Name: 양이 많은 음식 섭취 량 분석을 결합 하 고 강제로 초파리 에서 식욕을 공부 하는 뉴런을 활성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster에서 색소 표식 식품을 이용한 정량적 식이량 측정 방법으로 신경회로 조작을 통해 식욕 조절 메커니즘을 연구하는 고효율 스크리닝 기법을 탐색하세요.

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이 작품 국가 기본 연구 프로그램의 중국 (2012CB825504), 국립 자연 과학 재단의 중국 (91232720 및 9163210042), 중국 아카데미의 과학 (CAS) (GJHZ201302 및 QYZDY-남동-SMC015)에 의해 부분적으로 지원 되었다 빌과 멜 린다 게이츠 Y. zhu CAS의 기초 (OPP1119434), 및 100-재능 프로그램.

1. 먹이 챔버 준비
참고: 먹이 챔버 염료 라벨 먹이 분석 결과 대 한 두 부분으로 구성: (표지)로 외부 컨테이너와 내부 (식량)와 컨테이너.
<ol><li>수정 (31.8 m m 내부 직경)와 80 m m의 높이 초파리 배양에 대 한 유리 병에서 외부 컨테이너 (그림 1A, 1 C). 1 %agarose 제대로 먹이 설치 계속 (5 mL)의 층으로 컨테이너의 하단 습도 및 (그림 1B)를 따라 걸을 파리에 대 한 부드러운 기판으로 커버. 컨테이너는 그로 인하여 최소한의 스트레스와 파리에 소동 들고 제어 하지만 자연 분위기를 제공 합니다.<ol>
<li>외부 컨테이너를 준비 합니다. 두 배 증류수, 자주 교 반, 열 50 ml에서 agarose의 0.5 g을 일시 중단 하 고 자력 열 플레이트에 완전히 분해 비등.</li>
		<li>때 약 60 ℃, 1 %agarose 냉각 컨테이너 (그림 1B), 외부 빈에 1 %agarose 5 mL을 전송 하 고 컨테이너는 agarose 패드를 실내 온도에 냉각 될 때까지 열려 있어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>염료-표시 된 음식을 준비 합니다. 염료-표시 된 식품의 구성 다른 실험적인 목적에 따라 다릅니다. 여기만 자당 포함 된 염료 표시 된 음식 준비의 예가입니다.<ol>
<li>두 배 증류수, 자주 교 반, 열 50 ml agarose의 0.5 g을 추가 하 고 열 플레이트 자력에 완전히 분해 비등.</li>
		<li>언제 위의 1 %agarose 약 60 ° C에 냉각, 100mm 자당을 얻기 위해 agarose를 자당의 1.71 g을 추가 합니다.</li>
		<li>0.5% (w/v) 염료 라는 음식을 얻기 위해 agarose 솔루션에 파란색 염료 (erioglaucine disodium) 0.25 g을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>내부 준비 컨테이너. 컨테이너 안에 빈 평면 수평 표면에 다음 추가 750 µ L 음식의 파란색 염료 표시 된 개별 음식 콘테이너, 적어도 5 분 동안 공고히 하자. 참고: 내부 컨테이너는 13.6 m m의 내부 직경 및 높이 7.5 m m (그림 1A 1 C) 작은 플라스틱 접시. 그것은 염료 라는 음식으로 가득 하 고 외부 컨테이너의 agarose 패드의 가운데에 배치 됩니다.</li>
	<li>준비 된 외부 컨테이너에 컨테이너 내부는 채워진 전송 및 agarose 패드의 중심에 위치. 먹이 챔버 외부 컨테이너의 벽은 응축의 무료 때까지 40 분 동안 실내 온도에 열려 있을 게. 참고: 벽은 물 하락에 연락 하 여 벽에 붙어 되 고에서 파리를 방지 해야 합니다.</li>
	<li>염료-무료 음식 먹이 챔버 준비 (동일한 구성 없이 하지만 염색) 배경 빼기.</li>
</ol>2입니다. 파리의 준비
참고: 성인 여성의 5 ~ 10 일 후 일수로 분석 실험을 먹이 기를 위해 일반적으로 사용 됩니다 파리. 파리의 유전 컨트롤을 포함 하 여 다른 genotypes 준비 하 고 동시에 테스트 하는 것이 좋습니다. (한 먹이 챔버)에서 20 파리 한 데이터 포인트를 생성합니다.
