Name: 3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 학습하세요 3색 단일 분자 FRET 기술을 사용하여 복잡한 단백질 시스템의 동역학을 정량적으로 연구하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 협력성 및 상관된 상호작용을 분석하여 생물학적 시스템에서 단백질 역학을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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이 작품은 독일 연구 재단 (INST 39/969-1)와 ERC 부여 계약 n. 681891 통해 유럽 연구 위원회에 의해 자금을.

1. 설치 및 필수 구성 요소
<ol><li>프리즘 형 TIRFM에 멀티 컬러 smFRET 측정을 수행 합니다. 2 색상 설정의 설명 정돈 간행물 주어진 대로12참조.<ol>
<li>멀티 컬러 TIRFM 생성 합니다. 일반 레이아웃은 9에 상세 하다.</li>
		<li>사용 전환, 다이오드 여기 경로 있는 기계적인 셔터의 사용을 불필요 한 렌더링 솔리드 스테이트 연속파 레이저를 펌핑.</li>
		<li>목표 입력을 후면에서 여기 광선의 후면 반사를 방지 하는 비대칭, 길쭉한 프리즘을 사용 합니다.</li>
		<li>2 인치 색 비구 융합 된 실리 카 렌즈를 사용 하 여 최대한 많은 빛을 수집 하 고 자동 형광 및 착오, 예를 들어, 중앙 지역에는 이미지의 왜곡을 방지 하는 검색 경로 있는.</li>
		<li>별도 렌즈를 가진 EMCCD의 칩에 초점을 각 검색 경로. 각 탐지 채널의 최적의 초점을 맞추고 있습니다. 주의: 클래스 3B 레이저는 TIRFM에 사용 됩니다. 즉, 그들은 위험한 경우는 눈에 직접 노출 확산 반사 유해 하지 않습니다. 시스템을 운영 하기 전에 지방 정부 규정에 따라 안전 조치 준수 레이저를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미리 dsDNA 샘플을 사용 하 여 설치 및 fluorophore 속성에 대 한 보정 요소를 결정 합니다.<ol>
<li>각 염료 조합에 대 한 하나의 높은 무서 워 dsDNA 샘플을 사용 하 여 긴 여기 파장을 갖는 수락자와 (제시 설치: Atto488-Atto647N, Atto550 Atto647N, Atto594-Atto647N). DNA는 biotin과 수정 또한 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>5 샘플을 희석 nM TNM 버퍼 (5 mM Tris pH 7.5, 5 m m NaCl, 20 mM MgCl2)와 2 mM Trolox (이 버퍼 사용도 측정).</li>
		<li>Hsp90 2.5, 2.7 단계에 설명 된 대로 dsDNA를 무력화.</li>
		<li>명백한 누설 (lk)와 수락자 표백 이벤트를 표시 하는 단일 분자 추적에서 명백한 감마 (ag)에 대 한 보정 요소를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>못/비오 틴-말뚝 세 석 영 슬라이드의 샌드위치는 흐름 챔버, 접착 면에 커버 슬립은 박막을 생성 합니다. 석 영의 청소에 대 한 세부 프로토콜에 대 한 슬라이드와 패 시 베이 션 참조9을 참조 하십시오.<ol>
<li>사용 두께 (3mm) 석 영 기하학적으로 프리즘 및 기능성된 석 영 슬라이드 사이의 석 영 석 영-글리세롤 인터페이스에서 흩어져 레이저 빛의 수집을 방지 하기 위해 슬라이드.</li>
		<li>한 얇은 (40 µ m)를 사용 하 여 씰링 접착 비 접착 면에 분무는 영화. 박막 표면에 부착 된 분자와 목표 사이 거리를 감소 시킨다. 80 ° C에가 열 하 고 누릅니다.</li>
		<li>상단에 커버 슬립을 놓습니다. 80 ° C에가 열 하 고 누릅니다. 프리즘을 통해 흐름 챔버를 배치할 때 글리세롤의 방울을 사용 합니다. 참고: 글 리세 린 뿐만 아니라 프리즘 및 석 영 슬라이드 자료는 일치 하는 인덱스.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hsp90 D61 또는 Q385 위치에서 두 명의 단일 시스테인 점 돌연변이의 형태로 Saccharomyces cerevisiae 에서 표현 한다. Picomolar 농도에서 이합체의 분리를 방지 하기 위해 C 터미널 코일 코일 모티브를 추가 합니다. 별도로 돌연변이 단백질을 분류 하 고 단위체 아미노산 위치 61에서 Atto488와 Atto550 아미노산 위치 3859에서 표시 하는 heterodimers를 교환 한다.</li>
</ol>2입니다. 측정
<ol><li>카메라 소프트웨어를 시작 하 고 아래 지정 된 대로 이미지 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>가능 (외부 물 냉각을 가진-95 ° C) 낮은 어두운 전류 잡음 감소를 냉각 하는 센서에 대 한 온도 설정 합니다.</li>
		<li>최적화 된 카메라 설정을 사용 하 여 단일 분자 기록: 3.3 µs 수직 이동 속도, 정상적인 수직 시계 전압, 17의 16-비트 수평 읽어, 사전 증폭 이득 3, 전자 증 1000의 이득.</li>
		<li>750 수집 사이클의 길이와 "외부"를 수집 하 고 70 양 기록 영화 노출 시간의 발생을 설정 합니다. 참고: 카메라는 EMCCD 센서의 포화를 방지 하기 위해 취득 하는 때 방 빛을 해제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>측정에 대 한 로컬 SSD에 대 한 폴더를 만듭니다. 소프트웨어에서 설정 &lt; 자동 저장 &gt; 라이더, &lt; 자동 저장 &gt; 활성화 이동한 "Tiff" 영화 수집을 위한 파일 포맷을 선택 합니다. 자동 저장 위치는 SSD에 폴더를 선택 합니다.</li>
	<li>검색 경로, 및 카메라에서 셔터 제어 acousto 광학 가변 필터 (AOTF), 레이저의 작동을 제어 하는 소프트웨어와 레이저, AOTF, 동기화 트리거 소프트웨어 소프트웨어를 시작 합니다. AOTF (ca. 3 mW 프리즘에 들어가기 전에)와 레이저 파워를 조정 하 고 올바른 트리거 패턴을 로드.</li>
	<li>프리즘와 흐름 챔버 샘플 홀더 탑재, 튜브를 연결, 입구 배관 microcentrifuge 컵에 놓고 주사기 펌프 출구 튜브를 연결 합니다. 약 150 µ L 버퍼와 챔버를 플러시, 여기를 정렬 광선과 초점. 약 10의 레이저 파워 슬라이드의 완전 한 감지 범위를 따라 천천히 이동 하 여 표면에 어떤 형광 오염 물질을 표백 모든 레이저에 대 한 mW. 이 약 1 시간 걸립니다. 참고: 그렇지 않으면 다르게 진술, 사용된 버퍼 포함 40 mM HEPES pH 7.5, 150 m KCl, m 그리고 10 mM MgCl2합니다.</li>
