4.14: Förster 공명 에너지 전송 (FRET)

Förster 공명 에너지 전송 (FRET) 근거리 생화학 적 상호 작용을 조사하는 데 사용되는 현상이다. FRET에서, 기증자 광발광분자는 각각의 방출 및 흡수 스펙트럼이 겹치는 경우에 비 라디아케로 에너지를 수용자 분자로 비-방사적으로 전송할 수 있습니다. 전달된 에너지의 양 - 그리고 결과적으로 샘플의 전반적인 방출은 수용자 기증자 쌍의 광발광성 분자의 근접에 달려 있습니다. FRET 분석은 이 "분광 눈자"에서 생분자 구조 및 상호 작용의 상세한 정보를 얻기 위하여 그밖 생화학 기술과 결합됩니다.

이 비디오는 FRET 분석의 원칙과 개념을 다룹니다. 이 절차는 FRET에 대한 샘플을 준비하고 데이터를 표시하고 해석하는 방법에 중점을 둡니다. 마지막으로, 응용 프로그램은 세포 또는 단백질의 일부를 라벨링하여 형성 및 세포 과정을 모니터링, 단백질 구조를 변경하는 효소 반응을 모니터링하고, FRET를 사용하여 세포에 의해 발현된 단량체의 응집을 모니터링하는 것을 포함한다.

F?rster Resonance Energy Transfer 또는 FRET는 발광 분자 간의 비방사 에너지 전달이며 근거리 생화학적 상호 작용을 조사하는 데 자주 사용됩니다. FRET는 형광 분자가 서로 10nm 이내의 간격을 두고 있을 때만 발생합니다. FRET 해석은 다른 기술과 결합하여 자세한 구조 정보를 얻을 수 있습니다. 이 비디오에서는 FRET의 기본 원리를 소개하고, 프로토콜 및 데이터 프레젠테이션을 요약하고, 몇 가지 생화학적 응용 분야에 대해 논의합니다.

형광단과 같은 광발광 분자는 흡수 스펙트럼의 파장에서 전자기 복사를 흡수하여 여기됩니다. 이완됨에 따라 방출 스펙트럼 내의 파장으로 빛을 방출합니다. 형광에 대한 자세한 내용은 형광 현미경 검사에 대한 JoVE의 비디오를 참조하십시오. 서로 다른 형광단은 서로 다른 파장의 빛을 흡수하고 방출하며, 이는 자주 겹칩니다. 형광단의 방출 스펙트럼이 다른 형광단의 흡수 스펙트럼과 크게 겹치는 경우, ?공여체? "acceptor?"에 의해 흡수되는 가상 광자를 방출합니다. 여기된 공여체가 수용체로부터 10nm 이내에 있을 때, 에너지는 쌍극자-쌍극자 상호 작용에 의해 공여체에서 수용체로 전달됩니다. 공여체로부터의 빛 방출에 의한 에너지 방출은 그에 따라 감소합니다. 한편, 여기된 수용체는 방출 파장에서 빛을 방출합니다. FRET 반응은 효율성 또는 형광 또는 기타 복사 과정이 아닌 FRET에 의해 공여체에서 방출되는 에너지의 비율 측면에서 평가됩니다. 효율성은 공여체와 수용체 사이의 거리에 크게 의존하며, 이를 통해 FRET는 '분자' 또는 '분광' 눈금자로 작용할 수 있습니다.

생화학에서 FRET는 형광단이 서로의 FRET 범위 안팎으로 이동할 때 분자의 구조적 변화를 관찰하기 위해 질적으로 사용되는 경우가 많습니다. 마찬가지로, 세포 기능은 FRET 쌍을 포함하는 분자로 연구할 수 있습니다. 표지된 분자가 효소 활성에 의해 절단되면 FRET가 중지되고 관찰된 형광 파장이 변합니다.

이제 FRET의 기본 원칙을 이해했으므로 프로토콜의 개요와 데이터를 제시하고 해석하는 몇 가지 방법을 살펴보겠습니다.

실험에 앞서, 일반적으로 DNA 또는 단백질과 같은 관심 생체 분자는 분자 생물학 기술을 사용하여 형광 태그로 설계되었습니다. 변형된 유전 물질을 세포에 도입하는 일반적인 방법에는 형질주입(transfection)과 전기천공법(electroporation)이 있습니다.

그런 다음 세포는 형광 현미경에서 FRET 시각화를 위해 준비됩니다. 예를 들어, 분자는 단일 분자 FRET를 위해 슬라이드에 고정되거나 고처리량 스크리닝을 위해 샘플이 웰에 로드될 수 있습니다.

그런 다음 여기 레이저, 현미경 및 관련 장비가 준비됩니다. (A) FRET 실험에는 종종 강력한 레이저가 포함됩니다. (B) 따라서 적절한 PPE 및 안전 절차를 사용해야 합니다.? 그런 다음 샘플을 기기에 넣고 여기 레이저로 조명합니다.

세포 거동을 모니터링하는 실험의 경우 방출 강도의 차이 또는 변화를 보여주는 컬러 이미지가 사용됩니다. 공여체 및 수용체 방출 강도는 시간 경과에 따른 FRET 반응을 추적하기 위해 함께 표시됩니다.

FRET 데이터는 또한 더 복잡한 분석을 위해 다양한 기능에 적합할 수 있습니다. 실험에 따라 결과를 가장 잘 나타내기 위해 데이터를 여러 가지 방법으로 제시할 수 있으므로 FRET는 유연한 실험 도구입니다.

이제 FRET 실험 실행 및 분석의 기본 사항에 익숙해졌으므로 생화학 연구에서 FRET의 몇 가지 응용 분야를 살펴보겠습니다.

FRET는 서로 10nm 이내로 이동할 것으로 예상되는 단백질 또는 세포의 일부를 FRET 쌍으로 표시하여 구조적 변화 또는 세포 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 단백질 센서는 한 쌍의 형광단으로 수용체를 라벨링하여 준비합니다. FRET 반응은 컨포칼 현미경으로 실시간으로 모니터링됩니다. 방출 파장과 강도의 변화는 구조적 변화를 나타냅니다.

FRET는 활성 FRET 쌍을 가진 분자를 준비하고 반응의 변화를 관찰하여 사용할 수도 있습니다. 기질이 절단되면 FRET가 파괴되어 공여체 방출이 증가하고 수용체 방출이 감소합니다. 배출량을 분석하여 공여국, 수용자 및 FRET의 기여도를 결정합니다. 시안색(cyan) 및 황색(yellow) 형광 단백질에 대한 직접 방출 계수(direct emission factor)가 계산되면 기질의 농도 및 운동 매개변수를 결정할 수 있습니다.

FRET 쌍 중 하나를 포함하는 단량체를 발현하도록 설계된 세포는 이러한 단량체 간의 상호 작용을 위한 '센서' 역할을 합니다. 이러한 단량체의 응집이 유도되면 FRET 반응이 관찰됩니다. 이는 잘못 접힌 단백질의 '시딩(seeding)'에 의해 유발되는 단백질 응집을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서, 세포는 관심 단백질의 응집체로 형질도입되고, 배양되고, 유세포 분석으로 분석되었습니다.

F?rster Resonance Energy Transfer 또는 FRET에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 이 비디오에는 FRET의 기본 원리, FRET 실험의 준비 및 분석, 몇 가지 생화학적 응용이 포함되어 있습니다.

시청해 주셔서 감사합니다!