새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석
January 26th, 2018
우리는 예를 들어 새 균의 subtilis 를 사용 하 여 개별 세균성 세포 계보의 미세 분석 하는 방법을 제시. 메서드를 긴밀 하 게 제어 하 고 균일 한 성장 조건 셀 세대의 수백의 관찰 함으로써 미생물학에 전통적인 분석 방법의 단점을 극복 했다.
이 미세유체 실험 설정의 전반적인 목표는 일정하고 고도로 통제된 환경 조건에서 개별 박테리아 세포를 장기간 관찰할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 스트레스에 대한 개별 세포의 장기적인 반응 패턴이 무엇인지 또는 집단 전체의 이질적인 표현형이 시간에 따라 어떻게 변하는지와 같은 박테리아 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일정하고 균일하며 고도로 통제된 환경 조건에서 수십 또는 수백 세대 동안 개별 세포 계통을 관찰할 수 있다는 것입니다.
텍스트 프로토콜에 따라 PDMS 폴리머를 준비한 후 폴리스티렌 페트리 접시의 깨지지 않은 알루미늄 호일 조각에 실리콘 마스터를 놓습니다. 탈기된 PDMS 혼합물을 마스터에 약 5mm 깊이로 붓습니다. 그런 다음 최소 10분 동안 접시의 가스를 제거하십시오.
PDMS를 섭씨 60도의 오븐에서 최소 1시간 동안 경화시키고 실온으로 냉각합니다. 그런 다음 플레이트에서 마스터와 경화된 PDMS가 포함된 알루미늄 호일을 제거합니다. 조심스럽게 점수를 매기고 마스터 뒷면에서 알루미늄 호일을 떼어냅니다.
그런 다음 마스터에서 PDMS를 조심스럽게 벗겨냅니다. 웨이퍼로서, 전형적으로 약간 다른 차원을 갖는 여러 미세유체 소자를 포함한다. 깨끗하고 날카로운 메스를 사용하여 단일 장치를 적절한 크기로 자릅니다.
패턴이 있는 면에 반투명 사무용 테이프를 붙여서 패턴이 있는 특징의 가시성을 높입니다. 입구 및 출구 포트는 보이는 유체 채널의 반대쪽 끝에 있는 원형 영역으로 식별됩니다. 패턴 면이 아래로 향하도록 PDMS 장치를 뒤집고 0.75mm 생검 펀치를 사용하여 장치를 표시된 점까지 펀칭합니다.
그런 다음 펀칭을 버리십시오. 장치에서 펀칭을 제거하려면 핀셋이 필요할 수 있습니다. 세척 및 건조된 덮개 유리와 PDMS 장치를 산소 플라즈마 클리너에 삽입하고 여기에 표시된 설정으로 장치를 플라즈마 처리합니다.
플라즈마 처리가 끝난 직후, 장치를 제거하고 플라즈마 클리너에서 유리를 덮으십시오. PDMS를 반전시켜 패턴 면이 유리와 접촉할 수 있도록 커버 유리 중앙에 놓습니다. 공급 채널이 커버 유리의 긴 접근과 정렬되어 있는지 확인하십시오.
PDMS가 유리에 밀착되도록 매우 부드럽게 누릅니다. 조립된 장치를 섭씨 60도의 오븐에서 최소 1시간 동안 굽습니다. 베이킹 후 장치의 한쪽 모서리를 부드럽게 눌러 PDMS가 유리에 접착되었는지 수동으로 확인합니다.
텍스트 프로토콜에 따라 폴리머 튜브를 절단한 후, 핀치 밸브를 사용하는 경우 2cm 길이의 유연한 실리콘 튜브를 절단하여 Y의 상단 미늘에 부착하고 1cm 길이의 실리콘 튜브를 Y의 하단 미늘에 부착하여 핀치 밸브용 Y-접합을 조립합니다.다음으로, 10cm 길이의 폴리머 튜브를 절단한 다음 1cm 길이의 실리콘 튜브 세그먼트에 삽입하여 한쪽 끝을 스위치 접합부에 연결합니다. Y.의 하단 미늘.플라스틱 주사기 어댑터에서 제거하고 바늘 끝에서 약 90mm 구부러진 21게이지 바늘에 다른 쪽 끝에 있는 튜브의 길이를 연결합니다. 바늘을 튜브에 삽입하여 주사기에서 스위치 장치까지 이어질 튜브 세그먼트의 한쪽 끝에 21게이지 뭉툭한 바늘을 연결합니다. 각 튜브 길이의 다른 쪽 끝을 Y-접합의 입구 미늘에 있는 실리콘 튜브 세그먼트에 삽입합니다.
BSA가 보충된 박테리아 성장 배지로 주사기를 채운 후 텍스트 프로토콜에 따라 장전된 주사기를 준비된 21게이지 바늘에 연결하고 주입 튜브에 부착한 다음 주사기를 주사기 펌프에 로드합니다. 주사기 펌프를 높은 유속으로 가동하고 주사기 펌프를 수직으로 배치하고 주사기를 두드려 기포를 상단으로 가져와 흡입구 배관에서 공기를 제거합니다. 주사기에서 공기가 제거되면 주사기 펌프를 수평으로 배치하고 주사기에서 폴리머 라인을 점진적으로 탭하거나 튕겨 스위치 장치를 통해 위로 올라가 기포를 제거하고 제거합니다.