	<li>실로 NeutrAvidin 솔루션 (버퍼에서 0.25 mg/mL)의 약 300 µ L을 플러시 하 고 챔버를 통해 BSA 솔루션 (버퍼에서 0.5 mg/mL)의 1 분 버퍼와 플러시 약 300 µ L와 언바운드 NeutrAvidin 밖으로 플러시에 대 한 품 어. 참고:이 블록 표면 기능화 남은 표면에 BSA의 불특정 흡착에 의해 결함.</li>
	<li>biotinylated의 대략 150 µ L와 흐름 챔버 로드 하 여 샘플을 무력화와 상승 농도 (버퍼 + 0.5 mg/mL BSA에 희석) Hsp90 표시는 일반적으로 농도에 경우 충분 한 표면 밀도 도달할 때까지 5-10 오후. 약 300 µ L 버퍼 + 0.5 mg/mL BSA 언바운드 단백질 세척 한다.</li>
	<li>25의 150 µ L에 플러시 앰프 PNP nM * 버퍼 + 0.5 mg/mL BSA. 그것은 5 분 동안 품 어 정확한 뉴클레오티드 농도 보장 하기 위해이 단계를 한 번 반복 하자. 참고: 추가, 레이블 없는 앰프 PNP 존재 실험, 또한 추가 250 µ M 앰프 PNP.</li>
	<li>데이터 수집으로 시작 합니다. 데이터의 적절 한 금액에 대 한 약 1.5 시간 걸립니다 약 20 영화 취득.<ol>
<li>보기의 필드를 변경 하려면 피 스테퍼와 여기 빔에 수직인 샘플 챔버의 위치를 이동 합니다.</li>
		<li>필요한 경우는 목표의 높이 제어 하는 z-피와 초점을 조정 합니다. 이 해서는 안됩니다 필요한 측정 챔버 성향 없이 탑재 되어 때에 너무 자주.</li>
		<li>카메라 소프트웨어에서 &lt; 걸릴 신호 &gt;를 눌러 카메라의 녹화를 준비 하 고 트리거 소프트웨어에서 &lt; 시작 &gt; 버튼을 사용 하 여 여기/수집 주기 시작. 이 형광 강도의 수집을 시작합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>첫 번째 설치의 모든 검색 채널의 스펙트럼 범위에서 형광 방출 표시 형광 구슬과 영화 녹음 채널 등록을 수행 합니다. 다음, 밝은 반점에 대 한 검색 하 여 교정 영화에 구슬 위치를 감지 하 고 중앙 위치는 가우스에서 강도 프로 파일에 맞게 결정 합니다. 모든 채널에서 발견 되 고 x-및 y-방향 학위 39의 2 차원 다항식으로 매핑 오프셋을 맞는 구슬의 좌표를 저장 합니다.</li>
</ol>3입니다. 단일 분자 추적의 선택
<ol><li>데이터 분석 자체 스크립트 이고르 프로 사용 하 여 이루어집니다. "IniTIRF.ipf"를 열어서 모든 필요한 스크립트를 로드 하 고 올바른 유형의 실험을 선택 합니다. 참고: 다음에, &lt; 버튼 &gt; 메뉴 또는 사용자 인터페이스에서 클릭할 수 있는 요소를 지정 합니다. 함수 호출에 따옴표, 예를 들어, "인쇄" Hello World "" 표시 됩니다. 이 명령은 (바깥쪽 따옴표) 없이 이고르 프로의 커맨드 라인에 붙여넣을 수 있습니다.</li>
	<li>검색 채널 등록에 대 한 매개 변수 로드는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>클릭 하 여 GUI를 시작 &lt; 새로운 smFRET | 분석 GUI &gt;.</li>
	<li>각 채널에는 강도 영화 (즉, 16 비트 TIFF 스택을 저장 512 x 512 픽셀 프레임의 시퀀스)를 로드 합니다. &lt; 부하 영화 &gt; 버튼을 누르면 다른 소위 "마스터"와 "슬레이브" 카메라 하나에서에서 파일을 선택 하 여 이렇게 합니다.</li>
	<li>특정 검색 채널에 처음 다섯 프레임의 합계에 있는 밝은 반점에 대 한 검색 하 여 잠재적인 단일 분자의 위치를 식별 합니다. 채널 매핑에서 다른 모든 검색 채널에서 해당 위치를 계산 합니다. 형광 강도 추적 얻으려면, 각 프레임에 대 한 중앙 위치 주위 픽셀 사각형의 합계. GUI에서 &lt; 찾을 추적 &gt; 버튼을 누르면 이렇게 됩니다. 참고: (에서 픽셀) 광장의 옆 길이 의해 주어진 다: 2 * &lt; 합계 Pxs &gt; + 1.</li>
	<li>각 분자에 대 한 공동 원시 강도 추적 같은 여기 색이 자리의 모든 흔적의 합으로 계산 합니다. 평가 다음과 같은 기준에 대 한 모든 채널에 분자의 강도 프로필:<ol>
<li>모든 여기 색상, 적절 한 검색 채널에서 anticorrelated 동작, 빨간 형광의 탐지에 대 한 공동 원시 강도 및 단일 표백에 대략 편평한 고원 단계 (무서 워 앰프 PNP 바운드를 나타내는 *) 적어도 한 번 내는 추적, 그리고 두 개의 앰프 PNP의 존재를 나타내는 것이 빨간 형광에 없는 여러 단계 * 1 Hsp90 이합체에 바인딩된.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이러한 기준을 충족 하는 경우 추가 분석을 위해의 형광 흔적을 저장 합니다. 커서 추적을 선택 하 고 다음 "타임 라인" 그래프에서 &lt; 저장 &gt; 버튼을 누르면 이렇게 됩니다. 수동으로 블루 여기 영화 당 약 200 분자에 대 한 후에 모든 3 개의 탐지 채널 강도 추적 검사.</li>
</ol>4입니다. 부분 형광 흔적의 계산
<ol><li>저장 된 분자 중 하나에 대 한 모든 형광 강도 추적을 표시 합니다. 그래프에서 커서를 사용 하 여 시간 범위를 선택 합니다.</li>
	<li>모든 fluorophores 이미 표백은 시간 간격을 선택 합니다. 평균 배경 농도이 범위에서 계산 하 고 각 채널에서 강도 추적에서 뺍니다. &lt; 배경 &gt; 버튼을 누르면 이렇게 됩니다.</li>
	<li>적어도 두 염료 Hsp90 연결할 무서 워 효율성 범위 선택 (Atto488 및 Atto550). 깜박이 이벤트를 포함 하는 추적을 제외 확인 ( 그림 3B참조). 이러한 이벤트는 다른 채널에서 동반 증가 없이 한 채널에 드롭 형광 강도 특징.</li>
	<li>PF 추적 계산 합니다. &lt; PF Calc &gt; 버튼을 누르면 이렇게 됩니다. 명백한 누설 (lk) 그리고 명백한 감마 (ag)에 대 한 미리 정의 된 수정 요인 사진-물리에 대 한 해결 하기 위해 원시 강도에 적용 됩니다 및 속성 설정.</li>
</ol>5. 인구 선택 및 3 차원 히스토그램 피팅
<ol><li>PF 추적에 낮은 신호 대 잡음 비율을 표시 하는 분자를 제거 합니다. 분자는 간격 [-1, 2] PF 흔적에는 프레임의 10%를 초과 하는 데이터 집합에서 제거 됩니다. 명령 창에서 "RemoveTracesLowSNR()"를 실행 하 여 이렇게 합니다.</li>
	<li>공용 폴더 데이터의 범주화 된 2D 계획을 계산 합니다. 플롯 <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq12.jpg"> 통해 <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq13v2.jpg"> 및 <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq14.jpg"> 통해 <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq13v2.jpg"> 100 x 100 쓰레기통의 해상도 범위 [-0.5; 1.5]에서. 이렇게 하려면 실행:<ol>
<li>"HistFret2D ("r_b","r_g", binHist = 100)"</li>
