양이 많은 음식 섭취 량 분석을 결합 하 고 강제로 초파리 에서 식욕을 공부 하는 뉴런을 활성화

이 절차의 전반적인 목표는 성인 초파리의 음식 섭취량을 정량적으로 측정하는 것이며, 이는 뉴런의 열유전학 및 광유전학적 활성화와 같은 유전자 조작의 영향을 평가할 수 있는 수단을 제공합니다. 이러한 측정은 배고픔, 포만감 및 식욕의 신경 역학과 같은 사료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 그룹의 파리의 음식 섭취량을 동시에 정량화하여 유전자 검사에서 비정상적으로 먹이를 먹는 파리를 식별하는 데 특히 유용하다는 것입니다.

시작하려면 외부 용기를 준비하기 위해 보급품을 모으십시오. 아가로스 0.5g과 이중 증류수 50ml를 현탁합니다. 잦은 교반으로 가열하고 가열판이 있는 자석 교반기에 완전히 녹도록 끓입니다.

1%의 아가로스가 약 섭씨 60도까지 냉각되면 5ml를 빈 외부 용기에 옮기고 아가로스가 실온으로 냉각되어 아가로스 패드가 생성될 때까지 용기를 열어 둡니다. 다음으로, 이중 증류수 0.5ml에 아가로스 50g을 추가합니다. 잦은 교반으로 가열하고 끓여서 가열판이 있는 자석 교반기에 완전히 녹입니다.

1% 아가로스가 약 섭씨 60도로 냉각되면 아가로스에 1.71g의 자당을 첨가하여 100밀리몰의 자당을 얻습니다. 아가로스 용액에 0.25g의 파란색 염료를 첨가하여 염색된 라벨이 붙은 식품의 부피당 0.5%중량을 얻습니다. 그런 다음 내부 용기를 준비합니다.

빈 내부 용기를 평평한 수평면에 놓습니다. 그런 다음 750마이크로리터의 파란색 염료 라벨이 붙은 식품을 개별 식품 용기에 추가합니다. 최소 5분 동안 굳게 두십시오.

채워진 내부 용기를 준비된 외부 용기에 옮기고 아가로스 패드 중앙에 놓습니다. 배경 빼기를 위해 염료가 없는 음식이 있는 수유실을 준비합니다. 외부 용기의 벽에 결로가 없어질 때까지 수유 챔버를 실온에서 40분 동안 열어 두십시오.

행동 실험 전에 준비된 급식 챔버를 섭씨 30도의 실험 온도에서 2시간 동안 평형을 유지하여 급식 챔버의 온도가 비교적 균일한지 확인합니다. 먹이를 주려면 집에 있는 바이알에서 파리 20마리를 부드럽게 두드려 예열된 먹이 챔버로 조심스럽게 옮깁니다. 섭씨 30도에서 60분 동안 수유 과정을 계속합니다.

급식실을 섭씨 영하 80도에서 30분 동안 얼려 수유를 중단합니다. 한 바이알에 있는 파리 20마리를 부드럽게 두드려 먹이 챔버로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 챔버를 조명 설정에서 옆으로 놓습니다.

광유전학적 조작을 위해 주황색 LED 어레이를 광 자극원으로 사용하고 LED 위에 수평 플렉시 유리판을 고정하여 조명 중 공급 챔버를 지지합니다. 인큐베이터에서 섭씨 25도, 습도 60%로 설정하십시오. 유전 제어 파리를 Taotie-GAL4 UAS CsChrimson 파리와 병렬로 자극하지만 다른 먹이 챔버에서 파리를 만듭니다.

주황색 조명으로 다시 조명을 비추면서 60분 동안 수유 과정을 계속합니다. 그런 다음 급실을섭씨 영하 80도에서 30 분 동안 동결합니다. 먹이를 준 후 먹이실에서 20마리의 파리를 모두 계량지 한 장에 붓습니다.

그런 다음 부드러운 브러시를 사용하여 1.5ml 튜브에 옮깁니다. 튜브에 500마이크로리터의 PBST를 추가하고 60헤르츠의 분쇄기를 사용하여 5초 동안 파리를 균질화합니다. 그런 다음 검출 가능한 신체 부위 조각이 없을 때 관찰을 통해 충분한 균질화를 확인합니다.

1300RPM에서 30분 동안 균질액으로 튜브를 돌려 이물질을 제거합니다. 원심분리 후 100마이크로리터의 상등액을 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 파편으로 인한 흡수제의 계산 착오를 방지하려면 원심분리기에서 사용된 튜브를 부드럽게 꺼내 팔레트를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 떨어뜨립니다.

모든 샘플이 로드된 후 플레이트를 플레이트 리더에 놓고 630나노미터에서 샘플의 흡수제를 측정합니다. 섭식 반응은 장에서 검출 가능한 염료로 파리를 육안으로 검사하고 점수를 매겨 정량화했습니다. Taotie 뉴런이 활성화된 후 Taotie dTRPA1 파리의 약 58%가 강력한 섭식 행동을 보였습니다.

그리고 이 중 23%는 가벼운 섭식 행동을 보였습니다. TRPA1에 의한 급성 활성화 Taotie-GAL4 뉴런은 음식 섭취를 극적으로 증가시켰으며, 이는 Taotie-GAL4 표지 뉴런이 성인 초파리의 음식 섭취 조절에 참여한다는 것을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 성인 Drosophila melanogaster에서 섭식 조절의 신경 메커니즘을 조사하기 위해 뉴런의 활동을 조작한 후 음식 섭취량을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.