4.3: MALDI-TOF 질량 분석

매트릭스 보조 레이저 탈광 이온화(MALDI)는 생체 분자 의 분석에 이상적인 질량 분광법 이온 소스이다. 기체 상태에서 화합물을 이온화하는 대신, 샘플은 레이저에 의해 강타되는 매트릭스에 내장되어 있습니다. 매트릭스는 에너지의 대부분을 흡수; 이 에너지 중 일부는 시료로 옮겨져 결과적으로 이온화됩니다. 그런 다음 시료 이온은 비행 시간 분석기(TOF)를 사용하여 식별할 수 있습니다.

이 비디오는 매트릭스 선택과 TOF가 질량 대 충전 비율을 해명하는 데 사용되는 방법을 포함하여 MALDI-TOF의 원칙을 다룹니다. 이 절차는 MALDI 플레이트의 준비, 플레이트에 샘플의 하중 및 TOF 질량 분광계의 작동을 보여줍니다. 최종 섹션에서는 전세포 분석, 복잡한 생물학적 샘플의 특성화 및 전자 스프레이 이온화를 포함한 응용 분야와 변이가 표시됩니다.

MALDI(Matrix-assisted laser desorption ionization)는 생체 분자 분석에 이상적인 질량 분석 이온 소스입니다. 대부분의 이온 소스는 크고 깨지기 쉬운 생체 분자에서 구조 정보를 제거합니다. MALDI는 구조적 무결성과 그에 따른 정보를 유지하는 동시에 분자를 질량 분석기로 가속하여 크기와 전하에 따라 화합물을 분리합니다. MALDI와 가장 일반적으로 결합되는 것은 비행 시간(TOF) 질량 분석기입니다. 이 비디오는 MALDI 이온화의 개념, 일반적인 절차 및 생화학에서의 일부 용도를 보여줍니다.

질량 분석법이 작동하려면 분자가 기체 상태로 이온화되어야 합니다. MALDI에서 시료는 일반적으로 방향족 및 공액 이중 결합을 포함하는 유기 화합물인 매트릭스에 내장되어 있습니다.

레이저 펄스가 이 혼합물에 부딪히면 매트릭스는 대부분의 에너지를 흡수하고 빠르게 가열되며 표면에서 탈착 또는 방출됩니다. 에너지가 공급된 매트릭스는 에너지의 일부를 생체 분자로 전달하여 탈착한 다음 이온화합니다.

MALDI는 일반적으로 TOF(Time of Flight) 질량 분석기와 쌍을 이룹니다. 전기장은 이온에 운동 에너지를 가하여 드리프트 튜브(drift tube)라고 하는 자기장이 없는 영역으로 이동시킵니다. 이온이 튜브를 통과할 때의 속도는 질량 대 전하 비율과 관련이 있으므로 더 무거운 입자는 기기를 통해 더 느리게 이동합니다. 튜브 끝에 있는 검출기는 각 이온의 비행 시간을 측정합니다. 이러한 지식과 튜브 길이 및 적용된 전계 강도를 통해 각 이온의 질량 대 전하 비율을 규명할 수 있습니다.

질량 스펙트럼으로 알려진 질량 대 전하 비율에 대한 신호 강도의 이 플롯은 수집된 스펙트럼 라이브러리와 비교할 수 있습니다. 일치하는 항목이 발견되지 않으면 탠덤 질량 분석법과 같은 추가 기술로 분자를 식별할 수 있습니다. 자세한 내용은 이 주제에 대한 이 컬렉션의 비디오를 참조하십시오.

이제 MALDI-TOF의 기본 사항에 대해 논의했으므로 실험실에서의 프로세스를 살펴보겠습니다.

실험을 시작하기 전에 샘플을 탈착할 매트릭스의 선택을 고려하는 것이 중요합니다. 레이저 에너지를 흡수하고, 진공 상태에서 안정적이어야 하며, 표적 분자와 반응하지 않아야 하고, 탈착할 수 있어야 합니다. 샘플에 따라 다른 매트릭스가 선호됩니다. 큰 단백질의 경우, CHCA와 DHB의 조합은 개별 매트릭스보다 분리능(resolution)이라고 하는 피크의 분리율이 더 우수하다는 것을 보여주었습니다.