		<li>"HistFret2D ("r_b","g_b", binHist = 100); MoveWindow 553.5, 42.5, 1055.25, 508.25"</li>
	</ol>
</li>
	<li>2D 계획에 각 구별 국가의 상대 인구를 결정 합니다.<ol>
<li>앞으로 적절 한 그래프를가지고 하 고 "panelHist2DCount()"를 실행 합니다.</li>
		<li>&lt; 초기화 &gt; 버튼 누르고 피크 주위 직접 다각형을 그립니다.</li>
		<li>&lt; 카운트 &gt; 버튼을 클릭 합니다. 데이터 요소에는 다각형의 수와 프로젝션에 데이터 포인트의 총 수는 명령 창에서 인쇄 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실행 하 여 공용 폴더 데이터의 3 차원 히스토그램을 준비 "HistFret3D ("g_b","r_b","r_g")".</li>
	<li>1의 전체를 3 차원 히스토그램을 정상화. 다음 실행:<ol>
<li>"NewDataFolder/S fit0"</li>
		<li>"중복/O:: 무서 워: Hist3D, Hist3D"</li>
		<li>"가변 /G div = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0)) ^3"</li>
		<li>"Hist3D / div; = 인쇄 사업부 "</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 차원 가우스에 대 한 초기 매개 변수 적합 하 고 필요한 데이터 구조를 준비를 제공 합니다.<ol>
<li>"Gauss3D_initParam(); 실행 W_coef_old 편집. "</li>
		<li>매개 변수 벡터의 끝에 국가 인구를 추가 합니다.</li>
		<li>"Gauss3D_prepareFit()"를 실행 참고: W_coef_old는 적합을 위한 초기 매개 변수를 보유 하는 벡터 이다. 즉 국가 당 <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq15.jpg"> 및 벡터의 끝에 연결 상태 인구. 공분산 행렬은 대칭 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>S 구별할 수 주의 수와 3D PF 히스토그램에 S 3 차원 가우스 함수의 합계를 맞습니다.<ol>
<li>"Do3D()"를 실행 이 초기 매개 변수의 품질에 따라 정상적인 사무실 PC에 한 시간 이상 걸릴 수 있습니다.</li>
		<li>"PostprocessFitMultiGauss3D(); 실행 evalFitMultiGauss3D(); W_coef 편집. "</li>
	</ol>
</li>
	<li>맞는 결과 표시 합니다. 두 개의 2D 계획의 각각에 대해 다음 명령을 사용 하 여:<ol>
<li>"contourPF3D_new(0); contourPF3D_new(1); contourPF3D_new(2); contourPF3D_new(3); contourPF3D_new(4) "</li>
		<li>"contourPF3D_colorize()"</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 운동 분석 3D 앙상블과 흠
<ol><li>앙상블 흠 운동 정보를 추출 실행을 준비 합니다. 한 흠 데이터 집합에 있는 모든 분자에서 최적화 되어 있습니다. 이전 단계에서 얻은 정보를 사용 하 여 3D PF 공간에서 위치와 각 상태의 폭 정의 하.<ol>
<li>흠 사용자 인터페이스 초기화 (&lt; 흠 | 초기화 흠 &gt;) 국가의 적절 한 수를 선택 하 고 (Hsp90 데이터의 경우 즉 &lt; NumStates &gt; = 5), 입력 신호 크기의 숫자 (&lt; NumDims &gt; = 3), 및 입력의 유형이 (&lt; 입력 형식 &gt; = "무서 워 3D bgr").</li>
	</ol>
</li>
	<li>소프트웨어는 흠의 가능성을 수렴 시키는 여는 HMM의 매개 변수를 최적화 (실행 "prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1),-14)") 이전 반복에 비해 전환 매트릭스에 변경 임계값 (10-14이하로 떨어질 때까지 각 전환 확률에 대 한 절대 변경의 합계에 대 한). 이 정상적인 사무실 PC에 한 시간 정도 전환 가능성에 대 한 MLE를 생성합니다.</li>
	<li>데이터 (예: 전체 데이터 세트의 75%)의 하위 집합에 대 한 인구 선택, 가우스 피팅 및 흠 최적화를 반복 합니다. 전체 데이터 집합은 다른 실험에서 병합 하는 경우 각각 하나의 실험에 대 한 최적화도 반복 합니다. 하위 집합의 분석 수동 채우기 선택 하 고 데이터 집합 내의 가변성의 불확실성을 추정을 허용 합니다.</li>
	<li>데이터 집합이 고는 흠의 정밀도 대 한 보고서 전환 가능성에 대 한 CI를 계산 합니다.<ol>
<li>"Cd $(루트: path3Dimport +"흠");를 실행 하 여 CI 범위의 대략적인 견적을 얻을 loop_getCI_estimate_limits()입니다. "</li>
		<li>실행 하 여는 CI의 정확한 한계를 계산:</li>
		<li>"loop_getCI_HMM_converge(1)"</li>
		<li>"CIresults_conv_new()"</li>
		<li>"cd:: HMM_CIresult; reportCI_conv() "</li>
		<li>"cd:: cmp_CI_conv; CI_plot2 ("흠", doAppend = 0) "</li>
	</ol>
</li>
	<li>해석을 단순화 하기 위해 사용할 수 있는 운동 정보 응축<ol>
<li>레이블이 지정 된 뉴클레오티드 유지 Hsp90 바인딩된 시간에 대 한 정보를 수집 합니다. 앰프-PNP에 바인딩된 상태를 축소 하 여이 작업을 수행 * (즉, S1, S2 와 S3을 또한 그림 2참조) 면만 시간 히스토그램을 컴파일합니다. "Cd $(루트: path3Dimport +"흠");를 실행합니다 collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0}) ", S0 와 S4 와 S1, S2및 S3상태는 결합의 거주.</li>
		<li>관심의 각 상태에 대 한 Viterbi 경로에서 면만 번을 추출 하 고 다른 실험 조건에 대 한 결과 거 시간 히스토그램을 비교. "Plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)"를 실행</li>
		<li>더 자세한 사진에 대 한 뚜렷한 PF 하지만 기능적으로 추가 데이터 분석, 예를 들어, 레이블이 Hsp90 그리고 뉴클레오티드, 미국 S2 와 S 3 색 실험의 경우 쉽게 동일한 상태 축소 3 축소 될 수 있습니다. "Collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})"를 실행</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

