Name: 트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 배우세요 수정된 배아 주입 기술을 통해 키메라 생산 효율을 높이는 방법을. 추가 장비 없이 배아 방향을 변경하여 발달 생물학 연구에서 유전자 기능 분석을 가속화할 수 있습니다.

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이 연구는 [부분적으로] 보건원, 국립 연구소의 환경 건강 과학의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다. 통계 분석에 대 한 특별 Shyamal Peddada 감사 합니다. 우리는 또한 험프리 야 오, 게리 조류, 유키 아 라오 그의 지속적인 지원과 조언을 위해이 원고, 및 프랑코 DeMayo의 검토를 위해 감사 하고자.

모든 작업은 마우스 코어의 NIEHS 노크 밖으로 인해 시설 정상 작동의 일환으로 수행 되었다. 모든 마우스는 12시 12분에 유지 했다 h 빛: 다크 사이클, NIH-31와 물 다이어트를 공급 했다 ad libitum. 모든 실험 동물 관리 및 사용 위원회는 국립 연구소의 환경 건강 과학의 수행 했다.
1. 동물 준비
<ol><li>기증자 쥐, b 6 번 식 (Cg)-Tyr < c-2J > b 6 자연스럽 게 나이의 8-10 주에 /J 여성 쥐 (Cg)-Tyr < c-2J > /J 남성 쥐 나이의 8과 26 주 사이. 시각적으로 플러그 다음 아침 (E0.5)을 확인 합니다.</li>
	<li>받는 사람 마우스, 스위스 웹스터 여성 쥐 나이의 6 그리고 9 주 사이 자연스럽 게 vasectomized 스위스 웹스터 남성 쥐 사육 번 식. 시각적으로 플러그 다음 아침 (E0.5)을 확인 합니다.</li>
</ol>2. ES 세포 준비
<ol><li>129-derieved AB2.2 ES 세포에 대 한 문화 15 보충 DMEM 셀 %FBS, 1% 글루타민, 1% 펜/strep, 및 0.1% β-mercaptoethanol. 그들의 권장된 프로토콜을 사용 하 여 ES 셀 공급 업체의 지시 당 다른 모든 ES 세포 문화.</li>
</ol>3. 배아 컬렉션
<ol><li>
동물 해 부
	<ol>
<li>여러 가지 60mm 요리, 약 1 5 마우스 플러스 10 mL 폭발 컬렉션 미디어 (BCM)와 3 추가 준비 (10 %FBS DMEM), 그리고 한 4 잘 잘 당 0.5 mL BCM으로 접시. 37 ° C, 5% CO2에서 equilibrate.</li>
		<li>B 6를 안락사 (Cg)-Tyr < c-2J > 10%의 유량과 CO2 질를 사용 하 여 E3.5에 /J 여성 쥐.</li>
		<li>Euthanizing, 후 부정사 위치에 쥐를 놓고 젖은 70% 에탄올으로 깨끗이 복 부.</li>
		<li>가능한 넓은 개방을 만드는 복 부의 중앙에만, 피부를 통해 첫 번째 절 개를 확인 합니다. 다음 다시 가능한 광범위 한 절 개를 만드는 복 벽을 통해 열. 참고:이 두 단계에 일을 줄이거나 모피 오염 제거에 도움이 됩니다.</li>
		<li>난소에서 시작 하 고 무딘 집게와 난소의 지방 패드를 들고 조심 스럽게 난소, 수 란 관, 및 지방 조직을 최소로 유지 하 여분 배려를 복용 하는 자 궁을 제거. 하나의 단일 단위로 또는 다음 절차에서 변경 되지 않고 개별 뿔으로 자 궁을 제거 합니다.</li>
		<li>제거 후 자 궁 폭발 컬렉션 미디어를 포함 하는 60 m m 접시에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
배아 제거
	<ol>
<li>BCM, 가득 10 mL 주사기를 준비 하 고 25g 바늘으로 적합.</li>
		<li>한 번에 한 자 궁 BCM의 지주 접시에서 그들을 제거, 과잉 혈액을 제거 하 고 해 부 현미경 저 배율에서 60 mm 접시에 배치 하는 조직에서 그들을 얼룩.</li>
		<li>신중 하 고 부드럽게 집게 해 부와 (수 란 관) 근처 선단부 바로 아래 자 궁을 잡고, 병렬 가능한 비행기로에 자 궁의 중앙에 바늘을 삽입 합니다. 그냥 넘어는 집게의 끝에 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>바늘, 자 궁을 겸 자에 압력을 적용 하 고 약 1 mL의 자 궁 경적을 통해 BCM의 추방. 참고: 합니다 주의이 단계에서 주사기에 너무 많은 압력, 미디어의 통제 스트림 하면로 자주 요리를 떠나.</li>
