Name: 새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 학습하세요 Bacillus subtilis의 단일 세포 계보를 마이크로유체 장치를 이용해 장기간 관찰하는 방법을. 통제된 환경에서 세포의 스트레스 반응과 표현형 변이를 연구할 수 있습니다.

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이 프로젝트는 GM018568에서 건강의 국가 학회에 의해 투자 되었다. 이 프로토콜 수행 되었다 일부 센터에서 대 한 나노 시스템 (CNS), 구성원의는 국가 나노기술 조정 인프라 네트워크 (NNCI), NSF 보너스 번호 1541959에서 국립 과학 재단에 의해 지원 되는. CNS는 하버드 대학교의 일부입니다. 많은 감사 토마스 노먼과 네이 선 주 님 마음속 고 여기 고 기구의 원래 버전을 건물에 표시 된 장치를 위해 사용 하는 마스터 템플릿을 조작에 그들의 작품에 대 한 있습니다. 우리는 또한 그의 귀중 한 공동 조언을 요한 Paulsson 감사 하 고 그들의 조언과 세균 미세 기구를 지속적인된 개선에 대 한 그의 실험실의 구성원 감사.

1. PDMS 장치 캐스팅
<ol><li>먼지 없는 환경에서 PDMS 폴리머와 경화제 10:1 비율로 혼합 하 고 적어도 10 분 동안 진공에서 드.</li>
	<li>실리콘 마스터 (또는 그 아니라는 에폭시 또는 폴리우레탄 복제) 연속적인된 알루미늄 호 일의 조각에 폴리스 티 렌 페 트리 접시에 놓습니다. 붓는 다 degassed PDMS 혼합물 깊이 약 5 m m. 드가 페 트리 접시 적어도 10 분 사용에 대 한 마스터 공기 표면 거품을 휴식의 부드러운 스트림. 참고: 사용 하는 2 계층 장치 크기에 제공 되는 동반 CAD 파일5 ( 보충 파일 1참조). 플라스틱 복제 마스터 수 있습니다 degassing; 하는 동안 부분적으로 플 로트 이 경우, 깨끗 한 플라스틱 주걱으로 복제 아래로 밀어.</li>
	<li>60 ° C에서 오븐에 1 시간 이상에 대 한 PDMS를 치료 하 고 실내 온도에 냉각 하십시오. 페 트리 접시에서 마스터 및 치료 PDMS를 포함 하는 알루미늄 호 일을 제거 합니다. 조심 스럽게 껍질 마스터, 뒤쪽에서 알루미늄 호 일을 한 다음 마스터에서 PDMS를 신중 하 게 껍질. 참고: 또는, PDMS 있습니다 완 치 될 하룻밤 실 온에서. 영구적으로 1/16 인치 웨이퍼 본드 에폭시 접착제를 사용 하 여 실리콘 웨이퍼 마스터의 상대적 취약성을 극복할 수 있습니다-같은 웨이퍼 크기의 두꺼운 알루미늄 디스크.</li>
	<li>웨이퍼는 일반적으로 약간 다른 크기 ( 보충 파일 1참조) 여러 미세 장치 포함, 단일 장치는 깨끗 하 고 날카로운 메스를 사용 하 여 크기를 잘라. 참고: B. subtilis 작업 루틴에 대 한 C 또는 F 동반 CAD 파일에 표시 된 1.0 µ m 전체 셀 참호와 장치를 사용 합니다.</li>
</ol>2입니다. 펀치 및 결합 장치
<ol><li>장소 반투명의 조각 패턴된 특징의 가시성을 향상 시키기 위해 소자의 패턴된 쪽 이상 ( 재료의 표참조) 테이프. 입구 및 출구 포트 (그림 1) 보이는 유체 채널의 반대 끝에 원형 지역으로 식별 됩니다. 펀치 구멍 입구 및 출구 핀 장치에 때 그들의 가시성을 개선, 뾰족한 마커를 사용 하 여 점 후미와 출구 표시 합니다. 참고: 입구와 콘센트 핀은 혼잡 하지 있도록 모든 다른 채널은 구멍 뚫은 것, 바로 아래에 장치에 대 한 알파벳 지정자 채널 시작.</li>
	<li>패턴된 측면, PDMS 장치를 대칭 이동 하 고 장치는 0.75 m m 생 검 펀치;를 사용 하 여 표시 된 점 들을 통해 펀치 punchings을 삭제 합니다. 참고: 장치는 구멍 뚫은 것 아래로 꽃무늬 면 생 검 펀치에 의해 생성 된 구멍은 일반적으로 약간 flared 펀치는 폴리머를 입력 하기 때문에. 거꾸로 방향 장치 펀칭 패턴된 측면에 구멍 날카로운 테두리는 보장 합니다.</li>
	<li>stereomicroscope를 사용 하 여 천공된 구멍 장치 입구 및 출구 분야와 중복을 확인 합니다. 뾰족한 족집게를 사용 하 여 천공된 구멍에서 PDMS의 어떤 외부 조각을 제거.</li>
	<li>접착 테이프를 사용 하 여 깨끗 한 폴리스 티 렌 페 트리 접시로 장치 및 장소의 양쪽에서 먼지를 제거 하. 100%가 소 프로필 알코올로 습윤 및 클린 룸 지우기;으로 문 지르고 22 m m x 40 m m 커버 유리를 준비 먼지가 없는 공기 또는 질소의 흐름과 함께 건조.</li>
	<li>장소 천공된 PDMS 장치 기능 측면을 함께 청소 커버 유리는 산소 플라즈마에 청소기.<ol>
<li>플라즈마 치료 다음 설정으로 장치: 진공, 70 mTorr; O2 압력, 200 mTorr; 기간, 15 s; 전원, W. 30 플라즈마 치료 기간 완료 후 즉시 제거 장치 및 커버 유리는 플라즈마에서 청소기.</li>
		<li>PDMS 반전 고 덮개 유리의 중심에 있도록 패턴된 측면 연락처 유리; (입구와 출구 사이 실행) 먹이 채널 덮개 유리의 긴 축에 정렬 됩니다 있는지 확인 합니다. 유리에 대 한 PDMS 물개 되도록 매우 부드럽게 아래로 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>60 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 조립된 장치 오븐에 구워 베이킹 후, 수동으로 PDMS 장치에의 한 모서리에 부드럽게 밀어 유리에 접착은 확인 합니다. 참고: 장치가 결합 되 면 그것은 해야 사용할 수 24 시간 이내 폴리머 후 플라즈마 처리 시간을 증가 함께 점점 더 소수 될 것 이다.</li>