우리는 복잡 한 단백질 시스템 및이 측정 분석에 대 한 단계별 설명에 대 한 3 색 smFRET 데이터를 얻기 위해 실험 절차를 제시. 이 방법은 직접 여러 상호 작용이 사이트 또는 구조적 변화 간의 상관 관계를 평가 하기 위해 고유한 가능성을 제공 합니다.
단백질에 적합 한 멀티 컬러 단일 분자 데이터를 얻기 위해 그것은 저 잡음 수준에서 재현 가능한 측정을 수행 하는 것이 중요. 이 흐름 챔버9에 대 한 효율적이 고 신뢰할 수 있는 표면 패 시 베이 션 프로토콜을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 표면에 움직일 수 분자의 충분 한 조밀도 기록된 영화 당 분자의 수확량을 증가 시키기 위해 사용 되어야 한다. 즉, 형광 빛 단일 분자에서 기록 된 이미지에서 픽셀의 약 5-10%에가 해야 합니다. 동시에 오버 로드 방지 되어야 한다, 분자를 이웃의 한 중복 될 것이 있기 때문에. 레이블이 지정 된 종은 솔루션에서 무료 (앰프 PNP * 제시...

많은 단백질 구조적 변화 및 광범위 한 계획1,2,3과도 연결 하 여 중재 하는 다른 분자와 동적 단지에서 그들의 기능을 충족 해야 합니다. 외부 에너지 원 (예를 들어, ATP) 이러한 동적 상호 작용 기능에서 방향으로 이어질 수 있고 궁극적으로 셀, 인생에 대 한 전제 조건에에서 비 평형 안정 상태를 유지 하는 결합.
완전히 이해 분자 기계, 구조 연구에 의해 유도 정적 설명 충분 하지 않습니다. 또한, 기본 운동 모델의 지식을 하 고 운동 속도 상수를 결정 하기 위해 필수적입니다. 여러 가지 기존 방법을 허용 관심, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명, 이완 메서드 (예: 점프 또는 중지 흐름 분 광 판독의 2 개의 분자 사이 상호 작용을 바이너리의 역학을 공부 하는 연구원 기술), 및 핵 자기 공명. 그러나, 그들의 적용은 대부분의 경우 간단한 2-상태 시스템 (예를 들어, 하나의 바운드와 언바운드 상태) 평균 하는 대량 실험에 제한. 경우 더 많은 상태 또는 중간체 관련, 그들은 속도 상수만 복잡 한 혼합물을 얻을. 광학 또는 마그네틱 핀셋 또는 2 색 smFRET, 즉, 하나의 기증자 등 표면 움직일 샘플 1 개의 수락자 fluorophore 단일 분자 방법 구조적 변화를 관찰 하는 모든에 대 한 속도 상수를 복구할 수 있습니다. 그러나, 그것은 하나 이상의 바인딩 사이트에 영향을 미치는 상호 작용에 관해서 라면, 이러한 방법을 유지 제한 고 가능한 상관 관계는 2 개 (이상)의 상호 작용에 정보만 실험 집합 간접적 결론을 통해 액세스할 수 있습니다.
실시간에 직접, 및에서 이러한 구성 요소 간의 상호 작용을 공부 하는 기회를 제공 하는 멀티 컬러 smFRET4,5,6,7,,89 근처 생리 조건10. 이 하나는 ligand 또는 다른 단백질8,,911의 구조에 종속적 바인딩 예를 들어 조사를 허용 합니다. 여기에 제시 된 전반적인 접근은 특정 위치, 측정 챔버의 표면에 1 개의 단백질을 연결 하 고 (대 한 자세한 내용은 참조 9 프리즘 형 TIRFM에 시간이 지남에 형광 강도 추적에 대 한 관심의 protein(s)를 , 12). 다른 염료의 공간 근접 다음 에너지 전송 그들 사이에서 확인할 수 있습니다. 전략 라벨 다를 수 있습니다 단백질에서 단백질 ( 13에서 검토) 및 지침을 smFRET 측정에서 아티팩트를 피하기 위해 존재14.
이후 기증자 염료 다른 수락자 염료 멀티 컬러 smFRET 실험에서 에너지를 전송할 수 있습니다, 모든 염료의 상대 위치 한 염료 혼자15,16의 여기에서 액세스가 불가능 합니다. 하지만 레이저 여기 (알렉스17, 그리고 검토에 18) 교체와 함께에서이 방법을 초 및 하위 나노미터의 해상도에서 모든 spatio 시간적 정보를 제공 합니다.
교장, 고해상도 구조 정보 간 염료 거리를 사용 하 여 달성 될 수 있다 알렉스 멀티 컬러 smFRET 실험에서 모든 형광 강렬의 조합에서 계산. 그러나, 여기 우리가에 초점을 어디 다 색 smFRET은 필수 운동 모델의 추출 뿐만 아니라 상태 식별 및 분리. 삼각 측량에 의하여 구조 결심 "만" 원할 때 높은 신호 대 잡음 비율을 간단 하 게 2 색 smFRET 실험의 세트 수행된12,19될 수 있습니다.
우리가 사용 하는 부분 형광 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq1.jpg">) 두 fluorophores7사이의 에너지 전송에 대 한 프록시로 서. PF 는 2 색 실험의 무서 워 효율 유사한 형광 강도에서 계산 됩니다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq2.jpg">
어디, <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq3v2.jpg"> 방출 채널 em 에서 강도 색 전,와 여기 이후 이며 c 는 가장 긴 파장을 가진 수락자. 검색 채널 샘플 챔버 하지만 형광 빛의 기록 다른 스펙트럼 범위에서 동일한 위치를 나타냅니다. 여기 및 방출에 대 한 동일한 식별자가이 프로토콜에 사용 됩니다 (즉, "파랑," "녹색," 및 "빨강").
실험적인 단점 때문에 측정 된 형광 강렬은 에너지 전송에 뿐만 아니라 fluorophore 및 설정 속성에 따라 달라 집니다. 두 fluorophores 사이의 진정한 에너지 전송 효율을 얻기 위하여 측정된 농도 수정 해야 합니다. 다음 절차는 참조9를 기반으로 합니다. 명백한 누설 (lk, 즉, 다른 염료에 대 한 지정 된 채널에 fluorophore에서 광자의 탐지) 및 명백한 감마 보정 요인 (ag, 즉, 염료의 형광 양자 수율 및 채널의 검출 효율) 이벤트를 표백 하는 수락자를 표시 하는 단일 분자 추적에서 얻을 수 있습니다.
모든 가능한 수락자 채널에 기증자 염료의 누설은 수락자 염료 표백 하지만 기증자 여전히 형광 기록된 형광 추적에서 모든 데이터 요소에서 계산 (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq4.jpg">):
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq5.jpg">
누설 히스토그램의 중간값은 명백한 누설 요소로 사용 됩니다. 보정 후 누설에 대 한, 명백한 감마 요소 추적의 동일한 세트에서 결정 됩니다. 그것은 기증자 채널 수락자 염료의 표백 시에 형광의 변화에 의해 수락자 채널에서 형광의 변화를 나누어 계산 됩니다.
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq6.jpg">
여기서 c 는 다시 긴 파장을 가진 수락자에 대 한 감지 채널입니다. 결과 분포의 중앙값 명백한 보정 요소로 사용 됩니다.
각 채널에서 수정 된 농도 의해 얻을 수 있습니다.
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq7.jpg">
PF 는 다음에 따라 계산 됩니다.
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq8.jpg">
다른 인구 PFs에 다차원 공간에서 분리 될 수 있다. 위치와 각 상태의 폭 피팅 다차원 가우스 기능 데이터에 의해 결정 됩니다. 모든 PF 흔적을 기반으로 한 글로벌 흠의 후속 최적화 관찰된 활동의 양적 설명을 제공 합니다. 속도의 심지어 작은 변화는 감지.
HMMs 시끄러운 시간 추적의 컬렉션에서 상태 모델을 유추 하는 방법을 제공 합니다. 시스템은 어떤 주어진된 시간에 실제 관측 (즉, 방출) 숨겨진된 상태는이 숨겨진된 상태20의 확률 함수 이산 집합 중 하나에 있을 여겨진다. TIRFM smFRET 데이터의 경우는 방출 확률 b나 주 나 당 연속 가우스 확률 밀도 함수에 의해 모델링 될 수 있습니다. 정기적으로 간격 둔된 개별 시간 포인트에서 다른 상태에서 전환 시간 불변 이며만 현재 상태에 따라 전환 확률에 따라 발생할 수 있습니다. 전환 행렬 A 이 전환 확률 ij 모든 숨겨진된 상태 사이 포함 되어 있습니다. 초기 상태 분포 <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq9.jpg"> 국가 특정 확률을 제공 <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq10.jpg"> 시간 추적의 처음으로 포인트. 최대 가능성 접근을 사용 하 여, 가장 앞으로 뒤로 하 고 바 움-웰 치 알고리즘20,21을 사용 하 여 데이터를 설명 하기 위해 이러한 매개 변수를 최적화할 수 있습니다. 이 최대 가능성 평가 인 (MLE)을 생성합니다. 마지막으로, 가장 가능성이 관측의 궤적 생성 상태 시퀀스 Viterbi 알고리즘 유추 수 있습니다. SmFRET 데이터24,,2526 의 다른 흠 분석 달리 우리가 사용 하지 않는 한 단순한 "부드럽게" 데이터 하지만 필요 없이 데이터 집합에서 추출 운동 상태 모델의 피팅 유지 시간으로 흠 히스토그램27 흠 분석 자체 스크립트 이고르 프로 사용 하 여 이루어집니다. 코드의 구현은 참조21을 기반으로 합니다. 제공 하는 소프트웨어 키트 모범적인 데이터 우리의 웹 페이지에 따라 섹션 5와 6이이 프로토콜 (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret)의 순서. 전체 소프트웨어는 요청 시 이용 가능.
PF 데이터에서 포인트 시간 &lt;-1 또는 PF &gt; 2 어떤 검색 채널에 모든 국가 (10-200)에 대 한 최소한의 방출 확률 할당 됩니다. 이러한 데이터 요소에 인공 전환이 되지 않습니다.
5.7 단계에서 설명한 대로 방출 확률에 대 한 매개 변수 가우스 기능 3D PF 히스토그램의 적합에서 얻을 수 있습니다. 이 매개 변수는 흠의 최적화 하는 동안 고정 유지 됩니다.
제시 방법에서 초기 상태로 배포 벡터와 전환 매트릭스 사용 됩니다 세계적으로 추적의 전체 앙상블을 설명 하. 그들은 참조27에 따라 데이터 집합에서 모든 N 분자에 따라 업데이트 됩니다.
초기 상태 분포에 대 한 시작 매개 변수 (단계 5.3) PF 히스토그램의 2D 계획에서 결정 됩니다 고 전환 확률 설정 됩니다 확률 제외 0.05 동일한 상태를 유지 하기 등을 선택 하는 특정 상태를 두고 확률 화합과 정규화 됩니다.
가능성 프로 파일링 방법 모든 전환 속도21,22, 그들의 불확실성에 대 한 의미 있는 견적으로 봉사 하는 자신감을 간격 (CIs)에 게 하는 데 사용 됩니다. 특정 비율에 대 한 CI의 범위를 계산 하려면 전환 확률의 MLE 이외의 값으로 고정 됩니다. 이 테스트 모델 λ 생성 '. 가능성의 가능성 비율 (LR) 테스트 <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq16.jpg"> 데이터 집합 주어진 0 에 따라 수행 됩니다.
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq11.jpg">
바인딩된 매개 변수 LR 3.841는 x2의 95% 논집을 초과 하는 경우에 도달 하면에 대 한 95% 신뢰-한 자유도22,23분포.
방법의 파워는 Hsp90를 사용 하 여 증명 됩니다. 풍부한 단백질이 박테리아 및 진핵생물에서 발견 되 고 세포질 긴장 응답28의 일부입니다. 그것은 암 치료29유망 약 대상입니다. Hsp90 homodimer 각 소 단위30의 N 맨끝 도메인에 하나의 뉴클레오티드 바인딩 포켓입니다. 그것은 적어도 두 개의 전역 고유 conformations, 폐쇄 하나 하나의 N-터미널 오픈, V 자형 구조19,31,32사이 영상 효과 받을 수 있습니다. 직접 dimeric 자연 Hsp90에 두 개의 뉴클레오티드 바인딩 사이트 사이 상호 작용의 문제를 발생 시킵니다.
다음에, 우리는 데이터 수집 및 효 모 Hsp90 그리고 뉴클레오티드에 3 색 smFRET 실험의 분석에 대 한 단계별 프로토콜을 제공. 붙일 레이블 앰프 PNP의 구조에 종속적 바인딩 (앰프 PNP *, ATP의 비 hydrolyzable 아날로그) 분석 된다. 설명 된 절차의 응용 프로그램 허용 뉴클레오티드 바인딩 및 동시에 연구 Hsp90의 구조적 변화 하 고 그로 인하여 Hsp90의 2 개의 뉴클레오티드 바인딩 포켓 사이 cooperativity를 보여준다.