		<li>60 mm 접시 당 최대 5 전체 uteri 자 궁 홍 후 컬렉션까지 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
배아 컬렉션
	<ol>
<li>손으로 그린된 유리 피 펫 및 입 피 펫 장치 using, blastocysts 25 X 35 X 사이의 설정 해 범위에서 수집 합니다. (그림 1)입니다. 참고: 유연한 튜브의 30-40 cm의 입 피 펫 장치 구성, 5mm 미만 아이디 삽입 1, 000 µ L 피 펫 팁, 처음에 한쪽 끝을 가리키고 접사에 유리 피 펫. 연결 1 cc 주사기 배럴, 아니 플런저, 입 조각으로, 다른 끝에 주사기 필터를 추가 합니다.</li>
		<li>인큐베이터에서 요리를 제거 하 고 격자 패턴을 사용 하 여 태아에 대 한 접시의 모든 부분을 검사 합니다. 배아 선택은 개별적으로 하 고 보조 접시에서 BCM의 드롭에.</li>
		<li>모든 요리에서 수집 후 신선한 BCM, 한 방울에 배아를 한 번 더 세척 하 고 주입을 기다리고 4 잘 접시에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 태아 주입
<ol><li>확인에 따라 주사 바늘으로 개별적으로 ES 세포를 선택 합니다.<ol>
<li>5-7 mL 주입 미디어를 추가 하 여 주입 접시를 준비 (DMEM, 10 %FBS 및 20 mM HEPES) 유리 하단 주입 접시. 주사는 상 온에서 수행 됩니다.</li>
		<li>공기 또는 기름 microinjector를 사용 하 여 ES 세포를 주사 바늘을 진공을 적용 됩니다. 셀 사이의 가능한 작은 공간으로 유지 하는 것을 주의. 여기, 또는 사출 단계에서 ES 세포를 계산.</li>
		<li>ES 셀을 셀, 매끄러운 표면, 그리고 명백한 결함이 그들 등의 일반 인구에 비해 크기가 작은 매체를 선택 합니다. 참고: ES 세포 인구 형태학 품질에 크게 변화 하 고 사용 되는 표준 그들과 함께 조정 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>약 15 ES 세포 (그림 1)와 배아를 주사.<ol>
<li>연결 지주 피 펫 팁 두 번째 공기 microinjector를 및 소유자의 오프닝 근처 태아 위치. 소유자에 게 태아를 보호 하는 진공을 적용 합니다.</li>
		<li>태아는 구역에 잘 집중 하 여 다음 슬라이드를 만지고 그냥은 그래야 지주 피펫으로 위나 아래로 이동 하 여 z 축에 대 한 조정. ES 세포 끝 근처 초점이 되도록 다음, 주사 바늘의 Z 축을 조정 합니다.</li>
		<li>부드럽게 주사 바늘 위쪽 이나 아래쪽으로 원하는 위치에 ICM을 넣어 회전에서 추진 하 여 지금 배아를 조정 합니다.</li>
		<li>구역, 그리고 ICM 또는 확고 하지만 제어 푸시를 사용 하 여 trophoblast 통해 주사 바늘을 삽입 합니다. 붕괴에서 blastocoel를 유지 하기 위해 주사 바늘의 microinjector에 약간의 압력을 적용 됩니다.</li>
		<li>바늘은 blastocoel를 침투 하 고, 일단 태아의 blastocoel ES 세포를 전송 하는 microinjector에서 압력을 적용. 바늘의 경사로 잠시 일시 중지 셀 유지 하면서 정상으로 돌아갑니다 배아에 압력을 허용 하는 배아를 종료 하기 시작 합니다. 참고: 참조 그룹 ES 세포는 일반적으로 주입 했다, 전통에 따라 세포 주입 프로토콜9, ICM을 터치 하지 않도록 주의 복용. ES 세포 또한 ICM, 직접 통해는 ICM (TICM) (그림 2보충 영화) 바늘을 밀어를 통해 주입 했다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. eEmbryos의 전송
<ol><li>제조의 절차 당 비 외과 배아 전송 장치를 사용 하 여 E2.5에서 스위스 웹스터 마우스 배아를 전송 합니다. 이 아닌-수술 마 취 또는 수술에 특별 한 주의 요구 한다. 집 쥐의 배아, 그리고 배달 및 후속 이유를 통해 전송 후 개별적으로.</li>
</ol>