매체를 전환하는 경우 두 번째 주사기 뱅크에 대해 이 과정을 반복합니다. 기포가 제거된 후 2단계 주사기 펌프를 분당 1.5마이크로리터로 설정한 다음 흐름을 일시 중지합니다. 두 번째 매체 위상에 해당하는 Y-접합 분기의 유연한 튜브 세그먼트에 작은 바인더 클립을 놓고 1단계 펌프를 계속 실행하여 Y-접합의 두 번째 매체 다운스트림을 퍼지합니다.
PDMS 장치를 로드하려면 먼저 비어 있는 얇은 젤 로딩 마이크로피펫 팁을 미세유체 장치의 배출구 구멍에 부드럽게 넣습니다. P200 마이크로피펫과 함께 얇은 겔 로딩 팁을 사용하여 BSA 밀리리터당 1밀리그램이 포함된 매체를 주입 구멍에 주입하여 장치를 부동태화하고 팁과 출구 구멍을 관찰하여 미세유체 채널의 충전을 모니터링합니다. 장치를 실온에서 약 5분 동안 배양합니다.
다음으로, 유사한 팁을 사용하여 출구 채널의 팁을 사용하여 다시 부유된 셀과 함께 각 채널을 로드하여 장치를 통한 셀의 진행 상황을 모니터링합니다. 배출구 구멍에서 젤 로딩 팁을 부드럽게 제거하고 장치 손상을 방지하기 위해 한 번에 하나씩 작업합니다. 적절한 로터 어댑터의 벤치탑 마이크로 원심분리기에서 장치를 약 6, 000회 g으로 10분 동안 원심분리합니다.
현미경 아래에 성공적으로 로드되었는지 확인하되 장치를 슬라이드 홀더에 부착하지 마십시오.tage 삽입. PDMS의 양쪽에 있는 커버 유리를 스테이지 인서트 바닥에 테이프로 붙여서 로드된 장치를 스테이지 인서트에 조심스럽게 장착합니다. 스테이지 삽입 장치 어셈블리를 뒤집어 PDMS가 위를 향하도록 하고 먼지가 없는 물티슈와 같은 부드러운 표면에 놓습니다.
1단계 주사기 펌프의 유량을 분당 35마이크로리터로 조정합니다. 그런 다음 한 번에 하나의 레인으로 작업하여 입구 바늘을 삽입한 다음 폐기물 비커로 연결되는 출구 바늘을 삽입합니다. 장치에 누출이 있는지 육안으로 검사한 후 배출 튜브에서 중간 반월판에 탁한 줄무늬로 나타나는 과도한 세포가 나타나는지 검사하여 폐기물 비커를 향해 천천히 이동합니다.
장치가 약 15분 동안 실행되면 1단계 주사기 펌프를 분당 1.5마이크로리터로 설정하고 흐름을 일시 중지합니다. 전체 펌프와 장치 장치를 도립 형광 현미경으로 가져오고 분당 1.5마이크로리터의 속도로 1단계 매체 흐름을 다시 시작합니다. 장치가 있는 스테이지 인서트를 현미경에 조심스럽게 장착하고 필요에 따라 테이프를 사용하여 입구 및 출구 튜브를 배선합니다.
이미징을 위해 장치에서 적절한 위치를 찾고 원하는 대로 이미징을 시작합니다. 세포는 일반적으로 정상 상태, 지수 위상 성장을 판독하는 데 몇 시간이 필요하며, 이미지 획득의 시작은 평형 기간 후에 이미징이 시작되도록 원하는 대로 지연될 수 있습니다. 연속적인 이미징 라운드 간에 매체를 전환하려면 1단계 주사기 펌프의 흐름을 일시 중지하고, 2단계 실리콘 튜브에서 바인더 클립을 조심스럽게 분리하고, 각 클립을 Y-접합의 1단계 분기에 있는 실리콘 튜브로 이동한 다음, 2단계 주사기 펌프의 흐름을 일시 중지하지 않고 이미징을 계속합니다.
위상차 현미경 검사법으로 평가한 바와 같이, 미세유체 배관을 장치에 부착하기 전에 모든 또는 거의 모든 미세유체 측면 채널에 하나 이상의 박테리아 세포가 포함된 경우 초기 세포 로딩이 성공적인 것으로 간주됩니다. 장치가 초기에 로드되면 상대적으로 높은 유속으로 평형을 이룹니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 평형 장치를 현미경으로 검사하면 대부분의 사이드 채널에서 단일 파일에 갇혀 있는 몇 개의 셀이 드러나야 합니다.