<table><tbody><tr><td>Setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vibration-damped 광학 테이블&nbsp; &nbsp;</td><td>미국 캘리포니아주 어바인 뉴포트</td><td>RS2000</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 473nm LX 75mW LASER</td><td>Coherent Inc, 미국 캘리포니아주 산타클라라</td><td>1185052</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 532nm LS 50mW LASER</td><td>Coherent Inc, 미국 캘리포니아주 산타클라라</td><td>1261779</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 594nm LS 60mW LASER</td><td>Coherent Inc, 미국 캘리포니아주 산타클라라</td><td>1233470</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 637nm LX 140mW LASER</td><td>Coherent Inc, 미국 캘리포니아주 산타클라라</td><td>1196625</td><td></td></tr><tr><td>레이저 제어 장치</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1234465</td><td>Scientific 원격</td></tr><tr><td>비구면 망원경 렌즈</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td></td><td>d = 25.4mm, f = 50mm 및 f = 100mm</td></tr><tr><td>CF ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, T &uuml; bingen, 독일</td><td>ZET 473/10</td><td>정리 필터 여기</td></tr><tr><td>CF ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, 독일</td><td>ZET 532/10</td><td>정리 필터 여기</td></tr><tr><td>CF ex3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; Bingen, Germany</td><td>ZET 594/10</td><td>클린업 필터 여기</td></tr><tr><td>CF ex4</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td>FL635-10</td><td>클린업 필터 여기</td></tr><tr><td>DM ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, 독일</td><td>ZQ594RDC</td><td>이색성 거울 여기</td></tr><tr><td>DM ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, 독일</td><td>570DCXR</td><td>이색성 거울 여기</td></tr><tr><td>DM ex3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, 독일</td><td>ZQ491RDC</td><td>이색성 거울 여기</td></tr><tr><td>AOTFnC-Vis</td><td>AA Opto-Electronic, Orsay, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lambda;/4 plate</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td>AQWP05M-600</td><td></td></tr><tr><td>CFI Apo TIRF 100x</td><td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td><td></td><td>high-NA</td></tr><tr><td>objective piezo focus positioner MIPOS 250 CAP</td><td>piezosystem jena GmbH, Jena, 독일</td><td></td><td>피에조 컨트롤러 NV 40/1 CLE</td></tr><tr><td>피에조 스테퍼</td><td>뉴포트, 어바인, 캘리포니아, 미국</td><td>PZA12</td><td>PZC200-KT NanoPZ 액추에이터 키트</td></tr><tr><td>무색 비구면 렌즈</td><td>Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, G&ouml; ttingen, 독일</td><td>G322-304-000</td><td>d=50mm, f=200mm</td></tr><tr><td>조정 가능한 광학 슬릿</td><td>Owis GmbH, Staufen i. Br., 독일</td><td>27.160.1212</td><td>최대 조리개 12 x 12 mm</td></tr><tr><td>DM det1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, 독일</td><td>T 600 LPXR</td><td>이색성 미러 감지</td></tr><tr><td>DM det2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, 독일</td><td>H 560 LPXR 초평면</td><td>이색성 거울 감지</td></tr><tr><td>DM det3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, 독일</td><td>HC BS R635</td><td>이색성 거울 감지</td></tr><tr><td>BP det1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, Germany</td><td>525/40 BrightLine HC</td><td>대역통과 필터 감지</td></tr><tr><td>BP det2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; bingen, Germany</td><td>586/20 BrightLine HC</td><td>대역통과 필터 감지</td></tr><tr><td>BP det3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; Bingen, Germany</td><td>631/36 BrightLine HC</td><td>대역통과 필터 감지</td></tr><tr><td>BP det4</td><td>AHF analysentechnik AG, T&uuml; Bingen, Germany</td><td>700/75 ET Bandpass</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>optical shutters detection</td><td>Vincent Associates, Rochester, NY, USA</td><td>Uniblitz VS25S2T0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD iXon Ultra 897</td><td>Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>digital I/O card, PCIe-6535</td><td>National Instruments, Austin, Texas, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>PHD22/2000</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Flow chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>quartz slides</td><td>G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA</td><td></td><td>Spectrosil2000, h=3mm</td></tr><tr><td>TEGADERM film</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td><td>1626W</td><td>10 x 12cm</td></tr><tr><td>스프레이 접착제</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td><td>Photo Mount 050777</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, 독일</td><td>Immersol G</td><td></td></tr><tr><td>이멀젼 오일</td><td>OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, 함부르크, 독일</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>프리즘</td><td>Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, 독일</td><td></td><td>Suprasil1</td></tr><tr><td>알루미늄 프리즘 홀더</td><td></td><td></td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>중공 고정 나사</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td></td><td>맞춤형 드릴링</td></tr><tr><td>Tygon S3 E-3603 튜빙</td><td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td><td>2-4450</td><td>ACF00001</td></tr><tr><td>PTFE 튜빙</td><td>Bohlender GmbH, Gr&uuml; nsfeld, 독일</td><td>S1810-08</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sample</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin</td><td></td><td></td><td>UniProt ID P02829</td></tr><tr><td>Atto488의 Maleimide 유도체, Atto550</td><td>ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP*</td><td>Jena Bioscience, Jena, Germany</td><td></td><td>&gamma;-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N</td></tr><tr><td>Fluospheres</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>F8764</td><td>아민 변성, 0.2 &mu; m, 황록색 형광</td></tr><tr><td>등Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis</td><td>Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td><td></td><td>version 4.30</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments, Austin, Texas, USA</td><td></td><td>버전 2012, 32비트; 기타 하드웨어 제어</td></tr><tr><td>MDS 제어 소프트웨어</td><td>AA Opto-Electronic, Orsay, France</td><td></td><td>버전 2.03a</td></tr><tr><td>Coherent Connection</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>버전 3</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA</td><td></td><td>버전 6.37</td></tr></tbody></table>