<ol><li>성인 파리 양육 인구 밀도를 고려 하십시오. 일반적으로, 변종에 따라 부모의 파리의 개수와 문화 병의 크기를 변화 하 여 인구 밀도 제어 합니다. 예를 들어, 문화 병 (31.8 m m의 직경)와 80 m m의 높이에 15 남성 및 구획-S의 30 여성을 전송 하 고 1 일 후 제거 성인 파리 산란 암컷 하자.</li>
	<li>Thermogenetic 정품 인증에 대 한 파리를 준비 합니다.<ol>
<li>Gal4/UAS 시스템38 를 사용 하 여 UAS-dTrpA1 다른 GAL4 드라이버 라인 (그림 2B)와 파리 교차점에 의해 다양 한 뉴런에 dTRPA133 를 표현.</li>
		<li>22 ° C, 상대 습도 60%, 그리고 12 h/12 h 빛 어두운 주기의 표준 음식에 성인 파리를 유지.</li>
		<li>시험의 2 일 전에 먹이, 정렬 및 신선한 식품 유리병에 스테레오 현미경 CO2 플라이 패드에 파리를 수집 하 고 유리병 당 20 파리의 밀도 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optogenetic 활성화를 위한 파리를 준비 합니다.<ol>
<li>Gal4/UAS 시스템38 를 사용 하 여 다른 뉴런에 CsChrimson36 다른 GAL4 드라이버 라인 건너 UAS-CsChrimson 파리에 의해 표현 하.</li>
		<li>Eclosed (24 시간) 이내 파리 새로 수집 하 고 표준 음식 400 µ M 모든-trans-망막을 포함 하는 유리병에 그들을 전송.</li>
		<li>조기 활성화를 방지 하기 위해 포장 알루미늄 호 일 양육 튜브와 다음 원치 않는 가벼운 자극에서 파리를 보호 하기 위해 어두운 상자에 넣어. 25 ° C, 4-6 일 동안 어둠 속에서 60% 습도에서 파리를 유지.</li>
		<li>2 일 전에 먹이 분석 결과 정렬 여성 CO2 플라이 패드 스테레오 현미경의 밑에 난다. 20 파리 한 음식 유리병으로 수집 하 고 먹이 테스트 전에 어둠 속에서 그들을 유지.</li>
		<li>주변광에 의해 발생 하는 효과 피하기 위해 가능한 한 빨리 희미 한 빛 아래에서 모든 작업을 수행 합니다. 작업 영역에서 멀리 떨어져 배치 LED 램프를 사용 하 여, 작업 영역에서 강도 5 µW/c m2입니다. 참고: 굶 어 사용 구획-S 먹이 분석 결과 대 한 긍정적인 컨트롤로 파리. 식품의이 파리를 박탈 하 고 먹이 테스트 전에 24 h에 대 한 1 %agarose 유지 합니다. 이러한 파리의 식품 소비 수준을 하루 변동 평가 도움이 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. thermogenetic 활성화
<ol><li>Circadian 리듬 때문에 변이 최소화 하기 위해 Zeitgeber 시간 4-631,32, 주위 하루 중 같은 시간에 모든 먹이 실험을 실시 합니다.</li>
	<li>난방 환경으로 인큐베이터 (또는 온도 조절 히터와 작은 방)을 준비 합니다.</li>
	<li>행동 실험 전에 준비 먹이 실 실험 온도 (30 ℃)에서 온도 먹이 챔버에 상대 유니폼을 보장 하기 위해 2 시간에 대 한 equilibrate.</li>
	<li>먹이 프로세스를 시작 하려면 신중 하 게 전송 20 파리 그들의 가정 유리병에서 데워 먹이 챔버로 부드러운 드려서. 60 분 ( 그림 3A) . 30 ° C에서 먹이 프로세스 계속 참고: 잦은 실이 먹이 행동 저하 인큐베이터 문 개폐와 같은 따라서 한다 최소화.</li>
	<li>30 분 동안 먹이 실-80 ° C (-20 ° C)에서 동결 하 여 60 분에 수 유를 중단. 참고: 동시에 모든 실에 수 유를 중지를 동결 수 있습니다. 파리-80 ° C에서 냉동 두 가지 목적, euthanizing 파리 및 균질 최대 1 주일까지 저장을 위해 제공 합니다.</li>
	<li>온도 제어 그룹에 대 일 분 동안 22 ° C에서 먹이 과정을 시작 하려면 염료 색 음식 챔버를 먹이 실 온에 20 파리를 전송 합니다.</li>
	<li>30 분 동안 실-80 ° C (-20 ° C)에서 동결 하 여 온도 제어 그룹의 먹이 중단.</li>
</ol>4. Optogenetic 활성화
<ol><li>Circadian 리듬 때문에 변이 최소화 하기 위해 Zeitgeber 시간 4-631,32, 주위 하루 중 같은 시간에 모든 먹이 실험을 실시 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 전송 20 파리 한 유리병에서 먹이 챔버로 부드러운 두 드려서, 그리고 옆으로 챔버 (그림 4A, 4B) 조명 설치에.<ol>