</ol>3. 미세 배관 준비
<ol><li>폴리머 주사기 펌프 스위칭 장치 도달 하는 (사용) 하는 경우 적절 한 길이를 현미경에 장착 장치 (내경 (ID) 0.02 인치, 외경 (OD) 0.06 인치) 튜브의 길이 잘라. 미세 레인으로 많은 길이 잘라.</li>
	<li>핀치 밸브에 대 한 Y 접속점 (사용) 하는 경우 절단 및 2 cm 길이의 유연한 실리콘 (0.03 인치 ID, 0.065 인치 OD) "Y"의 최고 barbs을 1 cm 길이 "Y"의 하단 바 브에 실리콘 튜브의 튜브를 연결 하 여 조립</li>
	<li>잘라 10 cm (또는 적절 한) 길이의 중합체 튜브; 하단 바 브는 "Y"의 1 cm 실리콘 튜브 세그먼트에 삽입 하 여 스위치 접점을 한 끝에 그들을 연결합니다 21g 바늘 그들의 플라스틱 주사기 어댑터와 굽은 약 90 ° 바늘 끝에서 약 9 mm에서 제거 된 다른 끝에 그들을 연결 합니다.</li>
	<li>21 G 무딘 바늘 튜브에 바늘을 삽입 하 여 스위치 장비에 주사기에서 실행 되는 튜브 세그먼트의 한쪽 끝을 연결 합니다. Y 접속점에의 입구 미 늘에 실리콘 튜브 세그먼트로 각 길이의 튜브의 다른 끝을 삽입 합니다. 참고: 장소; 핀치 밸브와 접합부를 기구의 어떤 종류를 사용 이 micropipette 팁 상자 (그림 2D)에서 쉽게 만들 수 있습니다.</li>
	<li>휴대 장치의 콘센트에서 폐기물 비 커에 폐기물 중합체 튜브의 길이 잘라. 구부러진된 21 G 바늘 위에서 설명한 대로 준비를 한 끝에 그들을 연결 합니다. 폐기물 비 커에 튜브의 다른 쪽 끝을 테이프.</li>
	<li>적절 한 양의 0.1 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 포함 하는 미디어를 준비 하 고 원하는 크기와 주사기의 번호를 작성. 준비 21 G 바늘 주사기 펌프에 유입 튜브와 로드 주사기에 부착 된 BSA 로드 주사기를 연결 합니다. 참고: 대 한 전형적인 실험 장치의 5 채널 사용 됩니다 각각 20 mL 주사기. 매체 전환 실험 5 주사기의 2 뱅크를 요구할 것 이다. 여기, 펌프 포함 하는 첫 번째 은행을 1 단계 펌프 라고 하 고 사후 스위치 매체와 두 번째 은행을 포함 하는 펌프를 2 단계 펌프 라고.</li>
	<li>높은 흐름 율에 주사기 펌프를 실행 하 여 입구 배관에서 공기를 제거 (> 500 µ L/min), 주사기 펌프 수직으로 동쪽으로 향하게 하 고 상단에 기포를가지고 주사기를 도청에 의해 시작. 일단 주사기에서 공기를 제거 주사기 펌프를 가로로 배치 및 점차적으로 누르거나 꺼내 려 하 고 공기 방울 제거 스위치 장비를 통해 주사기에서 폴리머 라인을 터치 합니다. (미디어 전환) 하는 경우에 주사기의 두 번째 은행에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>기포를 제거한 후 2 단계 주사기 펌프를 설정 (즉, 사용 될 매체와 두 번째, 스위치 후) 1.5 µ L/분, 흐름 일시 중지. 두 번째 중간 단계에 해당 하는 Y 접속점에의 분 지에 작은 바인더 클립 유연한 튜브의 세그먼트에 배치 합니다. 30 분 이상 두 번째 중간 입구 배관에서 제거에 대 한 겸손 한 흐름 속도 (예를 들어, 10 µ L/min)에서 단계 1 주사기 펌프를 실행 하려면 계속 Y 분기점의 하류.</li>
</ol>4. 세포 문화 준비
<ol><li>하룻밤, 고정 단계 원하는 매체에 대 한 관심의 긴장의 preculture 성장. 세균성 긴장을 렌더링 하는 셀 움직이지 셀 소자의 채널에서 수영 하지 않는 변이 포함 해야 합니다. 참고:이 프로토콜, 세균성 긴장은 B. subtilis 3610 포함 하는 노 파A233V 대체 (이 돌연변이 발생 헬리컬, 방지 세포 운동 성 보다 똑바로 되도록 편), PrsbV-mNeonGreen 셀 스트레스에 대 한 기자 그리고 제정 Phyperspank-mNeptune (레드) 기자 셀을 강조 표시 합니다. LB 레 녹 스 매체 예제 프로토콜에 사용 됩니다. 마이크로 실험에 대 한 일반적인 긴장 하나 이상의 형광 transcriptional 기자 및 constitutively 생산, 세포질 형광 단백질 셀의 자동된 감지를 포함 합니다. 성장 결함 하지 관찰 되었다 파운드 레 녹 스 풍부한 매체 사용 되었다, 하지만 분 비 때문에도 미세 조건 하에서 최소한의 미디어에 B. subtilis 성장 저해 수 있습니다 siderophores 중간 흐름에 의해 멀리 세척 된다. S750 중간11보고 이러한 상황에서 성장 매체, 제 2 철 염화 나트륨 시트르산의 추가 의해 복원 수 있습니다.</li>
	<li>B. subtilis 세포 실험의 아침 희석 성장 매체의 25 mL를 포함 하는 당황 하 게 250 mL 플라스 크에 1시 50분. 5-6 h 1 보다 큰 광학 밀도를 37 ° C에서 문화를 떨고에 대 한 세포 성장. 참고: 고밀도 세포 배양 바람직합니다 정지 단계 B. subtilis 세포는 작은 고 덜에서 종종 발견된 셀 때문에 체인, 장치 로드를 촉진. 다른 세균 종 최적의 로드에 대 한 다른 매체 또는 성장 조건을 요구할 수 있습니다.</li>
	<li>5 µ m 기 공 크기 필터를 장착 한 주사기를 사용 하 여 B. subtilis 셀 체인 ( 대장균 에 대 한 필요 하지 않습니다 그것과 다른 종으로 필요 하지 않을 수 있습니다)을 제거 하는 15 mL 원뿔 튜브에 세포 배양의 약 15 mL를 필터링 합니다. 참고: 상대적으로 적은 세포를 제거 한다; 여과 액은 혼 탁 한 이어야 한다.</li>
