Name: 종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 배우세요 고처리량 ChIP-시퀀싱을 활용한 종양 조직의 크로마틴 상태 패턴 분석 방법. 이 기술은 다중 히스톤 변형을 동시에 효율적으로 처리하여 암 표유전학 연구에 활용됩니다.

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우리는 마커 스 코일, Curtis Gumbs, 시퀀싱 지원에 대 한 MDACC에서 SMF 핵심을 감사합니다. 이 문서에서 설명 하는 작업 SMF 코어 NIH 그랜트 (CA016672)에서 교부 금에 의해 지원 되었다와 NCI K. R. (1K99CA160578 및 R00CA160578) 수상

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</ol>

저자 없음 충돌 선언합니다.

이 프로토콜 chromatin 주에서 인간의 종양 조직 및 세포의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 높은 처리량 칩 seq 모듈을 설명합니다. 어떤 칩 seq 프로토콜에서 가장 중요 한 단계 중 하나는 항 체 특이성입니다. 여기,이 메서드는 설명된 6 히스톤 수정, 모두 칩 등급 및 이전에 우리와 다른 실험실42,,4445 에 검증에 대 한 immunoprecipitation 조건 설명 . 동일한 항 체 농도 다른 다양 한 종양 종류에 성공적으로 적용 된, 하는 동안 그것은 관심27의 다른 요소를 공부 하는 경우 항 체 특이성을 결정 하는 중요 한.
성공적인 실험에 대 한 또 다른 주요 측면 쥡니다 조건의 최적화를 포함 한다. 쥡니다 시간과 샘플 및 조직 유형 사...