<li>Optogenetic 조작에 대 한 오렌지 LEDs의 배열을 사용 하 여 (607 nm) 빛 자극, 그리고 수정 먹이 지 원하는 Led 위에 수평 플 렉 시 유리 접시 조명 동안 챔버의 근원으로. (그림 4A, 4B) 습도 60%와 25 ° C에서 인큐베이터 설치를 하십시오.</li>
		<li>자극 하는 동시에 유전자 제어 파리는 본뜬 > CsChrimson 파리, 하지만 다른 먹이 챔버.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오렌지 빛으로 다시 조명으로 60 분 동안 먹이 과정을 계속 합니다.<ol>
<li>Optogenetics에 대 한 최적의 조명 농도 실험적으로 결정36. 에 본뜬 > CsChrimson 파리, 2.2 mW/m m2 의 휘도 유도 마비 (운동의 정지) 및 자세 제어의 손실을 따라서, 0.1 mW/m m2 의 중간 강도 사용 하 여 본뜬 자극 > CsChrimson 먹이 테스트 기간 동안 파리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 분 동안 먹이 실-80 ° C (-20 ° C)에서 동결 하 여 수 유를 중단.</li>
</ol>5. 식품 소비 시각적인 추정
참고: 시각적 득점 방법은 식품 소비량의 반 정량적 평가 제공합니다. 광학 방법으로 객관적 이더라도,이 방법은 그것을 만드는 첫번째 적합을 신속 하 게 추가 테스트에 대 한 후보 유전자 스크린의 라운드 시기 비행 긴장의 많은 수를 통해가 수 있습니다.
<ol><li>수 유 후 anesthetize와 점수는 CO에 파리 스테레오 현미경2 플라이 패드. 볼륨 및 염료 색 음식의 복 부 (그림 2A)에서 강도에 따라 각 비행을 개별 점수를 제공 합니다. 참고: 기준 시각 추정에 대 한: 점수 시스템에 다른 볼륨 및 복 부에 색깔 음식의 농도 해당 하는 음식 섭취 량의 4 레벨.<ol>
<li>점수 0; 감지 염료 색 음식 없이 파리 그 희미 한 (거의 감지) 파란 염료 또는 염료 색 음식을 차지 하는 복 부의 볼륨의 1/3 미만 1의 점수를 제공 합니다.</li>
		<li>점수 2의 점수 복 부의 절반을 차지 하는 강렬한 염료 색 식품으로 이동 합니다.</li>
		<li>그 강렬한 염색 콘텐츠 점령 복 부의 절반 보다 큰 3 (그림 2A)의 점수를 점수.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 실험 조건 (그림 2B)에 다른 점수와 함께 파리의 비율을 계산 합니다.</li>
</ol>6. 색도계 정량화의 식품 소비
<ol><li>후의 수 유, 부 어는 먹이에서 모든 20 파리 종이, 무게의 조각에 챔버 다음 부드러운 브러쉬를 사용 하 여 1.5 mL 튜브에 그들을 전송 합니다. 참고: 감기 챔버에 물 응축 때문에 챔버 벽에 집착 하는 파리를 피하기 위해 같은 시간에-80 ° C 저장에서 챔버의 모든을 하지 마십시오.</li>
	<li>튜브에 PBST의 500 µ L을 추가 하 고 5에 대 한 60 Hz에서 분쇄 밀을 사용 하 여 파리를 균질 s.<ol>
<li>본문 부분의 없습니다 감지 조각 있을 때 충분 한 균질 관찰 하 여 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>잔해를 13000 rpm에서 30 분 동안 homogenates 튜브를 회전 합니다.</li>
	<li>원심, 후 상쾌한의 100 µ L 96 잘 접시의 전송.</li>
	<li>모든 샘플을 로드 630에서 샘플의 흡 광도 측정 하는 플레이트 리더에 접시를 넣어 nm.</li>
	<li>배경 흡 광도 제거, 파리에서 supernatants의 흡 광도를 상쾌한 블루 음식 먹이 파리에서의 흡 광도에서 염료 없이 음식을 먹이. 참고: 이 단계는 사용 하는 식품의 구성에 따라 선택 사항입니다. (염료) 없이 비행 음식 630에서 흡 광도 생성 하는 때 nm, 그것은 백그라운드를 제거 하려면이 단계를 수행 하는 데 필요한.</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

