X-선 사이 누화를 조사 하는 공동 문화 방법을 반구 Caco-2 셀 및 PBMC

우리는 X 레이 방사선 Caco-2와 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 사이 누화를 조사 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 Caco-2 조사와 PBMC; 공동 문화권의 시작 그 후, 트랜스 상피 전기 저항 48 h 및 서양 오 점 Caco-2에 PBMC 수행을 통해 정기적으로 측정 됩니다.

이 coculture 프로토콜의 전반적인 목표는 말초 혈액 단핵 세포의 유무에 따라 Caco-2 상피 세포 단층 투과성 및 밀착 접합 기능에 대한 전리 방사선의 영향을 측정하는 것입니다. 이 방법은 방사선 생물학 및 방사선 면역 요법 분야에서 전리 방사선 노출과 면역 세포 기능 간의 가능한 시너지 효과에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 자극과 세포 집단을 테스트하고 임시 보완 측정을 통해 결합되지 않은 현상을 관찰할 수 있다는 것입니다.

방사선 치료는 환자에 대한 방사선 치료의 경우와 같이 종양 부피에 적절한 빔과 정확한 선량 측정이 조사될 때 Caco-2 세포 단층을 고려하는 것을 목표로 합니다. 방사선 조사 일주일 전에 2밀리리터의 완전한 배지에 있는 5번째 Caco-2 세포를 6웰 세포 배양 플레이트에 웰당 1개의 멸균 1마이크로미터 공극 세포 배양 삽입물로 5배 10배씩 파종합니다. 각 웰의 하단 구획에 3ml의 신선한 완전 배지를 추가하고 세포를 섭씨 37도 및 5% Co2의 가습된 세포 배양 인큐베이터에 7일 동안 놓습니다.

배양 마지막 날에 50ml 원추형 튜브에 25ml의 Ficoll을 추가합니다. 그리고 갓 채취한 전혈 25ml를 Ficoll 위에 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation)로 세포를 분리합니다.

그리고 파스퇴르 피펫을 사용하여 계면에서 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC를 새로운 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 분리된 PBMC를 10ml PBS 세척 2회로 세척합니다. 그리고 세포 배양 인큐베이터에서 3-5시간 이상 동안 PBMC를 신선하고 완전한 배지에서 배양합니다.

광자 X선 에너지를 6메가볼트 피크로 설정합니다. 그리고 Caco-2 세포 배양을 X-선의 궤적 내와 방사선 선원에서 100cm 떨어진 1.4cm 두께의 플렉시글라스 시트에 놓습니다. 그런 다음 각 샘플에 0.57cm 두께의 볼루스를 놓아 후방 산란 방사선 성분과 하전 입자의 평형을 보장합니다.

그리고 평평하고 대칭적인 20 x 20 제곱센티미터 방사선 필드와 분당 3개의 회색 방사선 선량을 사용하여 세포를 조사합니다. Caco-2 세포 대사 활성 및 생존력을 평가하기 위해 1.25ml의 완전한 배지를 방사선 조사 24시간 전에 24웰 플레이트의 각 웰에 있는 5번째 Caco-2 세포에 10회 2회 파종합니다. 그런 다음 세포를 21시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다.

다음 날, 각 웰에 100마이크로리터의 5밀리리터 MTT 용액을 넣고 3시간 동안 세포를 더 배양합니다. PBS 1밀리리터로 세포를 세척한 후 각 웰에 500마이크로리터의 디메틸 설폭사이드를 첨가하여 Caco-2 세포에서 방출되는 포르마잔 결정을 용해시키고 570나노미터의 람다에서 멀티 웰 플레이트 리더로 흡광도를 평가합니다. Caco-2 세포 생존력을 평가하기 위해 웰당 1ml의 PBS로 세포를 세척한 다음 섭씨 37도 및 5%CO2에서 2분 동안 100마이크로리터의 트립신-EDTA 용액으로 세포를 분리합니다.

500 마이크로리터의 완전한 배지로 반응을 중지하고 원심분리를 위해 세포를 개별 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브당 50마이크로리터의 PBS에 펠릿을 재현탁하고 생성된 세포 현탁액을 동일한 부피의 Trypan Blue 생존도 염료 용액과 혼합합니다. 실온에서 3분 후, 혈구계에서 염색되지 않은 생존 세포와 염색되지 않은 세포의 수를 세십시오.

