탠덤 질량 분석

탠덤 질량 분석법은 여러 단계의 질량 분석법을 연결하여 먼저 생체 분자를 분리한 다음 화학적 구성의 측면을 결정합니다. 생체 분자는 크고 복잡한 구조를 가지고 있어 분자 구성을 결정하기 어렵습니다. 탠덤 질량 분석법은 나중에 여러 소단위로 단편화되는 관심 분자를 선택하여 식별 및 염기서열을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 비디오는 탠덤 질량 분석법의 개념, 일반적인 절차 및 생화학에서의 일부 용도를 보여줍니다.

탠덤 질량 분석법은 일반적인 질량 분석기로 시작하며, 시료를 이온으로 변환하는 이온 소스와 질량 대 전하 비율에 따라 이온을 분리하는 질량 분석기를 사용합니다. 일반적인 질량 분석기인 Quadrupole은 특정 비율의 이온만 통과시키는 반면 다른 이온은 장치의 막대에 충돌합니다. 전구체 이온(precursor ion)이라고 불리는 통과할 수 있는 종은 관심 있는 생체 분자입니다. 이온은 일반적으로 다른 사중극자인 충돌 셀로 이동하여 예측 가능한 패턴으로 이온을 조각화하기 위해 에너지가 가해집니다.

이러한 단편은 time-of-flight와 같은 다른 질량 분석기로 이동하여 이러한 “생성물 이온”을 분리합니다. 그런 다음 생성물 이온은 일반 MS 기기에서와 같이 검출기로 보내집니다. 알려지지 않은 단백질의 경우, 생성된 스펙트럼에는 수많은 중첩 단편이 포함되어 있어 생체 분자의 결정적이고 완전한 염기서열을 생성하기가 어렵습니다. 그러나 스펙트럼 패턴은 주어진 단백질에 대해 고유합니다. 분석 소프트웨어는 스펙트럼을 알려진 펩타이드 염기서열의 데이터베이스와 비교하여 중첩된 단편에서 알려지지 않은 단백질을 규명합니다.

시료 및 원하는 단편화 정도에 따라 여러 단편화 방법이 가능합니다. 단편화 패턴은 에너지가 어떻게 전달되는지, 에너지의 양, 그리고 전구체 이온을 통해 어떻게 분포되는지에 따라 달라집니다. 에너지는 중성 입자, 방사선 또는 전자를 통해 전달될 수 있습니다. 충돌 유도 해리(collision-induced dissociation, CID)라고 하는 과정인 중성 원자를 사용하면 주로 아미노산 사이의 펩타이드 결합을 절단하여 아미노산 식별에 이상적입니다.

이제 이 기술의 기초를 다루었으므로 박테리아 세포 외피의 구성 요소를 연구하는 데 사용되는 CID 탠덤 질량 분석법을 살펴보겠습니다.

모든 질량 분석 실험과 마찬가지로 첫 번째 단계는 샘플을 이온화하는 것입니다. 생체 분자의 경우, 이는 일반적으로 매트릭스 보조 레이저 탈착 또는 전기 분무 이온화로 수행됩니다. 그런 다음 전구체 이온 신호는 이온 광학 장치를 조정하여 최적화됩니다. 완료되면 대상이 격리되고 CID와 같은 단편화 방법이 선택됩니다.

충돌 셀로의 전구체 이온을 가속하는 인가 전압의 강도는 단편화 정도에 영향을 미칩니다. 이 전압은 전구체가 가장 높은 생성물 이온에 비해 약 10% 존재할 때까지 증가합니다. 충분한 신호 대 잡음비가 달성될 때까지 다중 스펙트럼을 획득하고 평균화합니다. 필요한 스캔 횟수는 원래 전구체 이온의 신호 강도에 따라 달라지며 범위는 3에서 300까지입니다.

이 예시의 분석물인 대장균 K-12의 지질 A는 CID 이후 19개의 주요 단편을 가지고 있었습니다. 지질 A의 일반적인 구조는 잘 알려져 있어 소프트웨어가 샘플의 특정 조성을 재구성할 수 있습니다.

지금까지 절차를 살펴보았으니, 이제 탠덤 질량 분석법이 생화학에서 사용되는 몇 가지 방법을 살펴보겠습니다.

탠덤 질량 분석법의 일반적인 스캐닝 모드는 selected reaction monitoring(SRM)입니다. SRM에서 두 질량 분석기는 모두 특정 전구체 및 생성물 이온에 초점을 맞춰 선택된 질량 대 전하 비율로 고정됩니다. SRM의 높은 감도로 인해 알려진 농도의 펩타이드 표준물질 스펙트럼을 활용하고 알려지지 않은 샘플의 스펙트럼과 비교할 수 있으므로 관심 단백질을 정량화할 수 있습니다.

단백질은 일반적으로 번역 후에 변형되며, 일반적으로 메틸기, 인산기 또는 글리칸으로 알려진 당과 같은 작용기의 첨가에 의해 변형됩니다. 이는 세포 신호 전달 과정에서 중요하며, 세포가 서로 어떻게 소통하는지 설명합니다. 탠덤 질량 분석법은 단백질을 더 작은 구성 요소로 조각화하기 때문에 특정 단편 또는 아미노산에 대한 PTM의 위치를 결정할 수 있습니다. 아세틸화(acetylation) 및 트리메틸화(trimethylation)와 같은 일부 변형은 질량만으로는 구별하기 어렵기 때문에 크로마토그래피 분리는 질량 분석 전에 수행됩니다.

환자의 혈액 내 많은 분석물은 일반적인 질량 분석법의 검출 한계 이하의 농도에서 발견됩니다. SRM의 또 다른 장점은 하나의 생성물 이온을 제외한 모든 이온을 버리기 때문에 감도가 증가하고 검출 한계가 하한을 최대 100배까지 높일 수 있다는 것입니다. 이 예에서 면역억제제인 tacrolimus는 1ng/mL 수준에서 검출될 수 있습니다.

탠덤 질량 분석법에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청하셨습니다. 이 비디오는 기기의 이론을 설명하고, 일반적인 절차를 살펴보고, 이 기술이 현재 활용되고 있는 몇 가지 방법을 설명했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!