평형 장치를 섭씨 37도에서 분당 1.5마이크로리터의 속도로 흐르는 현미경에 놓으면 세포는 약 2시간 동안 균일하고 일정한 기하급수적 위상 성장을 재개합니다. 기하급수적 성장이 재개된 세포는 최소 24시간 동안 명시야 또는 형광 현미경을 사용하여 안정적으로 이미지화할 수 있습니다. 매체 스위치를 도입하면 수행할 수 있는 실험의 범위가 확장될 뿐만 아니라 흡입구에서 기포 또는 세포 클러스터가 제거되어 공급 채널을 통과하여 치명적인 세포 사멸 사건의 빈도가 증가합니다.
이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 사용하면 다양한 형광 리포터, 균주 및 환경 조건에서 매우 드물거나 일시적인 현상을 포함하여 다양한 생리학적 현상을 검사할 수 있습니다.
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개요
이 기사는 Bacillus subtilis를 사용하여 개별 박테리아 세포 계통을 분석하는 미세 유체 방법을 소개합니다. 이 기술은 통제된 성장 조건 하에서 세포 세대의 장기간 관찰을 가능하게 하여, 전통적인 미생물학 방법의 한계를 해결합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 미생물학
- 세포 생물학
- 미세 유체 역학
배경
- 미생물학의 전통적인 방법은 종종 시간에 따른 개별 세포 행동을 관찰하는 데 실패합니다.
- 박테리아 생리학을 이해하려면 환경 스트레스에 대한 개별 세포 반응에 대한 통찰력이 필요합니다.
- 미세 유체 역학은 통제된 실험 조건을 위한 솔루션을 제공합니다.
- Bacillus subtilis는 이 연구의 모델 유기체로 사용됩니다.
연구 목적
- 개별 박테리아 세포의 장기간 관찰을 가능하게 합니다.
- 시간에 따른 스트레스에 대한 세포의 반응 패턴을 조사합니다.
- 박테리아 집단 내 표현형의 변이성을 연구합니다.
사용된 방법
- 미세 유체 장치를 위한 PDMS 폴리머 준비.
- 미세 유체 채널 생성을 위한 실리콘 마스터 사용.
- 공기 기포를 제거하기 위한 PDMS 혼합물의 탈기.
- 통제된 조건 하에서 세포 계통 관찰.
주요 결과
- 여러 세대에 걸친 개별 박테리아 세포 계통의 성공적인 관찰.
- 스트레스 하에서의 세포의 장기간 행동에 대한 통찰.
- 균일한 환경 조건을 유지하는 이 기술의 능력 시연.
- 박테리아 생리학 및 집단 역학 연구에 대한 잠재적 응용.
결론
- 미세 유체 방법은 미생물학 연구를 위한 강력한 도구를 제공합니다.
- 확장된 기간 동안 개별 세포 행동의 상세한 연구를 가능하게 합니다.
- 이 접근법은 박테리아 생리학에 대한 새로운 발견으로 이어질 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This microfluidic approach enables long-term, single-cell resolution analysis of bacterial physiology under tightly controlled conditions, addressing a key limitation in antimicrobial target validation where population-averaged data can mask heterogeneous responses. By capturing lineage-specific stress responses and phenotypic variability across hundreds of generations, the method supports mechanistic de-risking in early discovery by clarifying whether observed phenotypes are stable, heritable, or transient. This predictive confidence aids in prioritizing targets with consistent mechanism of action, reducing late-stage failure risks in antibacterial programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking single-cell gene expression dynamics to functional outcomes under defined stimuli.
- Operational Value: Provides quantitative, time-resolved data on heterogeneous phenotypes, improving confidence in target engagement and pathway modulation assessments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible single-cell readouts that can be used to benchmark compound effects on stress-response pathways.
- Operational Value: Supports assay readiness through uniform environmental control, reducing variability in dose-response measurements across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by capturing sustained bacterial responses to antimicrobial stimuli, informing translational biomarker identification.
- Operational Value: Enables continuity from mechanism of action studies to preclinical validation by providing longitudinal, lineage-tracked phenotypic data.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis screening to lead optimization, where understanding dynamic, single-cell responses to environmental perturbations informs structure-activity relationships and resistance mechanism forecasting.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by revealing whether phenotypic heterogeneity impacts target consistency across cell lineages.
- Screening: Delivers quantitative, fluorescence- or phase-contrast-based readouts that enable comparison of compound-induced stress responses over time.
- Analytics: Generates longitudinal single-cell datasets suitable for statistical analysis of growth kinetics, reporter activation, and population stratification.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling sustained exposure conditions relevant to infection microenvironments.
- Enterprise Reuse: Represents a platform capability applicable across multiple bacterial strains and stressors, promoting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving clonal variability and distinguishing adaptive from stochastic responses.
- Operational Value: Enhances reproducibility through microfluidic standardization, minimizing batch effects in phenotypic screening.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing mechanistic insight into duration and consistency of target-mediated effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets with homogeneous, durable mechanism of action across lineages.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, sterile fluid handling, and time-lapse microscopy.
- Depends on access to oxygen plasma cleaners, precision syringe pumps, and inverted fluorescence microscopes.
- Necessitates cross-team standardization of media switching protocols and stimulus timing for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to non-model pathogens or complex community systems.
- Practical limitations include susceptibility to catastrophic failure from air bubbles or cell aggregates, demanding rigorous aseptic technique.