Caco-2 세포의 경상피 전기 저항 또는 TEER을 평가하기 위해, 방사선 조사 전달 직후 Caco-2 세포 배양액의 절반을 각 웰에 3ml의 새로운 완전 배지가 있는 새 플레이트에 삽입하고, 삽입 배양의 절반을 웰당 완전한 배지 3밀리리터당 2배 10에서 6번째 PBMC로 파종한 새 플레이트에 삽입합니다. 그런 다음 TEER 젓가락 전극을 세포 배양 삽입물에 넣고 처음 6시간 동안은 1시간마다, 그 다음에는 조사 후 48시간까지 3시간마다 삽입합니다. 웨스턴 블롯 분석의 경우, 방사선 조사 후 48시간 후에 Caco-2 세포와 PBMC를 1개당 40마이크로리터로 용해하여 세포 용해 완충액의 6번째 세포를 사용합니다.

Caco-2 세포를 용해하고 긁어낼 때 세포 용해물이 손실되고 편향된 결과를 초래할 수 있는 삽입물에서 다공성 멤브레인을 분리하지 않도록 주의하십시오. 용해된 세포 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. bicinchoninic acid 방법으로 각 세포 용해 샘플의 총 단백질 양을 정량화한 후, 개별 마이크로 원심분리 튜브의 각 총 단백질 샘플에 beta-mercaptoethanol이 보충된 Laemmli 샘플 버퍼를 동일한 부피의 Laemmli 샘플 버퍼에 추가합니다.

샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다. 그런 다음 원심분리로 변성된 단백질을 수집하고 각 샘플에서 동일한 총 단백질 부피를 4-20% 프리캐스트 겔에 로드합니다. 120볼트에서 1시간 동안 샘플을 실행합니다.

그런 다음 반건조 전기 전달 시스템을 사용하여 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인으로 전달합니다. 다음으로, 멤브레인을 용기에 넣고 0.2% Tween 20을 보충한 PBS에 5% 무지방 분유로 비특이적 결합 부위를 실온에서 60분 동안 부드럽게 교반하여 막습니다. 차단 배양이 끝나면 세척당 5분 동안 0.2%PBS Tween 20 10ml로 멤브레인을 3회 세척하고 부드러운 교반으로 실온에서 1시간 동안 적절한 관심 항체로 멤브레인에 라벨을 붙입니다.

부드러운 교반으로 섭씨 4도에서 하룻밤 배양 후 방금 설명한 대로 0.2%PBS Tween 20으로 멤브레인을 3회 세척하고 적절한 양고추냉이 과산화효소 접합 2차 항체로 멤브레인을 실온에서 부드러운 교반으로 60분 동안 배양합니다. PBS를 세 번 세척한 후 향상된 화학발광 용액 키트로 멤브레인을 배양합니다. 그런 다음 적절한 스캐닝 시스템으로 결과 필름을 이미지화하고 적절한 이미지 분석 프로그램으로 결과를 정량화합니다.

최대 10개의 그레이까지 방사선 조사는 방사선 조사 후 24시간 또는 48시간에 Caco-2 세포 대사 활성을 변화시키지 않지만, 두 용량 모두에서 시간이 지남에 따라 세포 생존율이 감소합니다. 두 개의 회색 방사선 조사에 노출된 후 비coculture된 Caco-2 세포에 대한 TEER 평가는 조사 후 최대 48시간까지 일관된 TEER 값을 나타냅니다. 그러나 10 grays의 방사선 조사 후, 세포는 방사선 조사 후 3 시간부터 TEER의 장기적인 감소를 보여줍니다.

PBMC와 함께 배양하면 TEER이 감소하는데, 이는 두 선량 모두에서 방사선 조사 후 3시간부터 방사선 조사 후 30시간까지 명백하며, 이 시점에서 TEER 값은 비교적 일관되게 유지되는 것으로 보입니다. 밀착연접 단백질의 웨스턴 블롯 분석은 방사선 조사 및/또는 PBMC 공동 배양에 대한 반응으로 Claudin-1 또는 Occludin 발현에 차이가 없음을 나타내며, 다양한 스캐폴드 단백질에서 큰 변동이 관찰됩니다. 또한, NF-kappa B 총 단백질은 두 방사선 조사에서 영향을 받지 않는 반면, XIAP 단백질 수준은 두 가지 선량에서 4배 상향 조절됩니다.

이 절차를 사용하여 엔테로박테리아와 같은 다른 생물학적 자극을 추가하여 다양한 생물학적 자극이 전리 방사선 노출에 대한 양호한 단층의 반응을 어떻게 수정할 수 있는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 전리 방사선 및 면역 세포가 Caco-2 세포 투과성 및 밀착연접 복합체 발현에 미치는 영향을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.