포유류 게놈 (98-99%)의 대다수는 noncoding 시퀀스, 구성 그리고 알려진 유전자 발현 및 염색 질 조직1,2에 참여 하는 규제 요소를 포함 하는이 nocoding 지역. 정상 세포에서 게놈 DNA의 특정 어셈블리 압축된 chromatin 구조에이 공간 조직, 규정 및 다양 한 DNA 관련 된 프로세스3,,45의 정확한 타이밍에 대 한 중요 합니다. 그러나 암 세포에, chromatin 수정 후 성적인 탈 선 메커니즘에 의해 chromatin 구조, 규제 요소, 염색체 루핑 시스템 및 유전자 표현 패턴6에 대 한 액세스를 포함 하 여 부적절 한 조직에 발생할 수 있습니다. 7,8,,910.
최근 발전에도 불구 하 고 우리 후 변경 관련 된 종양의 진행 이나 치료 응답의 이해를 제한 했다. epigenome 수정, 히스톤 부호, DNA 메 틸 화, 총칭 impinges 유전자 식 네트워크와 유지에 대 한 중요 한 다른 프로세스는 동적 상태 (chromatin 상태 라고 함)를 형성 등의 구성 세포 id입니다. 최근, 강화 변경 H3K27Ac 프로필11공부 하 여 여러 악성 종양에 표시 되었습니다. 100 개 이상의 후 성적인 수정 확인 된12,13 그들의 생물 학적 역할의 명확한 이해 없이 되었습니다 이러한 연구 격리 후 성적인 부호의 상관 관계에 대 한 통찰력을 제공, 그리고 상호 의존입니다. 또한, 이러한 히스톤과 DNA 수정 가능한 조합 패턴의 더 큰 수가 있다 며 이러한 조합 패턴-개별 수정-epigenetic 국가14를 지정 하는. 따라서, 암 진행 이나 치료. 에 대 한 응답 하는 동안 이러한 chromatin 상태 변경 식별 엄청난 필요는 암에 epigenome 변경의 포괄적인 지식 기술 (예: 작은 양의 임상 자료/단일 셀에서 대규모 데이터의 발생)으로 인해 일부 후행 되었습니다 있다 및 분석 (예: 알고리즘을 정의 조합 국가) 도전. 따라서, 필요도 중요 한 임상 자료와 구현 하기 쉬운 전산 접근에서 히스톤 수정 표시의 많은 수를 프로 파일링에 대해 강력한 높은 처리량 방법 촉진 한다 조합 패턴 예측 epigenetic 상태 tumorigenesis 및 치료 저항의 다른 단계와 관련 된 결정. 최근 epigenome 프로 파일링 연구15,,1617,18,19,20,21에서 사용할 수 있는 추가, 데이터 정상 조직 및 세포에서 22,23 chromatin 프로필에 대 한 추가 epigenome 기여 종양 생물학에 종양의 통합 될 수 있다.
Chromatin 프로 파일링 다양 한 chromatin 수정15,24의 글로벌 바인딩 패턴을 식별 하기 위한 강력한 도구가 되고있다. 최근 몇 년 동안에 칩 seq 세계적인 규모25,,2627에 DNA 단백질 상호 작용 연구 "금 표준" 되고있다. 어떤 칩 seq 실험에 대 한 단계가 중요 한 성공, 조직 처리 및 연관 해제를 포함 하 여, 최적의 쥡니다 조건, 강 수, 도서관 준비에 대 한 최적의 항 체 농도 determing determing에 필요한 -시퀀싱 데이터 처리 및 다운스트림 분석입니다. 각이 단계 주요 품질 관리 검사점을 포함 하 고 함께 찍은 때 제대로 기능 유효성 검사에 대 한 잠재적인 대상을 식별 하는 데 중요 한 있다. 이 단계에서 혁신을 통해 여러 이전 연구에서 적은 양의 조직28,,2930,31,32 칩 또는 칩 Seq를 수행 하는 방법론 개발 . 또한, 일부 연구는 높은 처리량 칩 실험 뒤에 PCR 프로토콜 기반 정량33,34건의 했다. 마지막으로, 일부 공개적으로 사용 가능한 분석 플랫폼 칩 Seq 데이터에 대 한 Easeq35 등 은36사용할 수 지금 있습니다. 그러나, 하나의 마크 chromatin 상태 분석 수행을 계산 파이프라인 함께 높은 처리량 패션에 칩 Seq를 수행 하기 위한 통합된 플랫폼 부족 되었습니다.
이 프로토콜 설명 종양 조직에 셀 라인, chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 칩 seq 워크플로 쉽게 성공적인 실험에 필요한 단계를 모두 포괄 하는 지침에 따라. 이전 Blecher 고 넨 외. 에 의해 설명 하는 높은 처리량 방법을 채택 하 여 37이 프로토콜 병렬로 샘플의 수십에서 수행할 수 있습니다 그리고 암 세포 선 및 흑색 종, 전립선, 콜론과 세포종 님 같은 인간 종양에 성공적으로 적용 되었습니다. 6 코어 히스톤 수정 인간 흑색 종 세포 선 및 종양 샘플에 epigenetic 규제 프리의 주요 구성 요소를 나타내는 방법을 보여 줍니다. 이러한 수정 포함 H3K27ac (강화), H3K4me1 (활성 및 태세 강화), H3K4me3 (발기인), H3K79me2 (복사할 영역), H3K27me3 (polycomb 억압), 및 H3K9me3 (heterochromatic 억압). 이러한 표시 억압 및 활성 도메인을 나타내는 기능적으로 뚜렷한 chromatin 상태를 식별 하기 위해 단독으로 또는 조합에서 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>ChIP 등급 H3K4me1 항체</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>ChIP 등급 H3K27ac 항체</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>ChIP 등급 H3K4me3 항체</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>ChIP 등급 H3K79me2 항체</td><td>Abcam</td><td>ab3594</td><td></td></tr><tr><td>ChIP 등급 H3K27me3 항체</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td></td></tr><tr><td>ChIP 등급 H3K9me3 항체</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris HCl, pH 8.0</td><td>Teknova</td><td>T1080</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma - 생명 과학</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>시그마-알드리치</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>트리톤-X</td><td>시그마-알드리치</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>746460</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1% TWEEN-20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA - IgG-free</td><td>Sigma - 생명 Sciences</td><td>A2058-5G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C 튜브</td><td>GentleMACS</td><td>120-008-466</td><td>분리 튜브</td></tr><tr><td>16% 포름알데히드</td><td>Peierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>miniProtease 억제제&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836153001</td><td>프로테아제 억제제 정제</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10009D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor NGS 튜브 0.65 mL</td><td>Diagenode</td><td>C30010011</td><td>초음파 처리 튜브</td></tr><tr><td>DynaMag - 96 Side Skirted</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td>96-well magnetic stand</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Promega</td><td>V6231</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>100005393</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 비드</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>상자성 비드</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ds DNA 고감도 분석 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>고감도 DNA 시약</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 준비 키트</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td>DNA 라이브러리 준비 키트</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 정제수</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>고감도 D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>고감도 DNA 시약</td></tr><tr><td>고감도 D1000 시약</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td>고감도 DNA 시약</td></tr><tr><td>멀티플렉스 올리고 (인덱스 프라이머- 세트 1)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7335L</td><td>멀티플렉스 올리고&nbsp;</td></tr><tr><td>멀티플렉스 올리고 (인덱스 프라이머- 세트 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7500L</td><td>멀티플렉스 올리고&nbsp;</td></tr><tr><td>TapeStation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>고감도 DNA 전기 페로그램 기기</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico 초음파 처리 장치&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>B01060001</td><td>수조 디크루터</td></tr><tr><td>, 믹서</td><td>너트 421105</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 터치 열 순환기,</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>PCR 열 순환기</td></tr><tr><td>수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>2322</td><td></td></tr><tr><td>다중 채널 피펫</td>, <td>덴빌</td><td>1003123</td><td></td></tr><tr><td>관 리볼버</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td>88881001</tr><tr><td>96-Well 스커트 플레이트</td><td>Eppendorf</td><td>47744-110</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R 원심분리기&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99464</td><td>탁상용 원심</td></tr><tr><td>분리기 Centrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td>탁상용 원심분리기</td></tr><tr><td>광학 튜브 스트립(8x 스트립)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>광학 튜브 스트립 캡(8x 스트립)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>로딩 팁, 10 pk</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>IKA MS3 와류</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>와류</td></tr></tbody></table>