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

단일 분자 포스터 공명 에너지 전달 (smFRET)의 생체 역학을 공부 하는 널리 사용 되 생물 기술 되고있다. 대 한 세포 단백질에 많은 분자 기계는 그들의 작업을 수행 하기 위해 기능 주기에서 상호 작용 협동자와 함께 행동 해야 합니다. 확장 다 색을 두 색 smFRET 가능 하 게 동시에 하나 이상의 상호 작용 또는 구조적 변화를 조사. 이 뿐만 아니라 smFRET 실험에 새로운 차원을 추가 하지만 그것은 또한 직접 이벤트의 시퀀스를 공부 하 고 고정된 샘플 및 총 내부 반사 형광을 사용 하 여 서로 상호 작용을 검출 하는 독특한 가능성을 제공 현미경 (TIRFM)입니다. 따라서, 멀티 컬러 smFRET 이전 unachievable 자세히 바이오 단지 양적 방법으로 공부에 대 한 다양 한 도구입니다.
여기, 단백질에 멀티 컬러 smFRET 실험의 특별 한 도전을 극복 하는 방법을 보여 줍니다. 자세한 프로토콜 데이터를 얻기 위해 및 운동 정보를 추출 하기 위한 선물이. 이 추적 선택 기준, 상태 분리 및 3D 앙상블 숨겨진 마르코프 모델 (HMM)를 사용 하 여 시끄러운 데이터에서 상태 궤적의 복구 포함 됩니다. 다른 방법에 비해 운동 정보는 복구 되지 면만 시간 히스토그램에서 하지만 직접는 흠. 최대 가능성 프레임 워크 운동 모델을 비판적으로 평가 요금에 대 한 의미 있는 불확실성을 제공 하 고 있습니다.
열 충격 단백질 90 (Hsp90) 우리의 메서드를 적용 하 여 우리는 뉴클레오티드 바인딩 및 단백질의 글로벌 구조적 변화를 풀 수 있습니다. Hsp90 이합체의 2 개의 뉴클레오티드 바인딩 포켓 사이 cooperativity를 직접 관찰할 수 있습니다.

멀티 컬러 smFRET 측정 두 개 이상의 고유한 상호 작용 사이트 간의 상관 관계의 직접적인 탐지를 허용 한다. 이 기술은 다중 구성 요소 시스템, 단백질 복합물을 조사에 고유한 렌더링 합니다. 우리는 여기에, 설명 예 역할 3 색 smFRET 실험의 프레 젠 테이 션에 초점.
방법의 일반적인 워크플로 그림 1에 표시 됩니다. 첫 번째 부분에는 프리즘 형 TIRF 현미경에 다 색 smFRET 데이터의 기록 구성 되어 있습니다. 표면 부착 전략 및 설치의 회로도 그림 2A에서 묘사 된다. 설치의 자세한 설명에 대 한9참조를 참조 하십시오. 제시 방법의 두 번째 부분은 데이터 분석에 집중 한다. 모범적인 형광 강도 트...