	<li>실 온에서 4000 x g에서 10 분에 대 한 필터링 된 문화 원심 상쾌한 오프와 신선한 매체의 약 500 µ L pipetting 세포 현 탁 액을 촉진 하는 데 필요한 추가 튜브에 남아 있는 잔여 표면에 뜨는 액체에서 셀 펠 릿 resuspend.</li>
</ol>5. 장치 로드
<ol><li>부드럽게 장소 빈 얇은 젤 로드 micropipette 미세 장치 콘센트 구멍에 ( 재료의 표참조) 팁.</li>
	<li>입구 구멍에 1 mg/mL BSA를 포함 하 여 미세 채널 (그림 2A)의 작성 모니터링 콘센트 구멍에 팁을 관찰 하는 매체를 주입 하 여 장치 passivate P200 micropipette와 얇은 젤 로드 팁을 사용 하 여. 약 5 분 동안 실내 온도에 장치를 품 어. 참고: BSA 에이전트로 차단 또는 패 시 베이 션 PDMS 폴리머의 소수 성 표면에 바인딩하는 것입니다 그것의 화란을 증가 하 고 감소 셀 (세포 표면 분자)를 통해 또는 다른 단백질의 바인딩을 주로 사용 됩니다.</li>
	<li>얇은 젤 로드 팁을 사용 하 여, (제 4)에서 resuspended 셀으로 각 채널 (그림 2B) 장치를 통해 셀의 진행률을 모니터링 하려면 콘센트 채널에 팁을 사용 하 여 로드 합니다. 참고: 로드 P200 micropipette 최대 200 µ L 볼륨을 설정 하 고 다음 셀의 소량 (약 절반의 양을 피 펫 팁의 얇은 단면도)를 발음 하기 전에 공기의 쿠션을 발음에 의해 촉진 된다. Resuspended 셀의 볼륨 될 필요가 없습니다, PDMS 장치 볼륨은는 micropipette의 상대적으로 작은. 우리 알고 없다 상한선의 resuspended 세포의 밀도 셀 서 스 펜 션 장치에 pipetted 수 었 어 요. 셀 덩어리 장치를 방해할 수 있습니다 하 고 철저 한 pipetting 또는 소용돌이 혼합에 의해 피해 야 한다.</li>
	<li>부드럽게 작동 장치 손상을 방지 하려면 한 번에 하나씩 콘센트 구멍에서 젤 로드 팁을 제거 합니다.</li>
	<li>10 분 (그림 2C) 약 6000 x g에서 적절 한로 터 어댑터에 벤치 탑 microcentrifuge에서 장치 원심 참고: microcentrifuge 회전자 (그림 2C)에 맞게 설계 된 사용자 정의 가공 알루미늄으로 터 어댑터 사용 되었다; 다른 분리기 모델은 적절 한로 터 어댑터와 함께 사용할 수 있습니다. 어댑터의 중요 한 기능은 측면 채널에 셀을 강요 함으로써 셀 참호의 닫힌된 끝의 방향으로 측면 힘을 제공 합니다.</li>
	<li>(그림 3) 현미경 성공적인 로드 확인 하지만 슬라이드 홀더/무대 장치를 부착 하지 않고 삽입. 참고:이 프로토콜, 60 X, 1.4 나 Ph3 기름 침수 목표가이 단계에서 모두 확인 하 고 후속 이미징에 대 한 사용 됩니다.</li>
</ol>6. 장치 조립, 평형, 및 장착
<ol><li>조심 스럽게 무대 삽입의 하단에 PDMS의 양쪽에 덮개 유리를 녹화 하 여 무대 삽입에 로드 된 장치를 탑재 (즉, 단계 삽입 장치를 부착 하기 전에 반전). 단계 삽입 장치 어셈블리를 반전 하는 PDMS 향하도록 하 고 먼지 무료 지우기 (그림 2D) 같은 부드러운 표면에 놓습니다.</li>
	<li>단계-1 주사기 펌프 35 µ L/분의 유량을 조정 입구 바늘 그리고 콘센트 바늘 삽입 한 번에 한 차선을 사용, (즉, 폐기물 비 커;를 실행 그림 2E)입니다.</li>
	<li>깨끗 한 먼지 무료 지우기와 어떤 초과 매체를 닦아 하 고 시각적으로 누수에 대 한 장치를 검사. 초과 셀 (일반적으로 혼 탁 한 줄으로 표시)과 폐기물 비 커를 향해 천천히 움직일 것 이다 중간 초승달 모양에 대 한 콘센트 튜브를 검사 합니다.</li>
	<li>모든 연결 된 차선은 폐기물 비 커에 배출 될 때까지 약 15-30 분, 35 µ L/분에 실행 되도록 장치를 허용 합니다.</li>
	<li>1.5 µ L/min로 1 단계 주사기 펌프를 설정 하 고 흐름을 일시 중지. (이 과정은 모두 압 연 장바구니에 그것을 배치 하 여도 왔) 현미경을 전체 펌프 및 장치 장치를 가져오고 위상-1 1.5 µ L/분에 중간 교류는 신중 하 게 탑재 단계 삽입 거꾸로 형광 현미경에 장치를 다시 시작 사용 하 여 입구와 출구 튜브를 라우팅하는 데 필요한 테이프.</li>
	<li>이미징 장치에 원하는 위치를 찾아서 원하는 대로 이미징 시작. 세포는 일반적으로 정상 상태 지 수 단계 성장에 도달 하는 몇 시간 (약 10 세대) 필요로 하 고 이미지 수집의 발병으로 지연 될 수 있습니다 이미징 평형 기간 후 시작 하도록 원하는. 참고: 지 수 단계에서 개최 하는 세포의 정상 성장 확인 되어야 한다 후속 이미지 분석 중 세포 분열 시간을 추적 하 고 그들은 일정 한 최소 값에 도달 했습니다 확인 하 여.</li>
</ol>7. 매체 전환
<ol><li>영상의 연속 라운드, 사이 단계 1 주사기 펌프의 흐름을 일시 중지 합니다. 2 단계 실리콘 튜브, 실리콘 튜브에 각각 Y 교차점의 위상-1 분기에 이동에서 바인더 클립 unclip 신중 하 게. 유엔-일시 중지 단계 2의 흐름 주사 통 펌프 (이 단계 3.8에서에서 1.5 µ L/min으로 설정 된) 하 고 이미지를 계속 합니다. 참고: 폴리머 하류 배관의 10 cm 길이와 1.5 µ m/min에서 Y 접속점에의 두 번째 단계 매체 약 50 분에 장치에 도달. 장치에 시간은 형광 추적 입자를 포함 하는 미디어를 사용 하 여 실험적으로 테스트 수 있습니다.</li>
</ol>

