 검량선을 생성하는 데 사용할 수 있도록 표준 용액이 준비되어 있습니다. 그런 다음 첫 번째 표준물질의 분취액을 큐벳에 추가하고 분광 광도계에 넣습니다.

그런 다음 280nm에서의 흡광도 값이 기록됩니다. 이 프로세스는 각 실행에 대해 깨끗한 큐벳을 사용하여 각 표준에 대해 반복됩니다. 완료되면 흡광도 대 농도를 표시하여 검량선이 생성됩니다. 이 선의 기울기는 몰 감쇠 계수이며, 이는 흡광도와 농도와 관련이 있습니다.

다음으로, 미지의 샘플을 큐벳에 추가하고 흡광도 값을 기록합니다. 서로 다른 측광 측정 방법에 대한 데이터 분석이 유사하기 때문에 Bradford 분석을 살펴본 후 이에 대해 다루겠습니다.

여기에서 Bradford 단백질 분석은 96웰 플레이트에서 BSA 표준물질로 수행됩니다. 먼저, BSA 재고 솔루션이 준비되었습니다.

미지의 용액은 농도가 분석 범위 내에 있는지 확인하기 위해 탈이온수로 희석됩니다. 키트에 따라 Coomassie 염료도 희석이 필요할 수 있습니다. 그런 다음 96웰 플레이트에 BSA 표준을 추가하여 검량선을 설정합니다.

표준 곡선을 생성하는 데 필요한 농도에 도달하기 위해 탈이온수를 첨가합니다. 정확한 측정을 보장하기 위해 알 수 없는 샘플을 플레이트에 세 번 추가해야 합니다. 다음으로 Coomassie 염료를 각 웰에 첨가하여 피펫과 혼합합니다.

탈이온수를 빈 우물에 블랭크로 첨가하여 흡광도를 측정합니다. 염료가 결합할 때까지 5분 동안 기다린 후 590nm의 플레이트 리더에서 흡광도를 측정합니다.

이제 몇 가지 분석을 수행했으므로 데이터를 분석하는 방법을 살펴보겠습니다. 각 광도 측정 단백질 측정 방법은 Beer-Lambert 법칙을 기반으로 합니다.

표준물질의 측정된 흡광도는 보정 곡선을 생성하는 데 사용되며, 이는 미지 샘플의 농도를 결정하는 데 사용됩니다. 이 곡선은 수동으로 표시할 수 있지만, 모든 표준물질이 측정되면 최신 분광광도계 도구가 검량선을 생성합니다. 이 시스템은 또한 알려지지 않은 샘플이 분석될 때 단백질 농도를 계산합니다.

지금까지 측광 단백질 측정 데이터를 분석하는 방법을 살펴보았으므로 이제 이러한 절차를 활용하는 몇 가지 방법을 살펴보겠습니다.

측광 단백질 측정의 원리는 핵산 농도를 직접 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 나노드롭 분광 광도계는 매우 작은 부피의 샘플을 광학 활성 받침대에 수용합니다. 그런 다음 흡광도를 측정하고 시스템이 자동으로 핵산 농도를 결정합니다. 단백질 및 기타 소스가 측정을 방해할 수 있기 때문에 260 - 280 nm 및 260 - 230 nm 흡광도 비율을 분석하여 시료 순도를 측정합니다. 순수 핵산은 일반적으로 DNA와 RNA에 대해 각각 약 1.8 및 약 2.0의 비율을 산출합니다.

광도 단백질 측정은 특정 세포 반응을 유도하기 위해 자연에서 영감을 얻은 생체 모방 물질의 생산에도 사용할 수 있습니다. 재조합 부착물은 폴리스티렌 비드에 결합되어 숙주 세포에 대한 박테리아 부착을 시뮬레이션합니다. Bradford 분석은 생체 모방 물질 생산에서 비드에 대한 재조합 접착력의 결합 효율을 측정하는 데 사용됩니다.

대체 광도 측정 단백질 분석은 단백질 항균제의 검출 및 특성화에 사용할 수 있습니다. Remazol brilliant blue R 염료는 열에 의해 죽은 박테리아에 공유 결합됩니다. 단백질 항균제는 염색된 용액에서 배양됩니다. 그런 다음 샘플을 원심분리하고 595nm에서 상등액의 흡광도를 마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 측정합니다. 표지된 박테리아에서 상등액으로 방출되는 용해성 염료에 의한 흡광도 증가는 효소 활성의 정량적 측정입니다.

광도 측정 단백질 측정에 대한 JoVE의 비디오를 시청하셨습니다. 이 비디오는 측광 측정의 기본 원리를 설명하고, 몇 가지 일반적인 분석에 대한 일반적인 절차를 살펴보고, 기술의 몇 가지 새로운 발전을 다루었습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!