이 보고서는 thermogenetic의 맥락에서 소비 식품의 염료 라벨 먹이 분석의 기술 과정에 초점을 맞추고 먹이 제어 하는 optogenetic 활성화 뉴런을 조작 하 고. 이 간단 하 고 신뢰할 수 있는 프로토콜 제어, 파리의 음식 선호도 측정 하 고 먹이 기반 유전 스크린24통해 먹이 제어 회로에 새로운 플레이어를 식별 하 먹이에 후보 뉴런의 기능을 명료 하 게 하는 데 도움이 됩니다.
염료 라벨 전략은 단기 먹이 행동 조사에서 가능 합니다. 염료, erioglaucine disodium에 녹이 고, 음식 섭취 식품 소비의 중요 한 지표 이다. Deshpande 외. 시연 파란색 염료 자체 카페 분석 결과와 음식 섭취 량 분석 결과17라벨 방사성 측정 때 먹이에 아무런 영향을 보여주었다. 마찬가지로, 우리의 당 결과 (염료 표시 또는 염료 무료 100 m m 자당 솔루션 파리의 다리 자극...

섭취 하는 음식의 양을 측정 하는 것이 먹이 (기아 상태) 등 내부 요구와 외부 요인 (예: 식품 품질과 palatability)1, 에 두뇌에 의해 컨트롤의 여러 측면을 평가 하기 위한 중요 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. 최근 몇 년 동안, 초파리 에서 제어를 먹이 기의 신경 기질을 해독의 노력 직접 섭취 하는 음식의 양을 계량 또는 동기 부여를 먹이의 지표로 서 역할을 다 분석 실험의 발전으로 이어질 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
모 세관 급지대 (카페) 분석 결과12,13 유리 microcapillary에서 액체 식품의 소비 금액을 측정 하기 위해 개발 되었다. 카페 분석 결과 매우 민감하고 재현할 수17 이며 음식 소비, 특히 장기 먹이18측정의 측정을 간소화 합니다. 그러나,이 분석 결과 microcapillary의 끝에 상승 하 고 있는 모든 긴장에 적합 하지 않습니다 거꾸로, 피드 파리를 요구 한다. 또한, 카페 분석 결과 사용 하 여 테스트할 파리 액체 식품에 reared 하기 때문에, 이러한 대사 상태 또는 잠재적인 영양 조건을 양육의 효과 결정 될 남아 있습니다.
코 확장 응답 (%) 분석 결과11,14 식품 상품의 부드러운 접촉으로 코 확장 응답의 주파수를 계산합니다. 분석 결과 평가 하는 우수한 방법으로 입증 당 palatability의 영향 및 음식18,19의 내용을 개별 비행 및 엉덩이의 동기 부여를 먹이. 그러나, 그것의 섭취 양 직접 정량화 아니다.
최근, 반자동 방법, 분석 결과 (MAFE)15, 먹이 매뉴얼 개발 되었다. MAFE에서 하나의 고정된 비행 수동으로 음식을 포함 하는 microcapillary와 함께 먹이입니다. 그 코 확장 반응과 식품 소비를 동시에 모니터링할 수 있습니다, MAFE는 영양 가치와 약리 조작의 효과 평가 적합 합니다. 그러나, 비행을 immobilizing 수 있습니다 부정적인 영향을 행동 성능, 먹이 포함 하 여.
또한, 코를 비행 하 고 활동 검출기 (FlyPAD)10 자동으로 먹이 행동 척도를 개발 되었다. 머신 비전 방법을 사용 하 여, FlyPAD 비행 및 동기 부여를 먹이의 지표로 서 주파수와 코 확장의 기간을 계량 하는 음식 간의 실제 상호 작용을 기록 합니다. FlyPAD는 민감도이 시스템의 견고를 더욱 더 남아 있지만 무료 이동 파리의 먹이 행동을 모니터링 하는 높은 처리량 접근 연구12제공 합니다.
레이블 전략 자주 파리에 음식 섭취를 추정 하는 데 사용 됩니다. 그것은 일반적인 음식 화학 추적기와 라벨, 수 유, 후 음식 섭취 량의 수량을 계산 하기 위해 섭취 한 추적의 양을 측정. 방사성 트레이 서16,17,20,21,22,23,,2425 표 피를 통해 검색 허용 파리 균질 하지 않고 이 방법은 현저 하 게 낮은 다양성 및 높은 감도18, 제공 하 고 음식 섭취 량의 장기 유학 가능. 그러나, 사용 가능한 radioisotopes의 가용성 및 흡 광도 배설의 다른 비율 취해야 한다 고려 사항으로이 분석 결과 사용 하는 경우.
라벨링 및 비 독성 식품과 음식 섭취 량을 추적 한 안전 하 고 간단 하 게 대체2,3,26,,2728이다. 파리는 수용 성 및 비 흡수 염료를 포함 하는 음식을 먹이 후 무 균 그리고 섭취 염료의 금액은 나중에 분 광 광도 계3,,2428,29 사용 하 여 계량 . 라벨 전략 수행 쉽습니다 및 높은 효율성을 제공 하지만 경고와 함께. 음식 섭취 량 섭취 염료에서 추정의 볼륨은 배설 파리17수 유 시작 후 15 분 일찍 시작 되기 때문에 실제 볼륨 보다 작습니다. 또한, 분석 결과 일반적으로 기간 내에 60 분만 단기 먹이 행동24,28의 조사를 위해 적합 하다는 음식 섭취를 평가 합니다. 또한, 유전자 형17,17, 성별 등 여러 내부 및 외부 요인 상태17, 밀도30,32circadian 리듬31,및 식품 품질3 양육 성관계 , 8 , 16, 영향 음식 섭취 량입니다. 따라서, 먹이 기간 특정 실험 조건에 따라 조정 해야 합니다. 음식 섭취 량의 정량화를 촉진, 외 식품 식품 선택2,,1927, 평가 하 고 시각화 카페 분석 결과12에 microcapillary에서 초승달 모양에도 사용 됩니다.
여기, 염료 라벨 방식으로 신경 활동의 결합 프로토콜 조작을 소개합니다. 이 전략 성인 과일 파리24제어를 먹이 기에 우리의 neurogenetic 연구에 유용한 입증 되었습니다. 식품 소비;의 빠른 평가 위한 시각적 득점 메서드 사용 따라서, 시기에 종자의 큰 숫자를 통해 심사에 대 한 유용합니다. 화면에서 후보자는 다음 자세히 객관적이 고 정확한 정량화 추가 연구를 제공 하는 색도계 방법을 사용 하 여 분석 됩니다.
먹이 분석 실험, 게다가 우리는 또한 thermogenetic27,33,34,35 및 optogenetic36 의 메서드 강제로 대상 초파리에서 신경 세포를 활성화 설명 합니다. Thermogenetic 신경 활성화 작업이 간단 하 고 편리한 초파리 와 일시적 수용 체 잠재적인 Ankyrin 1 (dTRPA1)는 신경 흥분을 증가 온도 및 전압 문을 단 양이온 채널 때 주위 온도 23 ° C33,37; 올라가면 그러나, 높은 온도에서 동물 테스트 동작에 악영향을 생성할 수 있습니다. 또 다른 효과적인 방법은 초파리 에서 신경 세포를 활성화 하는 사용 optogenetics CsChrimson36, 빛에 노출 되 면 신경 세포의 흥분 성 증가 channelrhodopsin의 빨간색 이동 변종입니다. Optogenetics 더 높은 시간 해상도 thermogenetics 보다 덜 방해 동작을 제공합니다. 신경 활동의 조작으로 음식 섭취 량의 정량적 측정을 결합 하 여 먹이의 신경 메커니즘을 공부에 대 한 효과적인 접근 방식을 나타냅니다.