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li>
<li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li>
<li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+knockout+mouse+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li>
<li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells%3A+A+Case+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105(2015).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li>
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<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li>
<li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+embryo%22">Manipulating the Mouse embryo</a>. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22Advanced+Protocols+for+Animal+Transgenesis%22">Advanced Protocols for Animal Transgenesis</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).</li>
<li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139(2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.

그것은 오래는 ICM의 어떤 소란 이어질 수 사망, 사실, 현재 blastocyst microinjection 프로토콜 여전히이12,13의 경고 생각 되었습니다. 그것은 우리가 여기에 표시는 ICM 통해 microinjection는 태아에 게 해로운 고 키메라의 수확량을 증가.
이 효과 대 한 정확한 메커니즘 확인 하지 했다. 그러나, ICM와 함께 hypoblast의 기계적 장애 ES 세포 통합 microinjection 다음 새로 형성된 된 ICM의 발생률을 증가 한다. Ipsc의 분야에서 최근 작품 기계적 자극 인간의 iPSC14의 프로그래밍에 도움이 나타났습니다. 기계 조작 마우스 배아의 ICM 비슷한 효과 있으면, 그것은 셀 ICM 만능 상태로 차별화 하는 잠재적으로 시작 했던 ' 시작 ' blastocyst 기증자의 잠재적...

거의 25 년 동안, 유전자 표적으로 쥐의 창조 자주 키메라를 전송 하는 생식의 세대를 위한 blastocysts ES 세포 microinjection 단계에서 병목 현상에 의해 방해, 느린 과정 되었습니다. CRISPR/Cas91,2 ES 세포 및 높은 처리량 ES에 타겟팅을 포함 한 최근 전진 호 같은 세대 컨소시엄 세포, 유전자 변형된 ES 세포의 생성/가용성 향상. 그러나, 생식 키메라의 생성이 ES 세포3,4에서 유전자 변형된 쥐를 만들기에 병목을 남아 있다. 높은 처리량 ES 세포 생성 프로젝트 생식 키메라의 성공적인 창조에 대 한 중요 한 ES 세포 품질 높은 가변성에 의해 괴 롭 혀 왔다. 또한, 일반적으로 이용한 ES 세포 선의 일부 높은 이수성, 및 생식 유능한 키메라5의 어려운 생산 알려져 있다.
어느 높은 키메라와 쥐를 만들기 위한 많은 방법은 개발 되었다 또는 완전히 ES 세포 파생 마우스6,7,8,,910. 이러한 시스템의 각 그것의 자신의 공로 있다, 그러나 그들은 또한 그들의 결점 있다. Tetraploid chimeras, 마우스, 파생 된 100 %ES 세포를 생성 하는 동안 생성, 비효율적 이며 outbred 라인 5,6에 일반적으로 제한 된. Morula 주입의 새로운 방법 높은 백분율 chimeras, 100%에 접근을 얻을 수 있지만 일반적으로 상당한 추가 장비 (레이저 또는 piezos) 및 훈련10,11필요로 합니다. 이러한 기술은 이미 자리에는 실험실,이 새로운 방법론 필요 없을 수 있습니다.
이 연구의이 목적은 키메라 세대, 이후 마우스 식민지를 설치 하는 돌연변이 체 대립 유전자의 생식 전송의 기회를 증가의 속도 높이기 위해 일반적인 기술과 쉽게 사용할 수 있는 장비를 사용 하는 메서드를 찾아야 했다.