샘플을 준비하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 우리는 "이중 층" 또는 "샌드위치" 방법으로 알려진 것을 보여줄 것입니다. 먼저 질량 분석법은 오염에 매우 민감하므로 초순수 시약으로 MALDI 플레이트를 청소합니다. 불활성 가스 흐름으로 플레이트를 건조시킵니다.

다음으로, 일반적으로 유기 용매를 사용하여 포화 매트릭스 용액을 만듭니다. 용액을 MALDI 플레이트에 줄무늬를 만들고 건조시킵니다. 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)을 함유하는 매트릭스의 두 번째 포화 용액을 제조합니다. TFA는 이온이 기체 상태로 들어가는 데 도움이 됩니다.

다음으로, 샘플 용액을 건조된 매트릭스 스폿 위에 추가합니다. 샘플 위에 TFA가 포함된 매트릭스 용액을 추가하여 매트릭스 "샌드위치"를 완성합니다. 스폿의 균질성은 저전력 현미경으로 확인할 수 있습니다.

플레이트 A 보정 표준은 알려진 다양한 질량과 혼합된 것으로, 비행 시간을 m/z와 연관시키는 데 사용됩니다. 마지막으로, 매트릭스만 negative control로 플레이트합니다.

스폿을 분석하려면 타겟 플레이트를 기기에 배치하십시오. 이물질이 없는지 확인하여 단단한 진공을 형성할 수 있습니다. 소프트웨어에서 표준물질, negative control 및 관심 샘플을 선택합니다. 올바른 식별로 얼룩에 레이블을 지정합니다.

이온 소스와 렌즈 전압을 조작하여 분석 성능을 향상시킬 수 있습니다. 이것은 기기 및 샘플의 세부 사항에 따라 다릅니다. 표준 스폿에 초점을 맞추고 소프트웨어로 기기를 교정합니다.

다음으로, 각 샘플 스폿에서 스펙트럼을 수집합니다. 수집된 데이터의 품질을 최대화하기 위해 현장에서 몇 가지 다른 위치를 시도해 보십시오. 완료되면 MALDI 플레이트를 수거하여 세척 후 재사용할 수 있습니다.

지금까지 절차를 검토했으므로 이제 MALDI가 활용되는 몇 가지 방법과 다른 이온화 기술에 대해 알아보겠습니다.

생체 분자 외에도 MALDI는 살아있는 세포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 대식세포는 미세환경에 따라 여러 가지 형태 중 하나를 취하는 면역 세포입니다. 세포를 다양한 신호 분자 또는 사이토카인에 노출시킨 후 플레이트에 직접 첨가하여 분석할 수 있습니다. MALDI 스펙트럼은 사용된 사이토카인에 따라 고유한 "지문"으로 사용할 수 있습니다.

포유류의 피지 분비물과 같은 복잡한 생물학적 시료는 MALDI 분석 전에 정제 단계가 필요합니다. 박층 크로마토그래피는 구성 요소의 극성에 의존하는 기술 중 하나입니다. 화합물은 TLC pate에서 수집되어 정제되어 MALDI 매트릭스로 전달됩니다. 결과 스펙트럼은 포유류의 피지 분비물에서 분리된 생체 분자의 정체성과 순도를 확인합니다.

생체 분자의 또 다른 일반적인 이온 공급원은 전기 분무 이온화(ESI)입니다. 이 방법에서는 샘플이 기기에 주입되어 고전압이 가해져 하전된 방울의 에어로졸을 생성합니다. 액적의 용매가 증발함에 따라 전하가 완전히 기체가 될 때까지 샘플 분자로 이동합니다. ESI는 스포팅 절차가 필요하지 않으며 시료를 기기에 직접 주입할 수 있습니다. 반면에 ESI는 완충액 성분 및 기타 오염 물질의 존재에 더 민감하므로 MALDI가 더 견고합니다.

MALDI 질량 분석법에 대한 JoVE의 비디오를 시청하셨습니다. 이 비디오는 기기의 이론을 설명하고, 일반적인 절차를 살펴보고, 이 기술의 일부 용도를 다루었습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!