우리가 먹이 챔버와 파리의 준비 테스트를 자세히 설명 합니다. 본뜬 Gal4 파리를 사용 하 여 모델24, thermogenetics 및 optogenetics에 의해 활성화 신경 설명 합니다. 염료-표시 된 식품 식품 소비의 정량화의 2 개의 분석 실험 또한 프로토콜에서 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>UAS-CsChrimson</td><td>Bloomintoon</td><td>55135</td><td></td></tr><tr><td>UAS-dTrpA1</td><td>Bloomintoon</td><td>26263</td><td></td></tr><tr><td>TDC1-GAL4&nbsp;</td><td>Bloomintoon</td><td>9312</td><td></td></tr><tr><td>TDC2-GAL4</td><td>Bloomintoon</td><td>9313</td><td></td></tr><tr><td>sNPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Z. Zhao</td></tr><tr><td>제공 NPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Y. Rao</td></tr><tr><td>제공 TH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Y. Rao</td></tr><tr><td>제공 5-HT-GAL4</td><td></td><td></td> Y<td>. Rao</td></tr><tr><td>AKH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Y. Rao 제공</td></tr><tr><td>DIP2-GAL4</td><td></td><td></td><td>제공 Y. Rao</td></tr><tr><td>Taotie-GAL4</td><td></td><td></td><td>제공 J. Carlson</td></tr><tr><td></td><td>Agarose Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td>Sigma S7903</td><td></td></tr><tr><td>Erioglaucine disodium salt</td><td>Sigma</td><td>861146</td><td></td></tr><tr><td>all-trans-retinal&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>어둠 속에 보관된</td> <td>R2500</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>9002-93-01</td><td></td></tr><tr><td>플라이 푸드</td><td></td><td>1 L 식품 포함: 77.7 g 옥수수 가루, 32.19 g 효모, 5 g 한천, 0.726 g CaCl2, 31.62 g 자당, 63.2 g 포도당, 2 g 포타슘 소르베이트, pH&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; PBS 버퍼 1개&nbsp;</td><td></td><td>1 L 1X PBS 포함: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4</td><td></td></tr><tr><td>PBST 버퍼</td><td></td><td>1X PBS with 1% Triton X-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 그라인딩 밀</td><td>Shang Hai Jing Xin</td><td>Tissuelyser-24</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Ning Bo Jiang Nan</td><td>HWS-80</td><td></td></tr><tr><td>자석 교반기 열판이 있는</td><td>Chang Zhou Bo Yuan</td><td>CJJ 78-1</td><td></td></tr><tr><td>분광계</td><td>Thorlabs</td><td>CCS200/M</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Multiskan GO 유형: 1510, REF 51119200</td><td></td></tr><tr><td>형광 실체 현미경&nbsp;</td><td>라이카</td><td>&nbsp; M205FA</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica&nbsp;</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>외부 용기</td><td>Jiang Su Hai Men</td><td>유리 바이알 직경 31.8mm, 높이 80mm(내부 치수)</td><td></td></tr><tr><td>내부 용기&nbsp;</td><td>직경 13.6mm, 높이 7.5mm(내부 치수)</td><td></td>의 <td>베이징 Yi Ran 기계 공장</td> 플라스틱 접시</tr> <tr><td>1.5 mL Eppendorf 튜브</td><td>Hai Men Ning Mong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 96 웰 플레이트</td><td>Corning Incorporated</td><td>&nbsp; Costar 3599</td><td></td></tr><tr><td>LEDs</td><td>Xin Xing Yuan Guangdian</td><td>607 nm, 3W&nbsp;</td><td>https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058</td></tr></tbody></table>