<table><tbody><tr><td>ES 세포 주사 바늘</td><td>Humagen</td><td>MSC-20-0</td><td></td></tr><tr><td>NSET 장치</td><td>Paratechs</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>10439-024</td><td>로트는 ES Cell 호환성을 위해 개별적으로 테스트해야 합니다.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 매니퓰레이터</td><td>Leica</td><td>마이크로 매니퓰레이터</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 인젝터</td><td>Eppendorf AG</td><td>Cell Tram Air 5176</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>4 웰 디쉬</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>60mm 접시</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td></td></tr><tr><td>B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J</td><td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>스위스 웹스터 마우스</td><td>Taconic, 미국</td><td>Tac:SW</td><td></td></tr><tr><td>주입 접시</td><td>MatTek Corp.</td><td>P50G-0-30-F</td><td></td></tr></tbody></table>

트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 chimerism 요금

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

ES 셀 방법론을 통해 유전자 변형된 생쥐의 창조에 효율성을 증가 하는 노력에서 선물이 현재 blastocyst 주입 프로토콜을 적응. 여기 우리 보고 배아, 그리고 트랜스 안 세포 질량 (TICM)를 통해 주입의 간단한 회전 50%, 추가 장비에 31%에서 공상 쥐의 비율을 증가 또는 추가 훈련을 전문. 26 다른 근 친 클론, 그리고 9 개월의 기간 동안 35 총 클론 주입 했다. 전통적인 주입 기술 및 TICM 사이 임신 속도 또는 배아의 회복 속도에 상당한 차이가 있었습니다. 따라서 주입 프로세스와는 blastocyst의 간단한 위치는 ICM을 통해 주입에 모든 주요 변경 없이 blastocoel 구멍에 ES 세포 방출 잠재적으로 향상 시킬 수 있습니다 공상 생산 이후 수량 생식 전송입니다.

임의 효과로 셀-선 치료, 혼합된 효과 선형 모델 소프트웨어 (예: SAS (버전 9.2))에서 데이터를 분석 하 사용 되었다. 각 분석 배아 전송 및 셀 라인의 수에 대 한 제어. 두 번째 분석 또한 살아남은 새끼의 수에 대 한 제어.
이 연구를 위해 각 ES 세포 선 및 복제 주입 했다 전통 둘 다 및 TICM 기법, 각 배아 후 두 가지 방법 사이의 교류. 사출, 후 배아 접시에 차별 하 고 송금 받는 여성 당 12의 그리고 15 태아 사이 일반적으로 그룹화 했다. 명확 하 게 보이는 blastocoel 하지 않은 배아 Zona pellucida, 부족 또는 microinjected ES 세포는 blastocoel를 입력 하는 데 실패 하는 곳에,이 실험에서 탈락 했다.
<p class="jove_content" fo:keep-together.with...

여기 우리는 새로운 장비를 사용 하지 않고 키메라 생산을 증가 하는 프로토콜을 제시. 주입에 대 한 배아의 단순한 방향 변경 생산, 배아의 수를 증가 하 고 잠재적으로 생식 전송 타임을 줄일 수 있습니다.