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<li>Baker, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable%2C+Pneumatically+Actuated+Microfluidic+Device+with+an+Integrated+Nanochannel+Array+To+Track+Development+of+Individual+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria.</a> Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).</li>
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<li>Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+microfluidic+platform+to+uncover+basic+features+of+energy+and+environmental+stress+responses+in+individual+cells+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 13 (7), e1006901(2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 마이크로 프로토콜이입니다 유연한 많은 단계 특정 종 또는 스트레인 또는 특정 목적에 대 한 그것의 사용을 최적화 하기 위해 변경 될 수 있습니다. 실제로,이 프로토콜에 우리는 원래 "어머니 기계" 개념4 B. subtilis와 함께 그것의 사용을 최적화 하기 위해 수정을 만들었습니다. 종종, 셀 수감 된다 참호 반면이 프로토콜 사용 하 여 2 층 셀 참호, 셀을 둘러싼 얕은 채널 단일 레이어 기능을 구성 합니다. 2 층 디자인 긴 특히 영양분 및 B. subtilis 세포에서 대사 산물의 흐름을 극대화 하는 방법으로 소개 되었다 (> 75 µ m) 참호5; 그러나, 단일 레이어 기능 자주 최적의 세포 성장에 대 한 충분 하 고 특히 때 그들은 짧은 (25 µ m)4 대장균, 일반적으로 사용 됩니다. 우리는 B. subtilis 셀 체인...