양이 많은 음식 섭취 량 분석을 결합 하 고 강제로 초파리 에서 식욕을 공부 하는 뉴런을 활성화

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

식품 소비는 생리 적 상태, palatability, 음식, 그리고 문제 명령을 시작 하거나 수 유 중지의 영양 내용을 통합 하는 두뇌의 꽉 제어. 밑에 시기 적절 하 고 적당 한 먹이 제어와 관련 된 생리 적, 심리적 장애의 우리의 이해에 운반의 주요 의미를 먹이의 의사 결정 프로세스 파악 간단 하 고, 양적, 강력한 메서드는 강제로 특정 대상 뉴런의 활동을 증가 하는 등 실험적인 조작 후 동물의 음식 섭취를 측정 하는 데 필요한. 여기, 우리는 성인 초파리에 제어를 먹이 기의 neurogenetic 연구를 촉진 하기 위하여 먹이 분석 염료-라벨-기반으로 도입. 우리가 사용할 수 먹이 분석, 검토 하 고 우리의 방법 thermogenetic 결합 분석 및 염료 표시 된 음식 섭취 량 분석 결과와 먹이 동기를 제어 하는 신경 세포의 optogenetic 조작 설치에서 단계별 설명. 우리는 또한 장점과 독자 적절 한 분석 결과 선택할 수 있도록 다른 먹이 분석 실험에 비해 우리의 방법의 한계를 설명.

Thermogenetic 스크린입니다.
식욕 비정상적으로 증가 하면 생리 적 요구에 높은 음식 섭취 량. 높은 처리량을 디자인 하는이 제도 활용 하는 우리 행동 신경 세포의 유전 핸들을 얻기 위해 기아와 관련 된 화면과 만족 상태 (그림 1). 화면 본뜬 Gal424나왔고. 본뜬 Gal4 뉴런은 강제로 30 ° C에 활성화 될 때는 본뜬 &gt; TrpA1 컨트롤 (그림 2, 그림 3) 보다 식품의 대량 섭취 파리.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

염색 음식 양이 많은 음식 섭취 량 분석 제공 하는 강력한 고 높은 처리량 먹이 동기 평가를 의미 합니다. 결합 식품 소비 분석 결과 thermogenetic 및 optogenetic 스크린은 성인에서 식욕을 기본 신경 회로 조사 하는 강력한 접근 방식을 초파리 melanogaster.