트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

이 수정된 절차의 전반적인 목표는 추가 비용이나 긴 교육 기간 없이 키메라 생산을 늘리는 것입니다. 이 방법은 특히 ES 세포가 최적이 아닌 경우 실험실에서 키메라 생산을 보다 효율적으로 수행하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 추가 장비와 전문 교육이 필요하지 않다는 것입니다.오늘 절차를 시연하는 사람은 Thomas Hagler입니다. 그는 핵심 실험실에서 일하는 생물학자이자 대학원생입니다. 배아를 적출하려면 실험실 조직에 자궁을 닦아 여분의 혈액을 제거하고 장기를 새로운 60mm 접시에 담아 저배율 해부 현미경으로 만듭니다.해부 겸자를 사용하여 자궁을 난관 근처에서 조심스럽고 부드럽게 잡고, 10ml의 폭발 수집 매체가 들어 있는 10ml 주사기에 부착된 25게이지 바늘을 가능한 한 평행한 평면으로 겸자 끝 바로 너머의 자궁 중앙에 삽입합니다. 집게에 압력을 가하여 자궁 내 바늘을 고정하고 자궁 뿔을 통해 약 1ml의 배지를 부드럽게 씻어냅니다. 모든 배반포가 배출되면 구강 피펫 장치를 조립하고 구강 피펫을 사용하여 개별 배아를 두 번째 60mm 접시에 있는 단일 한 방울의 모세포 수집 배지로 옮깁니다.그런 다음 각 배아를 두 번째 한 방울의 blast collection medium으로 세척하고 주입할 때까지 배아를 4웰 접시에 옮깁니다. 시작하려면 마이크로 인젝터를 사용하여 주사 바늘에 진공을 적용합니다. 주사 바늘과 배아 홀더 피펫이 부착된 주입 현미경 아래에 ES 세포 접시를 놓습니다.성공적인 주입을 위해서는 시간을 들여 현미경을 올바르게 설정하는 것이 중요합니다. 여기에는 니들에 있는 적절한 양의 매체와 z축의 올바른 정렬이 포함됩니다. 마이크로 인젝터를 사용하여 주사 바늘에 진공을 적용합니다.세포 사이의 공간을 가능한 한 적게 유지하고, 배아 접시에서 명백한 결함 없이 매끄럽게 표면화된 중소형 배아 세포를 끌어들입니다. 최소 15개의 세포를 수집한 후 홀더의 입구 근처에 배아를 배치합니다. 진공을 적용하여 배아를 홀더에 고정하고 배아가 슬라이드에 닿을 때까지 고정 피펫을 위 또는 아래로 움직여 z축을 조정합니다.투명선 영역에 미세하게 초점을 맞추고 바늘 끝 근처의 배아 세포에 초점이 맞춰질 때까지 주사 바늘의 z축을 조정합니다. 필요한 경우 주사 바늘을 사용하여 내부 세포 덩어리가 주사하기에 적합한 위치에 있을 때까지 배반포를 부드럽게 굴립니다. 단단하지만 통제된 푸시를 사용하여 펠루시다 영역을 통해 주입 바늘을 내부 세포 덩어리에 삽입하고 주입 바늘의 미세 주입기에 약간의 압력을 가하여 배반이 무너지지 않도록 합니다.바늘이 배반구를 관통하면 마이크로인젝터에 압력을 가하여 모든 배아 줄기 세포를 배아로 옮기고, 바늘의 경사가 배아를 빠져나가기 시작할 때 잠시 멈춰 세포를 유지하면서 배아의 압력이 정상으로 돌아올 수 있도록 합니다. 모든 배반포가 주입되면 비수술적 배아 이식 장치를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 배아를 배아 단계 2.5 스위스 웹스터 마우스로 전달하고 분만을 통한 각 이식 및 후속 이유 후 마우스를 개별적으로 수용합니다. 이 대표적인 실험에서, 전통적으로 주입된 트랜스 내부 세포 덩어리와 대조군 사이의 임신율은 변하지 않았으며, 각 그룹에서 젖을 뗄 때까지 동일한 수의 새끼가 살아남았습니다.특히, 젖을 뗄 때 마우스의 수는 변하지 않았지만, 트랜스 내부 세포 질량을 주입한 그룹에서 훨씬 더 많은 수의 새끼가 대조군에 비해 털 색깔 키메라를 나타냈습니다. 이 기술의 가장 좋은 점은 키메라의 더 큰 생산을 촉진하기 위해 배아의 방향만 변경하면 된다는 것입니다. 현미경의 올바른 설정이 필수적입니다.현미경과 매니퓰레이터가 제대로 설정되고 잘 유지되지 않으면 주입 과정이 작동하지 않습니다. 배아 주사를 처음 접하는 경우, 반복만이 배울 수 있는 유일한 방법입니다. 초보자의 경우 배아 취급이 절차에서 가장 어려운 부분인 경향이 있습니다.배아를 하나도 잃지 않고 한 접시에서 다른 접시로 효율적으로 이동할 수 있는 것이 실험의 가장 중요한 부분입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 표준 주입 기법을 간단히 변경하는 것만으로도 키메라 생산의 효율성을 높이는 데 어떻게 도움이 되는지 잘 이해하게 될 것입니다.