지구상의 생명의 가장 눈에 띄는 기능 중 하나는 그것의 큰 탄력성과 다양 한입니다. 분자 생물학의 중앙 목표는 세포를 사용 하 여 유전자와 단백질 그들의 성장 및 다양 한 환경 조건에서 피트 니스를 최대화 하는 논리를 이해 하는 것입니다. 이 위해 과학자 들은 자신 있게 관찰 할 수 있어야 합니다 어떻게 개별 셀 성장 하 고 분할 하 고, 표현 하는 조건의 주어진된 세트에서 그들의 유전자, 세포 그들의 환경에서 이후의 변화에 대처 하는 방법을 지적. 그러나, 미생물학에 전통적인 분석 방법을 해결 될 수 있는 질문의 형식에 영향을 주는 기술적인 한계를가지고. 예를 들어 대량 문화 기반 분석, 년간 매우 유용 되었습니다 아직 의미 있는 셀을 변형 또는 전체 인구에 셀의 작은 부분 모집단의 동작 마스크 수만 인구 수준 데이터를 제공 하는 그들은. 가벼운 현미경 검사 법에 따라 생활 박테리아의 단일 세포 분석 단일 셀 동작을 공개 하지만 기술적으로 제한 되어 있습니다. 박테리아 성장 매체를 포함 하는 agarose 패드에 일반적으로 움직일 수 있지만 셀과 성장 군중 미세한 보기와 실질적으로 제한 하는 관측 시간1, 단지 몇 셀 사이클 후 사용할 수 있는 영양분을 고갈 2. 또한, 영양소의 로컬 고갈 및 셀 증가로 대사 부산물의 수 반하는 상승 끊임없이 측정 또는 예측 하기 어려운 방식으로 지방 세포 성장 환경 변화는. Agarose 패드를 사용 하 여 이러한 환경 변화 연구 또는 특정 변화 성장 조건3에 세포질 응답의 정상 동작에 도전 포즈.
미세 기술, 있는 액체 매체는 ﹙ 장치를 통해 지속적으로 흘러 고전적인 실험 한계에 솔루션을 제공 합니다. 성장 매체의 흐름 끊임없이 신선한 영양소와 세포를 제공 하 고 신진 대사 부산물 및 초과 셀, 매우 균일 한 성장 만드는 씻어 미세 장치 라이브 셀 현미경 검사 법에 대 한 위치에서 개별 셀을 유지할 수 있습니다. 환경입니다. 지속적인 성장 조건에서 셀의 내부 논리에의 한 시 빨리 벗어나게 보기를 허용 하는 환경 요인의 영향에서 고립에서 셀 동작을 관찰할 수 있습니다. 유체 흐름에서 세포 군집 되 고 미세 장치를 방지, 수십 또는 수백 세대에 대 한 단일 세포 계보의 관찰 가능한4,5된다. 이러한 긴 관측 시간 달리 탐지 장기 또는 드문 셀 동작 감지를 허용합니다. 세포는 스트레스의 발병 또는 소개 또는 특정 화합물의 제거 반응으로 관찰 될 수 있도록 마지막으로, 장치를 통해 흐름에 변경 될 수 있는 매체의 구성이 됩니다.
마이크로 이미 중요 한 응용 프로그램의 수를 즐겼다. 예를 들어, 그것은 조직, 기관 또는 몸 온 칩 장치는 여러 인간 세포 유형은는 vivo에서 조건6; 시뮬레이션 공동 경작에 사용 되었습니다. microstructured 환경7; 선 충 운동의 연구에 대 한 (예를 들어, 8); 박테리아 biofilms 간의 상호 작용을 검사 하 캡슐화 및 셀 또는 화학 물질 (예, 9)의 작은 볼륨의 조작에 대 한 고. 미세 장치는 또한 그들의 물리적으로 특히 (대 한 훌륭한 리뷰 참조 10 , 11), 미생물학의 분야에서 점점 인기 되 고 흐름 속성은 자연 미생물 틈새12울린. 예를 들어, 마이크로 최근에 의해 고용 되었다 미생물학 같은 목적을 위해 정확 하 게 측정 하는 셀과 성장13,14,15, 병원 체의 운동16, 분석으로 쿼럼 감지17 및 생리 적 전환18, 모니터링 및 단백질에 대 한 세19, 다른 많은 보기 사이에서. 여기에 제시 된 방법은 긴장 또는 종의 조합 보다는 오히려 단일 세균성 세포 계보의 분석을 위해 특별히 설계 되었습니다. 여기 설명 미세 장치 활용 한 변형 "어머니 기계" 디자인4, 셀 단일 파일을 재배는 닫힌된 한쪽과 한쪽 오픈; 미세 트렌치 내 세포 성장 및 사단 푸시합니다 자손 세포 오픈 엔드에서 유체 흐름으로. 우리의 분석은 일반적으로 골짜기의 닫힌된 끝에 국한 "어머니" 세포에만 초점. 우리는 이전 가벼운 현미경 검사 법 기반 단일 셀 분석 기법, 셀 immobilization agarose 패드에 등 위에 전진으로이 메서드를 고려합니다. B. subtilis 여기 모델 사용 된다, 방법은 또한 다른 세균 종에 적용 (대장균 다른 일반적인 모델 이며 다른 셀 크기 또는 형태학 일부 종 신제품의 제조를 요구할 수 있습니다 다른 치수)와. 셀을 표시 하 고 시각화 유전자 발현에 변화를 형광 기자 사용 하려면 유전자 온순한 종;의 사용 그러나, 세포 성장 및 형태학의 분석은 형광 마커 없이 가능.
현재 프로토콜 사용 하 여 사진 평판, 다른 곳에서 광범위 하 게 설명 되었습니다5; 실리콘 마스터를 조작 하는 과정 제외 마스터 제작 시설에서 쉽게 아웃소싱 수 있습니다. PDMS 장치 강화 실리콘 마스터;에서 성형을 포함 하 고 있습니다. 커버 유리;의 장치 결합 중간 스위칭; 허용을 포함 한 핀치 밸브 미세 입구 및 출구 배관 조립, 장치 passivating 세균성 세포를 준비 하 고 세균성 세포; 장치 로드 장치에 배관 및 평형 셀; 그리고 영상에 대 한 형광 현미경에 장치를 로드. 때문에 많은 다른 이미지 수집 및 처리 소프트웨어 시각화 하 고 관심4,5의 다른 데이터 분석 도구를 사용할 수 있습니다, 예를 들어 이미지 표시 됩니다, 하지만 이미지 캡처 방법이이 프로토콜에 포함 되지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>프로토콜에서는 이를 PDMS라고 합니다. 10:1 비율로 혼합되는 2가지 구성 요소가 있습니다:</td></tr><tr><td>0.75mm 생검 펀치</td>: <td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40mm No. 1.5 커버 유리</td><td>, VWR</td><td>48393, 172</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 에칭, PE-50</td>, <td>플라즈마 에칭, Inc.</td><td>산소 플라즈마 처리를 사용하여 PDMS를 유리에 접착하는 데 사용되는</td> <td>PE-50</td> 기기</tr><tr><td>Tygon 플렉시블 튜빙 ID 0.02", OD 0.06"</td><td>Saint-Gobain PPL Corp.</td><td>AAD04103</td><td>튜브의 주요 부분(예: 바늘에 부착</td></tr>) <tr><td>실리콘 튜브, 0.04" ID, 0.085" OD</td><td>HelixMark 표준 실리콘 튜브</td><td>60-795-05</td><td>핀치 밸브 및 Y-접합 연결용</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>패시베이션제로 사용</td></tr><tr><td>ART 젤 피펫 팁(P200)</td><td>분자 바이오 제품</td><td>2155</td><td>매체 및 셀로 장치를 로드하기 위해</td></tr><tr><td>Acrodisc 32-mm 주사기 필터(5-&mu); m Supor membrane</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4560</td> 21ga 무딘 바늘<td>을 로드하기 전에 배양을 필터링하기 위해</td></tr><tr><td>1"</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A681</td><td></td></tr><tr><td>Y 커넥터(200 시리즈 미늘 포함), 1/16" ID 튜브, 폴리프로필렌</td><td>Nordson Medical</td><td>Y210-6005</td><td>이 회사는 AKA Value Plastics</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E 도립 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td>입니다.이 장치는 제조업체에서 단종되었으며 Ti 2 E로 대체되었습니다.</td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>마이크로퓨지 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis 균주 NCIB3610</td><td>Bacillus Genetic Stock Center</td><td>3A1</td><td>이 프로토콜에 표시된 실험에 사용하기 위해 변형된 야생형 부모 균주</td></tr><tr>PDMS 경화 및 베이킹을 위한<td>중력 대류 오븐</td><td>VWR</td><td>414005-106</td> 조립 <td> 장치</td></tr><tr><td>스카치 용접 에폭시 키트</td><td>3M</td><td>2216 B / A</td><td>는 실리콘 웨이퍼를 알루미늄 백킹 플레이트</td></tr><tr><td>스카치 매직 테이프, 3/4 "너비</td><td>3M</td><td></td>에 접착하여 <td>PDMS 장치에서 먼지를 청소하고 가시성을 높이기 위해 기능 위에 배치하는 데 사용할 수 있습니다 (프로토콜에서 "사무실 테이프"또는 "접착 테이프"로 표시됨)</td></tr> <tr><td>실체 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>여기에 예시로 나열되어 있습니다. 거의 모든 실체 현미경은</td></tr><tr><td>이소 프로필 알코올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td>커버 유리</td></tr><tr><td>주사 펌프를 청소하려면 6 채널</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td>를 수행합니다.<td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>먼지가 없는 물티슈 브랜드</td></tr></tbody></table>