여기, 우리는 프로토콜 3 색 smFRET 데이터 및 3D 앙상블 숨겨진 마르코프 모델의 분석을 제시. 이 방법을 과학자 들은 복잡 한 단백질 시스템, cooperativity 또는 서로 상호 작용을 포함 하 여에서 운동 정보를 추출할 수 있습니다.

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

이 절차의 전반적인 목표는 협력성과 같은 상관 상호 작용에 중점을 두고 복잡한 단백질 시스템의 역학을 정량적으로 연구하는 것입니다. 이 방법은 단백질 복합체와 이들의 동적 상호 작용이 매우 중요한 정량 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동적 다색 단일 분자 FRET를 생물학적으로 관련된 시스템에 적용할 수 있다는 것입니다.플로우 챔버를 조립하기 전에 40미크론 두께의 투명 접착 필름의 흐름 채널을 절단하고 필름의 비접착 면에 빠른 고정 접착제를 분사하고 접착제가 건조되도록 합니다. 플로우 챔버 조립을 시작하려면 3mm 두께의 PEG 비오틴, PEG, 입구 및 출구 구멍이 있는 PEG, 기능화된 융합 석영 슬라이드를 얻습니다. 천장 필름의 스프레이 접착제 코팅된 면을 슬라이드의 기능화된 면에 바르고 채널을 입구 및 출구 후크와 정렬합니다.핫 플레이트에서 슬라이드를 섭씨 80도까지 1분 동안 가열합니다. 압력을 고르게 분산시키기 위해 추가 현미경 슬라이드를 사용하여 30초 동안 필름을 슬라이드에 누릅니다. 그런 다음 어셈블리를 1분 동안 식히십시오.접착제를 덮고 있는 보호 시트를 벗겨냅니다. 노출된 접착제에 커버 슬립을 놓아 플로우 챔버를 형성합니다. 챔버를 섭씨 80도로 1분 동안 가열합니다.커버 슬립을 접착제에 30초 동안 눌러 챔버를 밀봉하고 조립된 챔버를 냉각시킵니다. 프리즘 위에 플로우 챔버를 배치하기 전에 프리즘 면에 글리세롤 한 방울을 바르십시오. 플로우 챔버를 멀티 컬러 프리즘 유형 TIRF 현미경용 홀더에 장착합니다.완료되면 입구와 출구 튜브를 연결합니다. 3가지 색상 측정을 위한 기기 구성을 시작하려면 전자 증식 CCD 카메라 소프트웨어를 열고 EMCCD 센서를 가능한 가장 낮은 온도로 설정합니다. 카메라 수직 이동 속도를 3.3마이크로초로 설정하고, 일반 수직 클럭 전압을 선택하고, 수평 판독 속도를 16비트에서 17밀리헤르츠로 설정하고, 사전 증폭 이득을 3으로, 전자 증배기 이득 수준을 1000으로 설정합니다.외부 획득 트리거링을 선택합니다. 노출 시간을 70밀리초로 설정합니다. 그리고 동영상 녹화 시간은 750 획득 주기입니다.측정 파일을 저장할 새 폴더를 만듭니다. EMCCD 소프트웨어에서 자동 저장을 활성화하고 동영상 프레임 파일 형식을 TIFF로 설정합니다. 자동 저장 파일 경로를 새로 생성된 폴더로 설정합니다.그런 다음 음향 광학 조정 가능 필터, 레이저 제어 소프트웨어 및 레이저, AOTF, 광학 셔터 및 카메라를 동기화하는 트리거 소프트웨어를 제어하는 소프트웨어를 엽니다. AOTF를 사용하여 프리즘에 들어가기 전에 레이저 출력을 약 3밀리와트로 조정합니다. 교대 레이저 여기를 위해 모든 장치를 동기화하는 트리거링 패턴을 로드한 다음 기기에 샘플 홀더를 장착합니다.주입 튜브의 끝을 실험 버퍼가 들어 있는 미세 원심분리기 튜브에 놓습니다. 배출 튜브를 주사기 펌프 세트에 연결하여 인출 모드로 설정합니다. 150마이크로리터의 버퍼로 챔버를 세척합니다.CCD 카메라를 기능화된 인터페이스에 초점을 맞추고, 여기 빔과 표백제 형광 오염 물질을 정렬합니다. 그런 다음 300 μl의 0.25 milligram per millil deglycosylated avidin 용액을 흘려 챔버에 완충시키고 1 분 동안 배양합니다. 완충액을 사용하여 챔버에서 결합되지 않은 탈글리코실화된 아비딘을 플러시합니다.그런 다음 BSA 농도가 밀리리터당 0.5mg인 300마이크로리터의 버퍼를 챔버를 통해 흘려보내 표면 기능화 결함을 차단합니다. 다음으로, 충분한 표면 밀도가 달성될 때까지 Hsp90 농도가 증가할 때까지 BSA에 비오틴화 형광 표지된 Hsp90 150마이크로리터 부분의 바이오틴화 형광 표지 Hsp90을 플로우 챔버에 로드합니다. 챔버에서 결합되지 않은 단백질을 300마이크로리터의 BSA 함유 완충액으로 세척합니다.라벨이 지정된 AMP-PMP 및 BSA가 함유된 완충액의 25나노몰 용액 150마이크로리터를 챔버에 넣고 5분 동안 배양합니다. 로딩과 배양을 한 번 반복합니다. 그런 다음 Piezo stepper를 사용하여 샘플 챔버를 여기 빔에 수직으로 이동하여 원하는 대로 시야를 변경합니다.필요한 경우 이미지 초점을 조정합니다. 그림과 같이 신호 찍기 버튼을 클릭하여 카메라 소프트웨어에서 카메라 녹화를 시작합니다. 트리거 소프트웨어에서 여기 수집 주기를 시작하여 데이터 수집을 시작합니다.데이터 분석을 시작하려면 분석 소프트웨어를 열고 두 카메라의 녹화된 동영상을 가져옵니다. trace 찾기를 클릭하여 잠재적인 단일 분자에 해당하는 형광 강도 traces를 확인합니다. 각 분자에 대해 동일한 excitation color를 가진 해당 spot의 모든 traces의 합을 계산합니다.모든 채널에서 Joint Raw Intensity의 대략 평평한 고원과 모든 여기 색상에 대한 단일 표백 단계에 대한 강도 프로파일을 평가합니다. 적절한 검출 채널에서 상관 방지 동작과 추적에서 적색 형광이 발생하는지 확인합니다. 모든 기준이 충족되면 추가 분석을 위해 형광 흔적을 저장합니다.표시된 분자만 이 예시의 기준을 충족합니다. 평평한 안정 상태가 없거나, 상관 관계 방지가 아닌 깜박이는 이벤트를 표시하거나, 여러 표백 단계가 있는 추적을 제외합니다. 미량 선택은 모든 단일 분자 기술에서 중요한 단계입니다.잘 정의된 기준을 충족하는 추적만 선택해야 합니다. 여기서 이러한 기준은 상관 관계 방지, 단일 표백 단계 및 평평한 고원입니다. 다음으로, 저장된 분자를 차례로 표시하고 한 세트의 강도 추적은 모든 4층이 이미 표백된 시간 간격을 선택합니다.이 시간 간격에 대한 빔 배경 강도를 계산한 다음 Hsp90의 두 염료가 모두 존재하는 FRET 효율 범위를 선택하고 깜박이는 이벤트가 있는 트레이스를 제외해야 합니다. 부분 형광 트레이스를 계산합니다. 트레이스에서 신호 대 잡음비가 낮은 분자를 제외합니다.다음으로, 부분 형광 데이터의 바인딩 2D 투영을 생성하고 상대 인구 계산 도구를 시작합니다. Init를 클릭합니다. 관심 있는 피크 주위에 폴리곤을 그립니다.그리고 count를 클릭하여 해당 피크에 대한 상대적 인구를 계산합니다. 부분 형광 데이터의 3D 히스토그램을 생성하고 히스토그램을 정규화합니다. 3D 가우스 피팅에 대한 초기 파라미터를 초과하고 파라미터 벡터의 끝에 state populations를 추가합니다.데이터를 피팅하고 결과를 표시합니다. 3D 부분 형광 공간에서 각 상태의 위치와 너비를 정의한 후 Hidden Markov Model 인터페이스를 초기화합니다. 적절한 상태 개수, 입력 신호의 차원 개수, 입력 유형을 선택합니다.HMM 파라미터를 최적화하여 전이 확률에 대한 최대우도 추정량을 결정합니다. 데이터 서브셋에 대해 모집단 선택, 피팅 및 HMM 최적화를 반복합니다. 마지막으로, 전이 확률에 대한 신뢰 구간을 계산하고 보존 상태를 축소하여 추가 분석을 위해 데이터를 단순화합니다.Hsp90 단백질의 구조적 상태는 표지된 리포터 뉴클레오티드 AMP-PMP의 존재 하에서 3색 단일 분자 FRET로 연구되었습니다. 5개의 구조적 상태는 형광 강도에 의해 구별될 수 있었고 그 중 4개는 기능적으로 구별되었습니다. 3색 단분자 FRET를 통해 3D 공간에 걸친 부분 형광 데이터를 얻을 수 있었습니다.실험 조건에서 이론적으로 예상되는 모든 상태는 2D 투영에서 부분 형광으로 구별할 수 있으므로 상태를 분리하는 데 도움이 되도록 2D 투영이 사용되었습니다. 이러한 상태의 상대 모집단은 2D 투영에서 결정되었으며 3D 가우스 피팅에 대한 제약 조건으로 사용되었습니다. 후속 앙상블 3D HMM 최적화 및 모델링을 통해 추출된 상태 전이 확률을 제공했습니다.추출된 각 비율 상수에 대해 신뢰 구간을 계산했습니다. 추가로 250 마이크로몰의 표지되지 않은 AMP-PMP가 있는 상태에서 실험을 반복하여 Hsp90 이량체의 두 번째 결합 부위에 대한 하나의 뉴클레오티드 결합의 영향을 규명했습니다. 결합 및 결합되지 않은 형태를 축소하면 레이블이 지정되지 않은 추가 AMP-PMP의 유무에 따라 Hsp90에서 형광 AMP-PMP 해리에 대한 평균 체류 시간을 계산할 수 있었습니다.이 동영상을 시청한 후에는 다색 FRET 및 TIRF 현미경을 사용하여 동적 단백질 시스템에서 운동 정보를 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 생명 과학 분야의 연구자들이 다중 단백질 시스템에서 상관 상호 작용을 결정할 수 있는 길을 열어줍니다. 이것은 협력과 같은 근본적인 규제 메커니즘에 대한 더 깊은 이해를 위해 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 프로토콜은 걱정 기반의 근접 분석을 사용하는 방법에 이미지 단백질 단백질 상호 작용을 설명합니다.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