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

히스톤 수정은 epigenome의 주요 구성 요소를 구성 하며 중요 한 역할을 규제 관련된 loci의 transcriptional 상태를 결정 합니다. 또한, 특정 수정의 존재 위치와 강화 등 비 코딩 기능 요소 정체성을 결정 하 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, chromatin immunoprecipitation 다음 세대 시퀀싱 (칩 seq) 다음 개별 히스톤 수정의 게놈 넓은 프로필 결정에 강력한 도구가 되고있다. 그러나, 그것은 점점 더 분명 chromatin 수정, Chromatin 상태 라고의 조합 패턴 정체성과 관련 된 genomic 소재 시의 결정 되고있다. 따라서, 다양 한 전산 분석 파이프라인 수 뿐만 아니라 히스톤 수정 표시를 프로 파일링에 대 한 강력한 높은 처리량 (HT) 방법론의 구성 된 워크플로 처리 칩 Seq의 무수의 프로 파일링 데이터 집합에 필요한 샘플의 많은 수에 있는 epigenomic 국가의 포괄적인 결정. 여기는 HT 칩 Seq 워크플로 두 개의 모듈로 구성: 1) 적은 양의 종양 샘플 및 96-잘 형식; 셀 라인에서 여러 히스톤 수정 프로 파일링 실험 프로토콜 그리고 2) 개별 마크 인 및 조합 chromatin 상태 패턴을 계산 하는 기존 도구를 결합 하 여 전산 데이터 분석 파이프라인. 함께,이 두 가지 모듈 쉽게 처리 칩 Seq 샘플의 수백의 신속 하 고 효율적인 방식으로 촉진 한다. 여기에 제시 된 워크플로 chromatin 상태 패턴 흑색 종 종양 세포에서 6 히스톤 마크 프로필에서 파생 하는 데 사용 됩니다. 전반적으로, 우리는 인간의 종양 샘플 및 다양 한 악성 종양에 epigenomic 착오를 결정 하기 위해 암 세포 라인에 적용할 수 있는 포괄적인 칩 seq 워크플로 제시.

이 프로토콜에는 냉동된 종양 조직 및 높은 처리량 방법 (그림 1A)를사용 하 여 병렬로 샘플의 수십에 수행할 수 있는 셀 라인에서 immunoprecipitation 수 있습니다. 염색 질 조각을 위한 최적의 immunoprecipitation ~ 200-1000 bps 사이 범위 해야 합니다. 우리는 같은 전단 길이 달성 하는 데 필요한 시간이 다른 조직 및 세포 유형에 대 한 다른 지적 했다. 적은 양의 조직에서 칩의 성공 특히 쥡니다 동안 항상 lysate 감기 유지에 따라 달라 집니다. 순화 칩 DN 사들이 도서관 준비 (그림 2A)를 진행 하기 전에 측정할 수 있습니다. 완성 된 라이브러리 멀티플렉싱 및 NGS 적합 해야 ~ 200-600 bp 사이 고 어떤 뇌관 이합체 없는 (<strong class="xfi...