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

미세 기술 많은 미생물학에 전통적인 분석 방법에 한계의 극복. 와 달리 대량 문화 방법, 그것은 제공 합니다 단일 셀 해상도 세대;의 수백에 걸쳐 시간 긴 관찰 agarose 패드 기반 현미경과 달리 균일 한 성장 조건에 엄격 하 게 제어 될 수 있다. 성장 매체의 지속적인 흐름 세포 성장 그리고 물질 대사, 본격적인 변화 유전자 발현 및 세포 성장에 대 한 응답에서으로 인 한 현지 화학 환경에서 예측할 수 없는 변화에서 미세 소자에서 셀 분리 하기 때문에 특정 자극을 더 자신 있게 관찰할 수 있습니다. 새 균의 subtilis 사용 "어머니 기계"를 설명 하기 위해 모델 세균성 종으로 여기-세포 분석 방법을 입력. 우리가 생성 및 미세 장치를 수직, 셀 로드, 현미경 이미징, 시작 및 다른 한 성장 매체에서 전환 하 여 세포 자극에 노출 하는 방법을 보여 줍니다. 스트레스 반응 기자가이 방법으로 얻을 수 있는 데이터의 종류를 나타내기 위해 예제로 사용 됩니다. 우리 또한 짧게 실험, 세균 포자 형성의 분석 등의 다른 종류에 대 한이 메서드의 응용 프로그램 추가 설명.

성공적인 초기 셀 로드, 미세 배관 장치에 연결 하기 전에 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 평가 모두 또는 거의 모든 미세 사이드 채널을 포함 하는 하나 이상의 세균 세포 ( 로 간주 될 것 이다 그림 3A). 최적의 로드 각 채널에서 여러 셀을 보여줄 것 이라고 하지만 채널 (그림 3B) 평형 기간 세포 성장으로 인해 셀과 그럼에도 불구 하 고 채울 것입니다. 가난한 로드, 있는 비교적 차선 몇 (&lt; 50%) 측면 채널 셀와 함께 로드 됩니다 사용할 수 있습니다, 하지만 결과 데이터 밀도 각 영상 위치에 촬영 되 고 적은 세포 계보 인 낮은 것.
장치는 처음 로드 되 면, 미세 배관 연결 및 35 µ L/min의 상대적으로 높은 흐름 율에 장치를 통...

우리는 예를 들어 새 균의 subtilis 를 사용 하 여 개별 세균성 세포 계보의 미세 분석 하는 방법을 제시. 메서드를 긴밀 하 게 제어 하 고 균일 한 성장 조건 셀 세대의 수백의 관찰 함으로써 미생물학에 전통적인 분석 방법의 단점을 극복 했다.

