3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

이 절차의 전반적인 목표는 협력성과 같은 상관 상호 작용에 중점을 두고 복잡한 단백질 시스템의 역학을 정량적으로 연구하는 것입니다. 이 방법은 단백질 복합체와 이들의 동적 상호 작용이 매우 중요한 정량 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동적 다색 단일 분자 FRET를 생물학적으로 관련된 시스템에 적용할 수 있다는 것입니다.

플로우 챔버를 조립하기 전에 40미크론 두께의 투명 접착 필름의 흐름 채널을 절단하고 필름의 비접착 면에 빠른 고정 접착제를 분사하고 접착제가 건조되도록 합니다. 플로우 챔버 조립을 시작하려면 3mm 두께의 PEG 비오틴, PEG, 입구 및 출구 구멍이 있는 PEG, 기능화된 융합 석영 슬라이드를 얻습니다. 천장 필름의 스프레이 접착제 코팅된 면을 슬라이드의 기능화된 면에 바르고 채널을 입구 및 출구 후크와 정렬합니다.

핫 플레이트에서 슬라이드를 섭씨 80도까지 1분 동안 가열합니다. 압력을 고르게 분산시키기 위해 추가 현미경 슬라이드를 사용하여 30초 동안 필름을 슬라이드에 누릅니다. 그런 다음 어셈블리를 1분 동안 식히십시오.

접착제를 덮고 있는 보호 시트를 벗겨냅니다. 노출된 접착제에 커버 슬립을 놓아 플로우 챔버를 형성합니다. 챔버를 섭씨 80도로 1분 동안 가열합니다.

커버 슬립을 접착제에 30초 동안 눌러 챔버를 밀봉하고 조립된 챔버를 냉각시킵니다. 프리즘 위에 플로우 챔버를 배치하기 전에 프리즘 면에 글리세롤 한 방울을 바르십시오. 플로우 챔버를 멀티 컬러 프리즘 유형 TIRF 현미경용 홀더에 장착합니다.

완료되면 입구와 출구 튜브를 연결합니다. 3가지 색상 측정을 위한 기기 구성을 시작하려면 전자 증식 CCD 카메라 소프트웨어를 열고 EMCCD 센서를 가능한 가장 낮은 온도로 설정합니다. 카메라 수직 이동 속도를 3.3마이크로초로 설정하고, 일반 수직 클럭 전압을 선택하고, 수평 판독 속도를 16비트에서 17밀리헤르츠로 설정하고, 사전 증폭 이득을 3으로, 전자 증배기 이득 수준을 1000으로 설정합니다.

외부 획득 트리거링을 선택합니다. 노출 시간을 70밀리초로 설정합니다. 그리고 동영상 녹화 시간은 750 획득 주기입니다.

측정 파일을 저장할 새 폴더를 만듭니다. EMCCD 소프트웨어에서 자동 저장을 활성화하고 동영상 프레임 파일 형식을 TIFF로 설정합니다. 자동 저장 파일 경로를 새로 생성된 폴더로 설정합니다.

그런 다음 음향 광학 조정 가능 필터, 레이저 제어 소프트웨어 및 레이저, AOTF, 광학 셔터 및 카메라를 동기화하는 트리거 소프트웨어를 제어하는 소프트웨어를 엽니다. AOTF를 사용하여 프리즘에 들어가기 전에 레이저 출력을 약 3밀리와트로 조정합니다. 교대 레이저 여기를 위해 모든 장치를 동기화하는 트리거링 패턴을 로드한 다음 기기에 샘플 홀더를 장착합니다.

주입 튜브의 끝을 실험 버퍼가 들어 있는 미세 원심분리기 튜브에 놓습니다. 배출 튜브를 주사기 펌프 세트에 연결하여 인출 모드로 설정합니다. 150마이크로리터의 버퍼로 챔버를 세척합니다.

CCD 카메라를 기능화된 인터페이스에 초점을 맞추고, 여기 빔과 표백제 형광 오염 물질을 정렬합니다. 그런 다음 300 μl의 0.25 milligram per millil deglycosylated avidin 용액을 흘려 챔버에 완충시키고 1 분 동안 배양합니다. 완충액을 사용하여 챔버에서 결합되지 않은 탈글리코실화된 아비딘을 플러시합니다.

그런 다음 BSA 농도가 밀리리터당 0.5mg인 300마이크로리터의 버퍼를 챔버를 통해 흘려보내 표면 기능화 결함을 차단합니다. 다음으로, 충분한 표면 밀도가 달성될 때까지 Hsp90 농도가 증가할 때까지 BSA에 비오틴화 형광 표지된 Hsp90 150마이크로리터 부분의 바이오틴화 형광 표지 Hsp90을 플로우 챔버에 로드합니다. 챔버에서 결합되지 않은 단백질을 300마이크로리터의 BSA 함유 완충액으로 세척합니다.

라벨이 지정된 AMP-PMP 및 BSA가 함유된 완충액의 25나노몰 용액 150마이크로리터를 챔버에 넣고 5분 동안 배양합니다. 로딩과 배양을 한 번 반복합니다. 그런 다음 Piezo stepper를 사용하여 샘플 챔버를 여기 빔에 수직으로 이동하여 원하는 대로 시야를 변경합니다.