여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 종양 조직 및 암 세포주에서 조합 염색질 상태 패턴을 편견 없이 식별하는 것입니다. 이 방법은 불모의 히스톤 변형 상태가 종양 발생에 어떻게 기여할 수 있는지와 같은 암 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 히스톤 변형과 여러 샘플을 동시에 동시에 효율적으로 처리 할 수 있다는 것입니다.먼저, 멸균 면도날을 사용하여 흑색종 조직 50mg을 수동으로 해리하고 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 2mL를 해리합니다. 멸균 조직 배양 접시에서 약 5분 동안 조직을 3mm 또는 4mm 조각으로 다집니다. 조직 용액을 해리기 튜브로 옮기고 HBSS의 8밀리리터를 더 첨가합니다.균질화될 때까지 해리기(dissociator)를 사용하여 조직을 추가로 해리합니다. 다음으로, HBSS 3밀리리터당 16%포름알데히드 200마이크로리터를 첨가하여 조직을 가교합니다. 믹서를 사용하여 섭씨 37도에서 정확히 10분 동안 10rpm으로 혼합물을 흔듭니다.인큐베이터에서 샘플을 꺼낸 후 샘플 3ml당 200마이크로리터의 종양 글리신을 넣고 혼합물을 섭씨 37도에서 10rpm으로 5분 동안 흔듭니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 섭씨 4도에서 5분 동안 934배 g으로 샘플을 회전시킵니다. 완료되면 상층액을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS 5ml를 추가합니다.그런 다음 934 회 g에서 샘플을 다시 원심 분리 한 다음 상층액을 제거합니다. 조직 50mg당 프로테아제 억제제가 포함된 ChIP 수확 완충액 300마이크로리터를 추가하고 얼음에서 30분 동안 샘플을 용해합니다. 세포가 용해되는 동안 수조 교란기 및 관련 냉각 시스템을 켜고 온도가 섭씨 4도에 도달하도록 합니다.초음파 처리기 튜브를 수조 교란기에 넣고 30초 켜기 및 30초 끄기에서 60회 주기 동안 흑색종 조직을 초음파 처리하여 200-600 염기쌍의 염색질 단편을 얻습니다. 8mg의 흑색종 조직에 대해 튜브 리볼버를 사용하여 섭씨 4도에서 2시간 동안 20마이크로리터의 단백질 g 마그네틱 비드와 100마이크로리터의 결합 차단 버퍼와 함께 각 히스톤 항체 3마이크로그램을 배양합니다. 초음파 처리 후 ChIP 희석 완충액을 사용하여 샘플을 5 회 희석하여 SDS 농도를 0.1 %로 낮추십시오.항체 및 단백질 g 자성 비드의 배양이 완료된 후 ChIP 희석 완충액을 제거하고 240 마이크로 리터의 새로운 완충액에 비드를 다시 현탁시킵니다.그런 다음 20마이크로리터의 비드 분취량을 12개의 개별 튜브에 넣고 각 튜브는 별도의 조직 샘플에 사용됩니다. 초음파 처리 된 물질을 특정 항체가있는 단백질 g 비드에 균등하게 분취하고 튜브 리볼버를 사용하여 섭씨 4도에서 밤새 튜브를 회전시킵니다. 역 가교 결합 후 아침에 항체 단백질 용액을 96웰 플레이트로 옮기고 마그네틱 스탠드에 놓습니다.비드가 30초 이상 부착되도록 한 후 상층액을 제거합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 150마이크로리터의 얼음처럼 차가운 RIPA 세척 버퍼로 비드를 5회 세척합니다. 세척할 때마다 30초 동안 자석을 계속 움직인 다음 상등액을 제거합니다.세척 단계 후, 칩당 44마이크로리터의 직접 용출 버퍼, 1마이크로리터의 Rnase 및 5마이크로리터의 프로테나제 k를 포함하는 용리 완충액 마스터 믹스를 추가하고 역가교결합을 위해 샘플을 입력합니다. PCR 열 순환기를 사용하여 섭씨 37도에서 4시간, 섭씨 50도에서 4시간, 섭씨 65도에서 8-16시간 동안 샘플을 배양합니다. 다음 날 아침, 샘플을 자석에 다시 놓고 상층액을 아미노 침전 DNA가 포함된 새로운 96웰 PCR 플레이트로 옮깁니다.용액에 2.3 x 상자성 비드를 추가하고 다중 채널 피펫을 사용하여 조심스럽게 위아래로 25회 피펫팅합니다. 그런 다음 실온에서 4분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 자석에 다시 놓고 실온에서 4분 더 배양합니다.상등액을 버린 후 샘플에 70% 에탄올 150마이크로리터를 첨가하고 비드를 방해하지 않고 실온에서 30초 동안 배양합니다. 비드가 건조되도록 한 후 자석에서 샘플을 제거하고 30마이크로리터의 10밀리몰 트레이셜을 추가합니다. 