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

이 미세유체 실험 설정의 전반적인 목표는 일정하고 고도로 통제된 환경 조건에서 개별 박테리아 세포를 장기간 관찰할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 스트레스에 대한 개별 세포의 장기적인 반응 패턴이 무엇인지 또는 집단 전체의 이질적인 표현형이 시간에 따라 어떻게 변하는지와 같은 박테리아 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일정하고 균일하며 고도로 통제된 환경 조건에서 수십 또는 수백 세대 동안 개별 세포 계통을 관찰할 수 있다는 것입니다.텍스트 프로토콜에 따라 PDMS 폴리머를 준비한 후 폴리스티렌 페트리 접시의 깨지지 않은 알루미늄 호일 조각에 실리콘 마스터를 놓습니다. 탈기된 PDMS 혼합물을 마스터에 약 5mm 깊이로 붓습니다. 그런 다음 최소 10분 동안 접시의 가스를 제거하십시오.PDMS를 섭씨 60도의 오븐에서 최소 1시간 동안 경화시키고 실온으로 냉각합니다. 그런 다음 플레이트에서 마스터와 경화된 PDMS가 포함된 알루미늄 호일을 제거합니다. 조심스럽게 점수를 매기고 마스터 뒷면에서 알루미늄 호일을 떼어냅니다.그런 다음 마스터에서 PDMS를 조심스럽게 벗겨냅니다. 웨이퍼로서, 전형적으로 약간 다른 차원을 갖는 여러 미세유체 소자를 포함한다. 깨끗하고 날카로운 메스를 사용하여 단일 장치를 적절한 크기로 자릅니다.패턴이 있는 면에 반투명 사무용 테이프를 붙여서 패턴이 있는 특징의 가시성을 높입니다. 입구 및 출구 포트는 보이는 유체 채널의 반대쪽 끝에 있는 원형 영역으로 식별됩니다. 패턴 면이 아래로 향하도록 PDMS 장치를 뒤집고 0.75mm 생검 펀치를 사용하여 장치를 표시된 점까지 펀칭합니다.그런 다음 펀칭을 버리십시오. 장치에서 펀칭을 제거하려면 핀셋이 필요할 수 있습니다. 세척 및 건조된 덮개 유리와 PDMS 장치를 산소 플라즈마 클리너에 삽입하고 여기에 표시된 설정으로 장치를 플라즈마 처리합니다.플라즈마 처리가 끝난 직후, 장치를 제거하고 플라즈마 클리너에서 유리를 덮으십시오. PDMS를 반전시켜 패턴 면이 유리와 접촉할 수 있도록 커버 유리 중앙에 놓습니다. 공급 채널이 커버 유리의 긴 접근과 정렬되어 있는지 확인하십시오.PDMS가 유리에 밀착되도록 매우 부드럽게 누릅니다. 조립된 장치를 섭씨 60도의 오븐에서 최소 1시간 동안 굽습니다. 베이킹 후 장치의 한쪽 모서리를 부드럽게 눌러 PDMS가 유리에 접착되었는지 수동으로 확인합니다.텍스트 프로토콜에 따라 폴리머 튜브를 절단한 후, 핀치 밸브를 사용하는 경우 2cm 길이의 유연한 실리콘 튜브를 절단하여 Y의 상단 미늘에 부착하고 1cm 길이의 실리콘 튜브를 Y의 하단 미늘에 부착하여 핀치 밸브용 Y-접합을 조립합니다.다음으로, 10cm 길이의 폴리머 튜브를 절단한 다음 1cm 길이의 실리콘 튜브 세그먼트에 삽입하여 한쪽 끝을 스위치 접합부에 연결합니다. Y.의 하단 미늘.플라스틱 주사기 어댑터에서 제거하고 바늘 끝에서 약 90mm 구부러진 21게이지 바늘에 다른 쪽 끝에 있는 튜브의 길이를 연결합니다. 바늘을 튜브에 삽입하여 주사기에서 스위치 장치까지 이어질 튜브 세그먼트의 한쪽 끝에 21게이지 뭉툭한 바늘을 연결합니다. 각 튜브 길이의 다른 쪽 끝을 Y-접합의 입구 미늘에 있는 실리콘 튜브 세그먼트에 삽입합니다.BSA가 보충된 박테리아 성장 배지로 주사기를 채운 후 텍스트 프로토콜에 따라 장전된 주사기를 준비된 21게이지 바늘에 연결하고 주입 튜브에 부착한 다음 주사기를 주사기 펌프에 로드합니다. 주사기 펌프를 높은 유속으로 가동하고 주사기 펌프를 수직으로 배치하고 주사기를 두드려 기포를 상단으로 가져와 흡입구 배관에서 공기를 제거합니다. 주사기에서 공기가 제거되면 주사기 펌프를 수평으로 배치하고 주사기에서 폴리머 라인을 점진적으로 탭하거나 튕겨 스위치 장치를 통해 위로 올라가 기포를 제거하고 제거합니다.매체를 전환하는 경우 두 번째 주사기 뱅크에 대해 이 과정을 반복합니다. 기포가 제거된 후 2단계 주사기 펌프를 분당 1.5마이크로리터로 설정한 다음 흐름을 일시 중지합니다. 두 번째 매체 위상에 해당하는 Y-접합 분기의 유연한 튜브 세그먼트에 작은 바인더 클립을 놓고 1단계 펌프를 계속 실행하여 Y-접합의 두 번째 매체 다운스트림을 퍼지합니다.PDMS 장치를 로드하려면 먼저 비어 있는 얇은 젤 로딩 마이크로피펫 팁을 미세유체 장치의 배출구 구멍에 부드럽게 넣습니다. P200 마이크로피펫과 함께 얇은 겔 로딩 팁을 사용하여 BSA 밀리리터당 1밀리그램이 포함된 매체를 주입 구멍에 주입하여 장치를 부동태화하고 팁과 출구 구멍을 관찰하여 미세유체 채널의 충전을 모니터링합니다. 장치를 실온에서 약 5분 동안 배양합니다.다음으로, 유사한 팁을 사용하여 출구 채널의 팁을 사용하여 다시 부유된 셀과 함께 각 채널을 로드하여 장치를 통한 셀의 진행 상황을 모니터링합니다. 배출구 구멍에서 젤 로딩 팁을 부드럽게 제거하고 장치 손상을 방지하기 위해 한 번에 하나씩 작업합니다. 적절한 로터 어댑터의 벤치탑 마이크로 원심분리기에서 장치를 약 6, 000회 g으로 10분 동안 원심분리합니다.현미경 아래에 성공적으로 로드되었는지 확인하되 장치를 슬라이드 홀더에 부착하지 마십시오.tage 삽입. PDMS의 양쪽에 있는 커버 유리를 스테이지 인서트 바닥에 테이프로 붙여서 로드된 장치를 스테이지 인서트에 조심스럽게 장착합니다. 스테이지 삽입 장치 어셈블리를 뒤집어 PDMS가 위를 향하도록 하고 먼지가 없는 물티슈와 같은 부드러운 표면에 놓습니다.1단계 주사기 펌프의 유량을 분당 35마이크로리터로 조정합니다. 그런 다음 한 번에 하나의 레인으로 작업하여 입구 바늘을 삽입한 다음 폐기물 비커로 연결되는 출구 바늘을 삽입합니다. 장치에 누출이 있는지 육안으로 검사한 후 배출 튜브에서 중간 반월판에 탁한 줄무늬로 나타나는 과도한 세포가 나타나는지 검사하여 폐기물 비커를 향해 천천히 이동합니다.장치가 약 15분 동안 실행되면 1단계 주사기 펌프를 분당 1.5마이크로리터로 설정하고 흐름을 일시 중지합니다. 전체 펌프와 장치 장치를 도립 형광 현미경으로 가져오고 분당 1.5마이크로리터의 속도로 1단계 매체 흐름을 다시 시작합니다. 장치가 있는 스테이지 인서트를 현미경에 조심스럽게 장착하고 필요에 따라 테이프를 사용하여 입구 및 출구 튜브를 배선합니다.이미징을 위해 장치에서 적절한 위치를 찾고 원하는 대로 이미징을 시작합니다. 세포는 일반적으로 정상 상태, 지수 위상 성장을 판독하는 데 몇 시간이 필요하며, 이미지 획득의 시작은 평형 기간 후에 이미징이 시작되도록 원하는 대로 지연될 수 있습니다. 연속적인 이미징 라운드 간에 매체를 전환하려면 1단계 주사기 펌프의 흐름을 일시 중지하고, 2단계 실리콘 튜브에서 바인더 클립을 조심스럽게 분리하고, 각 클립을 Y-접합의 1단계 분기에 있는 실리콘 튜브로 이동한 다음, 2단계 주사기 펌프의 흐름을 일시 중지하지 않고 이미징을 계속합니다.위상차 현미경 검사법으로 평가한 바와 같이, 미세유체 배관을 장치에 부착하기 전에 모든 또는 거의 모든 미세유체 측면 채널에 하나 이상의 박테리아 세포가 포함된 경우 초기 세포 로딩이 성공적인 것으로 간주됩니다. 장치가 초기에 로드되면 상대적으로 높은 유속으로 평형을 이룹니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 평형 장치를 현미경으로 검사하면 대부분의 사이드 채널에서 단일 파일에 갇혀 있는 몇 개의 셀이 드러나야 합니다.평형 장치를 섭씨 37도에서 분당 1.5마이크로리터의 속도로 흐르는 현미경에 놓으면 세포는 약 2시간 동안 균일하고 일정한 기하급수적 위상 성장을 재개합니다. 기하급수적 성장이 재개된 세포는 최소 24시간 동안 명시야 또는 형광 현미경을 사용하여 안정적으로 이미지화할 수 있습니다. 매체 스위치를 도입하면 수행할 수 있는 실험의 범위가 확장될 뿐만 아니라 흡입구에서 기포 또는 세포 클러스터가 제거되어 공급 채널을 통과하여 치명적인 세포 사멸 사건의 빈도가 증가합니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 사용하면 다양한 형광 리포터, 균주 및 환경 조건에서 매우 드물거나 일시적인 현상을 포함하여 다양한 생리학적 현상을 검사할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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출처: Pioli, R., et al., 순차적 모세관 보조 조립을 통한 미생물 및 미립자의 패턴화. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 무탄소 현탁액 및 제어된 흐름을 사용하여 미세유체 트랩에서 단일 형광 태그가 지정된 대장균(E. coli) 세포를 캡처한 다음 영양분을 첨가하여 미세 콜로니의 성장 및 형광 이미징을 유발하는 방법을 보여줍니다.