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

이 절차의 전반적인 목표는 성인 초파리의 음식 섭취량을 정량적으로 측정하는 것이며, 이는 뉴런의 열유전학 및 광유전학적 활성화와 같은 유전자 조작의 영향을 평가할 수 있는 수단을 제공합니다. 이러한 측정은 배고픔, 포만감 및 식욕의 신경 역학과 같은 사료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 그룹의 파리의 음식 섭취량을 동시에 정량화하여 유전자 검사에서 비정상적으로 먹이를 먹는 파리를 식별하는 데 특히 유용하다는 것입니다.시작하려면 외부 용기를 준비하기 위해 보급품을 모으십시오. 아가로스 0.5g과 이중 증류수 50ml를 현탁합니다. 잦은 교반으로 가열하고 가열판이 있는 자석 교반기에 완전히 녹도록 끓입니다.1%의 아가로스가 약 섭씨 60도까지 냉각되면 5ml를 빈 외부 용기에 옮기고 아가로스가 실온으로 냉각되어 아가로스 패드가 생성될 때까지 용기를 열어 둡니다. 다음으로, 이중 증류수 0.5ml에 아가로스 50g을 추가합니다. 잦은 교반으로 가열하고 끓여서 가열판이 있는 자석 교반기에 완전히 녹입니다.1% 아가로스가 약 섭씨 60도로 냉각되면 아가로스에 1.71g의 자당을 첨가하여 100밀리몰의 자당을 얻습니다. 아가로스 용액에 0.25g의 파란색 염료를 첨가하여 염색된 라벨이 붙은 식품의 부피당 0.5%중량을 얻습니다. 그런 다음 내부 용기를 준비합니다.빈 내부 용기를 평평한 수평면에 놓습니다. 그런 다음 750마이크로리터의 파란색 염료 라벨이 붙은 식품을 개별 식품 용기에 추가합니다. 최소 5분 동안 굳게 두십시오.채워진 내부 용기를 준비된 외부 용기에 옮기고 아가로스 패드 중앙에 놓습니다. 배경 빼기를 위해 염료가 없는 음식이 있는 수유실을 준비합니다. 외부 용기의 벽에 결로가 없어질 때까지 수유 챔버를 실온에서 40분 동안 열어 두십시오.행동 실험 전에 준비된 급식 챔버를 섭씨 30도의 실험 온도에서 2시간 동안 평형을 유지하여 급식 챔버의 온도가 비교적 균일한지 확인합니다. 먹이를 주려면 집에 있는 바이알에서 파리 20마리를 부드럽게 두드려 예열된 먹이 챔버로 조심스럽게 옮깁니다. 섭씨 30도에서 60분 동안 수유 과정을 계속합니다.급식실을 섭씨 영하 80도에서 30분 동안 얼려 수유를 중단합니다. 한 바이알에 있는 파리 20마리를 부드럽게 두드려 먹이 챔버로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 챔버를 조명 설정에서 옆으로 놓습니다.광유전학적 조작을 위해 주황색 LED 어레이를 광 자극원으로 사용하고 LED 위에 수평 플렉시 유리판을 고정하여 조명 중 공급 챔버를 지지합니다. 인큐베이터에서 섭씨 25도, 습도 60%로 설정하십시오. 유전 제어 파리를 Taotie-GAL4 UAS CsChrimson 파리와 병렬로 자극하지만 다른 먹이 챔버에서 파리를 만듭니다.주황색 조명으로 다시 조명을 비추면서 60분 동안 수유 과정을 계속합니다. 그런 다음 급실을섭씨 영하 80도에서 30 분 동안 동결합니다. 먹이를 준 후 먹이실에서 20마리의 파리를 모두 계량지 한 장에 붓습니다.그런 다음 부드러운 브러시를 사용하여 1.5ml 튜브에 옮깁니다. 튜브에 500마이크로리터의 PBST를 추가하고 60헤르츠의 분쇄기를 사용하여 5초 동안 파리를 균질화합니다. 그런 다음 검출 가능한 신체 부위 조각이 없을 때 관찰을 통해 충분한 균질화를 확인합니다.1300RPM에서 30분 동안 균질액으로 튜브를 돌려 이물질을 제거합니다. 원심분리 후 100마이크로리터의 상등액을 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 파편으로 인한 흡수제의 계산 착오를 방지하려면 원심분리기에서 사용된 튜브를 부드럽게 꺼내 팔레트를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 떨어뜨립니다.모든 샘플이 로드된 후 플레이트를 플레이트 리더에 놓고 630나노미터에서 샘플의 흡수제를 측정합니다. 섭식 반응은 장에서 검출 가능한 염료로 파리를 육안으로 검사하고 점수를 매겨 정량화했습니다. Taotie 뉴런이 활성화된 후 Taotie dTRPA1 파리의 약 58%가 강력한 섭식 행동을 보였습니다.그리고 이 중 23%는 가벼운 섭식 행동을 보였습니다. TRPA1에 의한 급성 활성화 Taotie-GAL4 뉴런은 음식 섭취를 극적으로 증가시켰으며, 이는 Taotie-GAL4 표지 뉴런이 성인 초파리의 음식 섭취 조절에 참여한다는 것을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 성인 Drosophila melanogaster에서 섭식 조절의 신경 메커니즘을 조사하기 위해 뉴런의 활동을 조작한 후 음식 섭취량을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

combining-quantitative-food-intake-assays-forcibly-activating-neurons

Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

Drosophila의 애벌레는 gustatory 보상과 냄새 자극을 연결 할 수 있습니다. 여기 appetitive 연관 후각 학습의 분석을 할 수있는 간단한 행동 패러다임을 설명합니다.