이 비디오에서는 형광단 태그가 지정된 Shwachman-diamond syndrome(SBDS) 단백질과 신장 인자 유사 1 GTPase(EFL1) 사이의 상호 작용을 연구하기 위한 형광 이방성 기술에 대해 설명합니다. EFL1의 농도가 점차적으로 증가하는 SBDS 단백질을 배양할 때 이방성의 꾸준한 증가가 관찰되어 두 단백질 간의 성공적인 상호 작용을 나타냅니다.

Fluorescence Anisotropy-based Detection of Protein-Protein Interaction(단백질-단백질 상호작용의 형광 비등방성 기반 검출)

이 프로토콜 단백질 호모-oligomerization에서 체 외에 상업 조명 현미경 검사를 사용 하 여 형광 변동 분광학에 따라 측정을 위한 보정 없는 접근을 설명 합니다. 올바른 인수 설정 및 분석 방법을 표시 됩니다.

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

단백질 단백질 상호 작용은 생물 학적 시스템에 대 한 중요 한 고 단백질 복합물의 기능과 역학에 대 한 통찰력을 제공 하는 바인딩 활동의 연구. 형광 공명 에너지 전달 및 중지 흐름 기법을 사용 하 여 복잡 한 단백질의 운동 매개 변수를 수량화 하는 방법을 설명 합니다.

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

우리는 FLIM-FRET 측정을 사용하여 살아있는 슈도모나스 aeruginosa에서 두 개의 고도로 다르게 표현된 단백질 사이 단백질 단백질 상호 작용을 특징짓는 프로토콜을 여기에서 기술합니다. 이 프로토콜에는 박테리아 변형 구조, 박테리아 고정, 이미징 및 이미징 후 데이터 분석 루틴이 포함됩니다.

살아있는 박테리아에서 단백질 단백질 상호 작용의 FLIM-FRET 측정.

두 형광단 분자 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수용체의 감작 방출을 감지하고 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 기증자 분자의 소멸을 통해 살아있는 세포에서 FRET를 측정하는 방법에 대한 프로토콜이 제공됩니다.

FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가

단일 분자 형광 에너지 전달은 리보소말 단백질 합성 시 tRNA 역학을 추적하는 방법입니다. 개별 리보솜을 추적함으로써, 불동성 집단 집단이 식별되어 메커니즘에 빛을 비추게 됩니다. 이 방법은 다른 많은 복잡한 생물 시스템에서 동적 기능 관계를 밝히기 위해 일반적으로 생물학적 형성 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 단일 분자 방법은 평균 효과로 인해 기존의 앙상블 방법에 의해 접근할 수 없는 비비율 제한 단계 및 낮은 인구밀도키 중간체를 관찰할 수 있다.

리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

여기서 우리는 BiFC 기반 FRET-FLIM 분석법에 의한 형광 태그 단백질을 사용하여 3개의 단백질 파트너 간의 삼차 복합 형성을 시각화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 생체 내에서단백질 단백질 상호 작용 복합체를 연구하는 데 유용합니다.

BIFC-FRET-FLIM 분석체에 의한 MADS 박스 전사 계수의 두 단백제와 칼슘 센서 단백질 간의 삼자 상호 작용 결정

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

학습하세요 3색 단일 분자 FRET 기술을 사용하여 복잡한 단백질 시스템의 동역학을 정량적으로 연구하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 협력성 및 상관된 상호작용을 분석하여 생물학적 시스템에서 단백질 역학을 이해하는 데 도움을 줍니다.

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

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