필요한 경우 이미지 초점을 조정합니다. 그림과 같이 신호 찍기 버튼을 클릭하여 카메라 소프트웨어에서 카메라 녹화를 시작합니다. 트리거 소프트웨어에서 여기 수집 주기를 시작하여 데이터 수집을 시작합니다.

데이터 분석을 시작하려면 분석 소프트웨어를 열고 두 카메라의 녹화된 동영상을 가져옵니다. trace 찾기를 클릭하여 잠재적인 단일 분자에 해당하는 형광 강도 traces를 확인합니다. 각 분자에 대해 동일한 excitation color를 가진 해당 spot의 모든 traces의 합을 계산합니다.

모든 채널에서 Joint Raw Intensity의 대략 평평한 고원과 모든 여기 색상에 대한 단일 표백 단계에 대한 강도 프로파일을 평가합니다. 적절한 검출 채널에서 상관 방지 동작과 추적에서 적색 형광이 발생하는지 확인합니다. 모든 기준이 충족되면 추가 분석을 위해 형광 흔적을 저장합니다.

표시된 분자만 이 예시의 기준을 충족합니다. 평평한 안정 상태가 없거나, 상관 관계 방지가 아닌 깜박이는 이벤트를 표시하거나, 여러 표백 단계가 있는 추적을 제외합니다. 미량 선택은 모든 단일 분자 기술에서 중요한 단계입니다.

잘 정의된 기준을 충족하는 추적만 선택해야 합니다. 여기서 이러한 기준은 상관 관계 방지, 단일 표백 단계 및 평평한 고원입니다. 다음으로, 저장된 분자를 차례로 표시하고 한 세트의 강도 추적은 모든 4층이 이미 표백된 시간 간격을 선택합니다.

이 시간 간격에 대한 빔 배경 강도를 계산한 다음 Hsp90의 두 염료가 모두 존재하는 FRET 효율 범위를 선택하고 깜박이는 이벤트가 있는 트레이스를 제외해야 합니다. 부분 형광 트레이스를 계산합니다. 트레이스에서 신호 대 잡음비가 낮은 분자를 제외합니다.

다음으로, 부분 형광 데이터의 바인딩 2D 투영을 생성하고 상대 인구 계산 도구를 시작합니다. Init를 클릭합니다. 관심 있는 피크 주위에 폴리곤을 그립니다.

그리고 count를 클릭하여 해당 피크에 대한 상대적 인구를 계산합니다. 부분 형광 데이터의 3D 히스토그램을 생성하고 히스토그램을 정규화합니다. 3D 가우스 피팅에 대한 초기 파라미터를 초과하고 파라미터 벡터의 끝에 state populations를 추가합니다.

데이터를 피팅하고 결과를 표시합니다. 3D 부분 형광 공간에서 각 상태의 위치와 너비를 정의한 후 Hidden Markov Model 인터페이스를 초기화합니다. 적절한 상태 개수, 입력 신호의 차원 개수, 입력 유형을 선택합니다.

HMM 파라미터를 최적화하여 전이 확률에 대한 최대우도 추정량을 결정합니다. 데이터 서브셋에 대해 모집단 선택, 피팅 및 HMM 최적화를 반복합니다. 마지막으로, 전이 확률에 대한 신뢰 구간을 계산하고 보존 상태를 축소하여 추가 분석을 위해 데이터를 단순화합니다.

Hsp90 단백질의 구조적 상태는 표지된 리포터 뉴클레오티드 AMP-PMP의 존재 하에서 3색 단일 분자 FRET로 연구되었습니다. 5개의 구조적 상태는 형광 강도에 의해 구별될 수 있었고 그 중 4개는 기능적으로 구별되었습니다. 3색 단분자 FRET를 통해 3D 공간에 걸친 부분 형광 데이터를 얻을 수 있었습니다.

실험 조건에서 이론적으로 예상되는 모든 상태는 2D 투영에서 부분 형광으로 구별할 수 있으므로 상태를 분리하는 데 도움이 되도록 2D 투영이 사용되었습니다. 이러한 상태의 상대 모집단은 2D 투영에서 결정되었으며 3D 가우스 피팅에 대한 제약 조건으로 사용되었습니다. 후속 앙상블 3D HMM 최적화 및 모델링을 통해 추출된 상태 전이 확률을 제공했습니다.

추출된 각 비율 상수에 대해 신뢰 구간을 계산했습니다. 추가로 250 마이크로몰의 표지되지 않은 AMP-PMP가 있는 상태에서 실험을 반복하여 Hsp90 이량체의 두 번째 결합 부위에 대한 하나의 뉴클레오티드 결합의 영향을 규명했습니다. 결합 및 결합되지 않은 형태를 축소하면 레이블이 지정되지 않은 추가 AMP-PMP의 유무에 따라 Hsp90에서 형광 AMP-PMP 해리에 대한 평균 체류 시간을 계산할 수 있었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 다색 FRET 및 TIRF 현미경을 사용하여 동적 단백질 시스템에서 운동 정보를 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 생명 과학 분야의 연구자들이 다중 단백질 시스템에서 상관 상호 작용을 결정할 수 있는 길을 열어줍니다. 이것은 협력과 같은 근본적인 규제 메커니즘에 대한 더 깊은 이해를 위해 중요합니다.