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출처: 케이빈, M. T. 외 Bacillus subtilis의 단세포 미세유체 분석. J. Vis. Exp. (2018)이 영상은 단일 세포 수준에서 박테리아 성장을 관찰하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 이 연구는 미세한 도랑 내에 갇힌 비운동성 박테리아 세포가 형광 현미경 아래에서 지속적으로 영양을 공급받고 영상화되는 과정을 보여줍니다. 이 장치는 여러 세대에 걸친 세포 분열 및 계통 추적의 실시간 시각화를 가능하게 합니다.

마이크로플루이딕 시스템에서 단일 세포 해상도로 박테리아 성장 추적

이 프로토콜에서는 원핵 생물의 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 생물반응기(PLBR)의 제작, 설정 및 기본 작동이 소개됩니다. 산업적으로 관련된 미생물을 원리 증명으로 분석하여 기존 방법으로는 거의 불가능했던 특정 기간 동안의 성장 속도, 형태 및 표현형 이질성에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다.

미생물 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 바이오리액터: 제작, 시스템 설정 및 작동

이 프로토콜은 단일 세포 및 세포 집단 수준에서 스트레스 조건 하에서 세균 성장의 시간 해결 설명을 허용합니다.

스트레스 치료하에 세균 성장의 다단계 분석

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

항생제 지속성은 민감한 동종 집단 내의 작은 하위 집단이 고용량의 살균 항생제를 일시적으로 견딜 수 있는 능력을 설명합니다. 현재 프로토콜은 대장균 을 치사량의 오플록사신에 노출시킨 후 분자 및 세포 수준에서 항생제 지속성 표현형을 특성화하기 위한 접근 방식을 결합합니다.

대장균의 항생제 지속성에 대한 개체군 및 단일 세포 분석

이 프로토콜은 유세포 분석 및 카운팅 비드를 사용하여 에티듐 브로마이드로 표지된 박테리아 포자를 정량화하는 데 중점을 둡니다. 이 방법은 또한 온전한 포자의 표면에서 단백질의 공유 결합을 분석하는 데 효율적입니다.

Bacillus subtilis 포자 계수 및 유세포 분석의 표지 분석 개선

학습하세요 Bacillus subtilis의 단일 세포 계보를 마이크로유체 장치를 이용해 장기간 관찰하는 방법을. 통제된 환경에서 세포의 스트레스 반응과 표현형 변이를 연구할 수 있습니다.

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

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