종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

이 프로토콜의 전반적인 목표는 종양 조직 및 암 세포주에서 조합 염색질 상태 패턴을 편견 없이 식별하는 것입니다. 이 방법은 불모의 히스톤 변형 상태가 종양 발생에 어떻게 기여할 수 있는지와 같은 암 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 히스톤 변형과 여러 샘플을 동시에 동시에 효율적으로 처리 할 수 있다는 것입니다.

먼저, 멸균 면도날을 사용하여 흑색종 조직 50mg을 수동으로 해리하고 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 2mL를 해리합니다. 멸균 조직 배양 접시에서 약 5분 동안 조직을 3mm 또는 4mm 조각으로 다집니다. 조직 용액을 해리기 튜브로 옮기고 HBSS의 8밀리리터를 더 첨가합니다.

균질화될 때까지 해리기(dissociator)를 사용하여 조직을 추가로 해리합니다. 다음으로, HBSS 3밀리리터당 16%포름알데히드 200마이크로리터를 첨가하여 조직을 가교합니다. 믹서를 사용하여 섭씨 37도에서 정확히 10분 동안 10rpm으로 혼합물을 흔듭니다.

인큐베이터에서 샘플을 꺼낸 후 샘플 3ml당 200마이크로리터의 종양 글리신을 넣고 혼합물을 섭씨 37도에서 10rpm으로 5분 동안 흔듭니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 섭씨 4도에서 5분 동안 934배 g으로 샘플을 회전시킵니다. 완료되면 상층액을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS 5ml를 추가합니다.

그런 다음 934 회 g에서 샘플을 다시 원심 분리 한 다음 상층액을 제거합니다. 조직 50mg당 프로테아제 억제제가 포함된 ChIP 수확 완충액 300마이크로리터를 추가하고 얼음에서 30분 동안 샘플을 용해합니다. 세포가 용해되는 동안 수조 교란기 및 관련 냉각 시스템을 켜고 온도가 섭씨 4도에 도달하도록 합니다.

초음파 처리기 튜브를 수조 교란기에 넣고 30초 켜기 및 30초 끄기에서 60회 주기 동안 흑색종 조직을 초음파 처리하여 200-600 염기쌍의 염색질 단편을 얻습니다. 8mg의 흑색종 조직에 대해 튜브 리볼버를 사용하여 섭씨 4도에서 2시간 동안 20마이크로리터의 단백질 g 마그네틱 비드와 100마이크로리터의 결합 차단 버퍼와 함께 각 히스톤 항체 3마이크로그램을 배양합니다. 초음파 처리 후 ChIP 희석 완충액을 사용하여 샘플을 5 회 희석하여 SDS 농도를 0.1 %로 낮추십시오.항체 및 단백질 g 자성 비드의 배양이 완료된 후 ChIP 희석 완충액을 제거하고 240 마이크로 리터의 새로운 완충액에 비드를 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 20마이크로리터의 비드 분취량을 12개의 개별 튜브에 넣고 각 튜브는 별도의 조직 샘플에 사용됩니다. 초음파 처리 된 물질을 특정 항체가있는 단백질 g 비드에 균등하게 분취하고 튜브 리볼버를 사용하여 섭씨 4도에서 밤새 튜브를 회전시킵니다. 역 가교 결합 후 아침에 항체 단백질 용액을 96웰 플레이트로 옮기고 마그네틱 스탠드에 놓습니다.

비드가 30초 이상 부착되도록 한 후 상층액을 제거합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 150마이크로리터의 얼음처럼 차가운 RIPA 세척 버퍼로 비드를 5회 세척합니다. 세척할 때마다 30초 동안 자석을 계속 움직인 다음 상등액을 제거합니다.

세척 단계 후, 칩당 44마이크로리터의 직접 용출 버퍼, 1마이크로리터의 Rnase 및 5마이크로리터의 프로테나제 k를 포함하는 용리 완충액 마스터 믹스를 추가하고 역가교결합을 위해 샘플을 입력합니다. PCR 열 순환기를 사용하여 섭씨 37도에서 4시간, 섭씨 50도에서 4시간, 섭씨 65도에서 8-16시간 동안 샘플을 배양합니다. 다음 날 아침, 샘플을 자석에 다시 놓고 상층액을 아미노 침전 DNA가 포함된 새로운 96웰 PCR 플레이트로 옮깁니다.

용액에 2.3 x 상자성 비드를 추가하고 다중 채널 피펫을 사용하여 조심스럽게 위아래로 25회 피펫팅합니다. 그런 다음 실온에서 4분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 자석에 다시 놓고 실온에서 4분 더 배양합니다.

상등액을 버린 후 샘플에 70% 에탄올 150마이크로리터를 첨가하고 비드를 방해하지 않고 실온에서 30초 동안 배양합니다. 비드가 건조되도록 한 후 자석에서 샘플을 제거하고 30마이크로리터의 10밀리몰 트레이셜을 추가합니다. 피펫팅으로 25회 혼합합니다.