피펫팅으로 25회 혼합합니다.실온에서 샘플을 배양한 후 자석에 다시 놓고 실온에서 4분 더 배양합니다. 라이브러리 준비를 위해 각 시료 20마이크로리터를 새로운 96웰 플레이트로 옮깁니다. PCR 증폭 후 샘플을 제거하고 핵이 없는 물을 사용하여 총 부피를 100마이크로리터로 가져옵니다.먼저 각 샘플에 55마이크로리터의 비드를 추가하고 피펫으로 25회 혼합하여 양면 상자성 크기 선택을 수행합니다. 그런 다음 실온에서 4분 동안 배양합니다. 샘플을 자석에 다시 놓고 실온에서 4분 더 배양하여 염기서열분석에 적합하지 않은 비드에 큰 단편을 얻습니다.배양 후 상층액을 새로운 96웰 PCR 플레이트로 옮깁니다. 또 다른 25마이크로리터의 상자성 비드를 추가하고 25회 피펫팅하여 혼합한 다음 자석을 꺼낸 후 실온에서 4분 동안 배양합니다. 실온에서 배양한 후 샘플을 자석에 다시 놓고 실온에서 4분 동안 배양합니다.그런 다음 상등액을 버리십시오. 샘플을 자석에 남겨둔 상태에서 150 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 넣고 비드를 방해하지 않고 실온에서 30 초 동안 배양합니다. 에탄올을 제거하고 세척을 반복하십시오.비드가 건조될 때까지 기다린 후 자석에서 샘플을 제거하고 10밀리몰 미량 pH 8.0 25마이크로리터를 추가합니다. 25회 피펫팅으로 혼합하고 실온에서 자석을 분리하여 4분 동안 배양합니다. 실온에서 배양한 후 샘플을 자석에 다시 놓고 실온에서 4분 동안 배양합니다.이제 멀티플렉싱하기 전에 고감도 DNA 전기표기법 기기를 사용하여 라이브러리를 정량화하여 크기가 염기서열분석에 적합한지 확인하십시오. 이 프로토콜은 동결된 종양 조직 및 세포주의 면역침전을 허용하며, 수십 개의 샘플에서 고처리량 방법을 사용하여 병렬로 수행할 수 있습니다. 염색질 단편은 최적의 면역침전을 위해 200개에서 1000개 사이의 염기쌍 범위여야 합니다.라이브러리 준비를 진행하기 전에 정제된 ChIP DNA를 정량화해야 합니다. 멀티플렉싱 및 차세대 염기서열분석에 적합한 완성된 라이브러리는 200 - 600개의 염기쌍 범위여야 하며 프라이머 이량체가 없어야 합니다. 사후 염기서열분석 시에는 macs peak calling 및 chromHmm 분석과 같은 파이프라인의 추가 단계를 진행하기 전에 충족해야 하는 많은 품질 관리 메트릭이 있습니다.ChIP 샘플은 입력 DNA에 대해 농축되어야 하며 각 히스톤 변형은 후성유전학적 지형의 특정 구성 요소를 나타내는 뚜렷한 프로필을 표시해야 합니다. 크롬 HMM 알고리즘은 다변량 숨겨진 마르코프 모델을 사용하여 연구된 히스톤 변형을 기반으로 가장 두드러진 반복 조합 및 공간 염색질 패턴을 식별합니다. 이러한 6가지 변형을 사용하여 크롬 HMM은 폴리콤 억제(polycomb repression), 이색적 억제(heterochromatic repression), 능동 전사(active transcription) 및 활성 인핸서(active enhancers)와 같은 억제 영역과 활성 도메인을 모두 나타내는 기능적으로 구별되는 염색질 상태를 식별합니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행된다면 3-4일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 라이브러리 준비 및 데이터 분석을 계속하기 전에 항체에 대한 최적의 초음파 처리 조건과 사양을 결정하는 것이 중요합니다. 이 절차를 학습하기 위해 RRS 염기서열분석 및 염색체 확인 캡처와 같은 다른 방법을 수행하여 유전자 발현 및 더 높은 염색질 구조를 가진 염색질 상태 부분의 연합을 결정할 수 있습니다.실험 후, 이 기술은 암 후성유전학 분야의 연구자들이 환자 종양 샘플에서 염색질 상태 패턴을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 종양 조직을 처리 및 분리하는 방법, 염색질 면역침전을 수행하는 방법, 차세대 염기서열분석을 위한 라이브러리를 준비하는 방법, 염기서열분석 후 데이터를 처리하는 방법, 다운스트림 분석의 초기 단계에 대한 통찰력을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 포름알데히드로 작업할 때 포름알데히드는 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행할 때 항상 적절한 흄 후드와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