에 Appetitive 연관 강한 학습<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레

이 비디오는 선호 물질을 섭취한 후 파리의 복부 착색을 평가하여 맛이 다른 착색 용액에 대한 매력 또는 회피를 측정하는 데 사용되는 행동 방법인 미각 선호도 분석에 대해 설명합니다. 주요 프로토콜은 다양한 자당 농도의 용액에 대한 파리의 선호도를 측정하는 데 사용되는 절차를 보여줍니다.

Taste Preference Assay: 초파리의 섭식 행동을 측정하는 방법

이 동영상은 제한되지 않은 초파리의 먹이 섭취와 선호도를 측정하는 행동 방법인 CApillary FEeder 또는 CAFE 분석에 대해 설명합니다. 주요 프로토콜은 음식을 전달하고 섭취량을 추적하는 데 사용되는 액체로 채워진 모세혈관에서 증발을 최소화하면서 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다.

CApillary FEeder (CAFE) 분석: 초파리의 식품 소비 및 선호도를 추적하는 방법

이 비디오 문서에서는, 우리는 초파리 비행 성인 과일의 후각에 의존 식품 검색 행동에 대한 배고픔이나 포만감의 효과를 측정 할 수있는 자동화 된 분석을 설명합니다.

먹이 찾아 돌아다 행동에 대한 단일 비행 분석에 초파리

우리는 보람 유도 및 보상 상태의 변화에 대한 조치로 자발적인 에탄올 소비를 사용하여 초파리 (Drosophila의 melanogaster의) 경험을 nonrewarding위한 프로토콜을 설명합니다.

사용 보상 추구 행동의 변화를 측정하는 간단한 방법<em&gt; 노랑 초파리</em

CApillary FEeder (CAFE) 분석은 음식 섭취의 기저에 있는 메커니즘을 조사하기 위한 간단하고 예산 친화적이며 매우 신뢰할 수 있는 방법입니다. 다재다능한 유전자 모델 유기체인 Drosophila melanogaster와 함께 사용되는 이 제품은 음식 섭취의 조절 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 강력한 수단을 제공합니다.

모세관 공급 분석은 식품 섭취를 측정<em&gt; 노랑 초파리</em

여기에 설명된 프로토콜은 다른 다량 영양소 품질의 식단에 노출된 Drosophila 멜라노가스터 애벌레에 의해 정의된 시간 간격 내에 섭취되는 음식의 양을 정량화할 수 있도록 하는 프로토콜이다. 이 소는 신경 열유전학 스크린의 맥락에서 행해질 것입니다.

드로소필라 애벌레를 사용하여 열유전학 신경 화면에서 다량 영양소 섭취의 정량화

우리는 파리에 대한 두 선택 먹이 분석에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 수유 분석은 빠르고 실행하기 쉬우며 소규모 실험실 연구뿐만 아니라 파리의 고처리량 행동 스크린에도 적합합니다.

드로소필라의 신속한 식품 선호 분석

마이크로 플레이트 피더 분석법은 Drosophila에서액체 음식 소비를 정량화하기 위한 경제적이고 높은 처리량 방법을 제공합니다. 3D 프린팅 장치는 파리가 트레이서 염료로 공급 용액을 소비하는 1536웰 마이크로 플레이트에 파리가 보관되는 96웰 마이크로 플레이트를 연결합니다. 용액 량 감소는 분광계로 측정됩니다.

드로소필라에서 소비의 정량화를 위한 높은 처리량 마이크로 플레이트 피더 분석

칼슘 이미징 접근법은 용액이 라벨에 적용되는 동안 깨어 있는 파리의 뇌에서 미각 유도 반응을 기록할 수 있습니다. Drosophila melanogaster 의 1차 미각 반응이 예로 사용되지만 이 프로토콜은 다운스트림 뉴런 또는 다른 종을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

생체 내 성체 초파리에서 미각 유도 신경 반응의 칼슘 이미징

학습하세요 Drosophila melanogaster에서 색소 표식 식품을 이용한 정량적 식이량 측정 방법으로 신경회로 조작을 통해 식욕 조절 메커니즘을 연구하는 고효율 스크리닝 기법을 탐색하세요.

양이 많은 음식 섭취 량 분석을 결합 하 고 강제로 초파리 에서 식욕을 공부 하는 뉴런을 활성화

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