trans-inner-cell-mass-injection-embryonic-stem-cells-leads-to-higher

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

하드 chorion 부드러운 배아, medaka의 배아의 조작으로 인해 더 zebrafish에 비해 참여합니다. 이 비디오는 chimeras의 생산을위한 이미징 및 세포 이식에 대한 아가로 오스의 장착 dechorionation 포함한 medaka의 배아를 조작하는 방법에 대한 단계별 절차를 나타냅니다. 이러한 절차는 척추 게놈 기능의 유전자 해부 위해 상호 보완적인 기능을 최대한 활용하기 위해 실험실에서 medaka와 zebrafish를 사용하는 필수적입니다.

Chimeras의 생성에 대한 Medaka의 태아 및 세포 이식의 Dechorionation

좋은 팁을 사용하면 우리가 닭 somites이나 신경 튜브의 하위 도메인에 플라스미드 DNA를 주입 micropipettes. 플라스미드의 농도는 단일 transfected 세포를 생성하기 위해 조정됩니다. 우리는 다음 세포가 clonal 인구로 발전 수 있습니다.

칙 태아의 단일 세포 Transfection

우리는 체세포 핵 전송 (SCNT)를 통해 epigenetic 프로그래밍이 사전 정의된 T 세포 수용체 (TCR) specificities와 마우스 모델을 생성하는 도구로 사용할 수 여기를 보여줍니다. 이러한 transnuclear 생쥐는 내생 모터의 제어하에 자신의 내생 로커스에서 해당 TCR을 표현.

반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

그들은 pluripotency에 대한 표준 테스트를 통과 때도 생성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 라인이 발달 가능성을 서로 다른 행을 생산하고 있습니다. 여기 가진 전체 pluripotency로 iPSC 라인을 정의 iPSCs에서 완전히 파생 쥐를 생산하기 위해 프로토콜을...

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

우리는 배양된 세포를 초기 마우스 배아의 정의된 부위에 이식하여 생체 내 잠재력을 결정하는 방법을 보여줍니다. 또한 알려진 직경의 유리 모세혈관을 사용하는 최적화된 전기천공법(electroporation method)을 도입하여 배아의 몇 개의 세포에 외인성 DNA를 정확하게 전달할 수 있습니다.

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

여기에서는 Tfap2c, Gata3, Eomes 및 Ets2의 10일 과발현을 통해 쥐 배아 섬유아세포를 완전한 기능을 갖춘 안정적인 영양막아세포 줄기세포로 직접 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

우리는 murine 모델에 주입의 정 맥 및 양수 내 노선을 통해는 utero에 이식 (IUT)을 수행 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 독특한 면역 관용 태아 환경에 셀, 바이러스 성 벡터, 및 다른 물질을 소개 하는 것이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식

이 방법에서는, 배아 심장 조직 microdissected, 해리, 붙일 레이블 및 호스트 배아 조직으로 이식 수술이 있습니다. 이 개인 또는 조직 수준 발달 조직 아래 소성 hemodynamic 조건 및/또는 변경된 paracrine/juxtacrine 환경 공부를 위한 플랫폼을 제공 합니다.

조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

이 논문의 전반적인 목표는 닭 배아에 외인성 물질의 난소 세포 내 주사를 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 접근법은 닭 배아의 발달 생물학을 연구하는 데 매우 유용합니다.

오보에서 닭 배아에 혈관 내 주사

여기에서는 배아 줄기 세포를 사용하여 유전자 변형 마우스 모델, 특히 대형 DNA 녹인 (KI)을 개발하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 조정되어 기존의 상동 재조합 매개 선형화된 DNA 표적화 방법에 비해 KI 효율이 크게 향상되었습니다.

유전자 조작 마우스 모델 개발을 위한 배아 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 고효율 유전자 표적화

배우세요 수정된 배아 주입 기술을 통해 키메라 생산 효율을 높이는 방법을. 추가 장비 없이 배아 방향을 변경하여 발달 생물학 연구에서 유전자 기능 분석을 가속화할 수 있습니다.

트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금

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