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Cancer Research

암 연구

이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)에 의한 염색질 상호 작용 분석을위한...

염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

여기서 전례 처리량 DNA 손상 혜성 분석 검출 할 수있는 플랫폼을 설명한다. 장치 패턴 마이크로 어레이에 포유 동물 세포와는 96 샘플의 병렬 처리를 할 수 있습니다. 접근법은 기본 레벨 DNA 손상, 노출 유도 DNA 손상 및 DNA 수선의 동력학 분석을 용이하게한다.

CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

종양학 검체의 차세대 표적 염기서열분석을 위한 통합 시스템에 대해 설명합니다. 이 크로스 플랫폼 시스템은 저품질 및 소량 종양 생검에 최적화되어 있고, 낮은 DNA 입력을 수용하며, 잘 특성화된 다중 변이 대조군을 포함하고, 정량적 사전 분석 품질 관리 측정에 의해 정보를 얻은 새로운 변이 호출자를 특징으로 합니다.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

이 논문은 ChIP 액체 처리기 플랫폼을 사용하여 특정 히스톤 수정(H3K27ac)과 관련된 DNA 영역의 반자동 마이크로스케일드 ChIP-Seq 프로토콜을 설명하고 태그를 사용하여 라이브러리 준비를 수행합니다. 이 절차는 품질 및 수량 목적에 대한 제어 평가를 포함하고 다른 히스톤 수정 또는 전사 요인에 채택 될 수있다.

대규모 후생유전학 연구를 위한 반자동 ChIP-Seq 절차

ATAC-seq는 과민성 돌연변이 트랜스포자제 Tn5를 사용하여 전사 인자에 의해 매개되는 염색질 접근성의 변화를 매핑하는 DNA 시퀀싱 방법입니다. ATAC-seq는 암세포의 표현형 변화의 기초가되는 분자 메커니즘의 발견을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 암세포를 포함한 상피 세포 유형에서 ATAC-seq에 대한 최적화 절차를 간략하게 설명합니다.

암 후성유전학 연구를 위한 ATAC-Seq 최적화

유전자 발현은 유전자 프로모터와 원위 조절 요소의 상호작용에 의해 조절된다. 여기서는 낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 통해 이전에는 측정할 수 없었던 희귀 세포 유형에서 이러한 상호 작용을 식별할 수 있는 방법을 설명합니다.

희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 구조를 연구하기 위한 통합 워크플로우An Integrated Workflow to Study the promoter-centic spatio-temporal genome architecture in Scarce Cell Populations

순환 종양 세포(CTC)는 암 진행 및 전이 연구에 매우 중요합니다. 이 기사에서는 CTC 농축 및 단일 CTC 시퀀싱을 위한 고처리량 통합 프로토콜을 제시하여 포획 효율성과 CTC 순도를 개선하는 동시에 오염 및 시퀀싱 비용을 줄여 정밀 종양학 연구 및 임상 응용을 발전시킵니다.

미세유체공학 기반 고처리량 순환 종양 세포 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술

뉴클레아제를 이용한 최적화된 표적 하 절단 및 방출 후 차세대 시퀀싱(CUT&amp;RUN-seq) 프로토콜이 신경내분비 소세포암 세포주에 대해 기술되었습니다. 이 기술은 다양한 히스톤 변형과 전사인자(예: E2F7) 결합 부위의 유전체 매핑을 가능하게 하여 SCLC 병리생물학에서 후생유전학 및 전사 탈조절을 조사할 수 있게 합니다.

CUT&amp;RUN을 이용한 신경내분비 소세포폐암 세포주에서 히스톤 변형 및 전사인자 결합 부위의 전면 지도 작성

배우세요 고처리량 ChIP-시퀀싱을 활용한 종양 조직의 크로마틴 상태 패턴 분석 방법. 이 기술은 다중 히스톤 변형을 동시에 효율적으로 처리하여 암 표유전학 연구에 활용됩니다.

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

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