실온에서 샘플을 배양한 후 자석에 다시 놓고 실온에서 4분 더 배양합니다. 라이브러리 준비를 위해 각 시료 20마이크로리터를 새로운 96웰 플레이트로 옮깁니다. PCR 증폭 후 샘플을 제거하고 핵이 없는 물을 사용하여 총 부피를 100마이크로리터로 가져옵니다.

먼저 각 샘플에 55마이크로리터의 비드를 추가하고 피펫으로 25회 혼합하여 양면 상자성 크기 선택을 수행합니다. 그런 다음 실온에서 4분 동안 배양합니다. 샘플을 자석에 다시 놓고 실온에서 4분 더 배양하여 염기서열분석에 적합하지 않은 비드에 큰 단편을 얻습니다.

배양 후 상층액을 새로운 96웰 PCR 플레이트로 옮깁니다. 또 다른 25마이크로리터의 상자성 비드를 추가하고 25회 피펫팅하여 혼합한 다음 자석을 꺼낸 후 실온에서 4분 동안 배양합니다. 실온에서 배양한 후 샘플을 자석에 다시 놓고 실온에서 4분 동안 배양합니다.

그런 다음 상등액을 버리십시오. 샘플을 자석에 남겨둔 상태에서 150 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 넣고 비드를 방해하지 않고 실온에서 30 초 동안 배양합니다. 에탄올을 제거하고 세척을 반복하십시오.

비드가 건조될 때까지 기다린 후 자석에서 샘플을 제거하고 10밀리몰 미량 pH 8.0 25마이크로리터를 추가합니다. 25회 피펫팅으로 혼합하고 실온에서 자석을 분리하여 4분 동안 배양합니다. 실온에서 배양한 후 샘플을 자석에 다시 놓고 실온에서 4분 동안 배양합니다.

이제 멀티플렉싱하기 전에 고감도 DNA 전기표기법 기기를 사용하여 라이브러리를 정량화하여 크기가 염기서열분석에 적합한지 확인하십시오. 이 프로토콜은 동결된 종양 조직 및 세포주의 면역침전을 허용하며, 수십 개의 샘플에서 고처리량 방법을 사용하여 병렬로 수행할 수 있습니다. 염색질 단편은 최적의 면역침전을 위해 200개에서 1000개 사이의 염기쌍 범위여야 합니다.

라이브러리 준비를 진행하기 전에 정제된 ChIP DNA를 정량화해야 합니다. 멀티플렉싱 및 차세대 염기서열분석에 적합한 완성된 라이브러리는 200 - 600개의 염기쌍 범위여야 하며 프라이머 이량체가 없어야 합니다. 사후 염기서열분석 시에는 macs peak calling 및 chromHmm 분석과 같은 파이프라인의 추가 단계를 진행하기 전에 충족해야 하는 많은 품질 관리 메트릭

ChIP 샘플은 입력 DNA에 대해 농축되어야 하며 각 히스톤 변형은 후성유전학적 지형의 특정 구성 요소를 나타내는 뚜렷한 프로필을 표시해야 합니다. 크롬 HMM 알고리즘은 다변량 숨겨진 마르코프 모델을 사용하여 연구된 히스톤 변형을 기반으로 가장 두드러진 반복 조합 및 공간 염색질 패턴을 식별합니다. 이러한 6가지 변형을 사용하여 크롬 HMM은 폴리콤 억제(polycomb repression), 이색적 억제(heterochromatic repression), 능동 전사(active transcription) 및 활성 인핸서(active enhancers)와 같은 억제 영역과 활성 도메인을 모두 나타내는 기능적으로 구별되는 염색질 상태를 식별합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행된다면 3-4일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 라이브러리 준비 및 데이터 분석을 계속하기 전에 항체에 대한 최적의 초음파 처리 조건과 사양을 결정하는 것이 중요합니다. 이 절차를 학습하기 위해 RRS 염기서열분석 및 염색체 확인 캡처와 같은 다른 방법을 수행하여 유전자 발현 및 더 높은 염색질 구조를 가진 염색질 상태 부분의 연합을 결정할 수 있습니다.

실험 후, 이 기술은 암 후성유전학 분야의 연구자들이 환자 종양 샘플에서 염색질 상태 패턴을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 종양 조직을 처리 및 분리하는 방법, 염색질 면역침전을 수행하는 방법, 차세대 염기서열분석을 위한 라이브러리를 준비하는 방법, 염기서열분석 후 데이터를 처리하는 방법, 다운스트림 분석의 초기 단계에 대한 통찰력을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 포름알데히드로 작업할 때 포름알데히드는 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행할 때 항상 적절한 흄 후드와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.