Name: 헬리코박터 감염과 위 Pathologies의 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 학습하세요 Helicobacter pylori 감염 마우스 모델을 통해 위염증과 암 발생 메커니즘을 연구하는 방법을. 조직병리학 분석과 세균 접종 기술을 활용하여 위장병학 및 미생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자 양 A. 드 바울은 양 조지 레이-맥 캔 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 저자는 시설의 사용 및 기술 지원의 모나 쉬 조직학 플랫폼, 부의 해부학과 발달 생물학, 모나 쉬 대학 인정합니다. 실험실은 RLF (APP1079930, APP1107930)는 국민 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC)에서 자금에 의해 지원 됩니다. RLF는 NHMRC (APP1079904)에서 수석 연구 장학금에 의해 지원 됩니다. KD와 MC 둘 다 모나 쉬 대학원 장학금에 의해 지원 됩니다. KD는 또한 지원 센터에 의해 타고 난 면제 및 전염 성 질병, 허드슨 연구소, 의료 연구의 MC는의 학부, 간호 및 건강 과학, 모나 쉬 대학에서 국제 대학원 장학금. 연구에는 허드슨 연구소의 의학 연구는 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램에 의해 지원 됩니다.

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저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서는 헬리코박터 감염에 대 한 vivo에서 마우스 모델의 사용을 설명합니다. 절차의 중요 한 단계는: 1) 포함 하는 실용적이 고 운동 박테리아; Helicobacter inocula의 준비 2) intragastric gavage;를 통해 마우스를 박테리아의 적절 한 숫자의 배달 3) 식민지 계산 및/또는 PCR; 세균 감염의 탐지 그리고 4) 위 조직의 활성화에 histopathology 평가 처리 위장 감염. 수정, 문제 해결 및 기술 고려 사항에 대 한 추가 제안 아래 설명 되어 있습니다.
혈액 한 천 자료 2 말 혈액 보충을 사용 하 여 헬리코박터 종 성장의 방법은 우리의 실험실에서 잘 설립 되었습니다. 그러나, 대체 한 기지와 같은 세라 한과 컬럼비아 혈액 한 천 사용된22에 영향을 수도 있습니다. 만 메 마른 유리 세제 무료 성장 매체를 준비 하는 ...

헬리코박터 파일로리 감염률 801순서 것으로 추정 하는 개발 도상국에서와 전 세계에 걸쳐 나선형 모양, 그람 음성, 인간의 위 병원 체 모든 인구에 이다. 하지만 대부분 헬리코박터-감염 된 개인은 무 증상, 일부 더 심각한 질병, 소화 궤에서 위 암2까지 개발. 헬리코박터-관련된 암은 상피 세포 (GECs)의 악성 변화에 의해 또는 형성에 의해 여분 꾸벅꾸벅 졸 기 림프 조직 위장, 위 선 암에 결과 또는 점 막 관련 림프 광범위 하 게 특징 이다 림프 조직 (맥 아), 각각. 헬리코박터 는 매우 다양 한 독성 요인 및 준수, 성장과이 틈새 시장에서 신진 대사를 촉진 하는 메커니즘의 존재로 인해 위장의 가혹한 생태 틈새에서 살아남기 위해 적응 된다. 특히 헬리코박터 의 악성 긴장 보유 40 kb cag 인코딩하는 유형 4 분 비 시스템 (T4SS)3,4의 생산에 필요한 약 30 유전자 Pathogenicity 섬 (cag파이) . cag 파이-긍정적인 헬리코박터 긴장의 위 선 암5필수적인 전조로 연루 되어 호스트에 만성 염증의 높은 수준의 유도와 관련 된.
Vivo에서 동물 모델, 특히 쥐, 되었다 매우 유익한 호스트, 헬리코박터 감염 및 질병 결과6세균성과 환경 요인의 상대적 기여를 조사 연구 함으로써. 학문은 그 연장 헬리코박터 설명 했다 이전에 개발에 만성 위 염과 동맥의 결과 유전 배경 C57BL/6 쥐의 감염 위축, 헬리코박터 감염7의 두 특징. 또한, 감염 관련된 고양이/개 세균 종, H. felis, 비슷한 병 리 및 질병 진행 인간의 맥 아 림프 종8,9에서 보듯이 쥐 몰 트 형성을 유도 하기 위해 표시 되었습니다. 가장 일반적으로 사용 하는 헬리코박터 파일로리 마우스 식민지 연구에 격리 "시드니 스트레인 1"은 (SS1) 스트레인10, cag파이+ 하지만 비 기능 T4SS (T4SS−)11. 다른 널리 사용 되는 긴장 포함 헬리코박터 B128 7.13 (cag파이+/T4SS+)12 과 X47 2AL (cag파이-/T4SS−)13. H. felis 감염, CS1 스트레인에 대 한 ("고양이 나선형 1", cag파이-/T4SS−)는 일반적으로 사용 된14.
여기, vivo에서 감염에 대 한 Helicobacter inocula, 쥐의 intragastric gavage 절차 histopathological 변경의 연구에 대 한 조직의 처리 방법의 준비를 설명 하는 프로토콜 제공 에 위. 특히,이 기사 세균성 식민을 시각화 하 고 감염 된 쥐의 위 점 막에서 몰 트 형성을 포함 한 histopathological 변화를 평가 하는 데 사용 하는 조직학 방법에 초점. 여기 설명 하는 방법 중 일부 미 등 다른 용기 병원 균의 연구에 적용할 수 있습니다. Typhimurium 또는 C. rodentium.

<table><tbody><tr><td>Bacteriological reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxoid Blood Agar Base No.2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CM0271B</td><td>살균 전에 탈이온화된 물에 용해</td></tr><tr><td>프리미엄 제세마 혈액</td><td>Australian Ethical Biologicals</td><td>PDHB100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion Broth</td><td>BD Bioscience</td><td>237500</td><td>살균 전에 탈이온화된 물에 용해</td></tr><tr><td>CampyGen 가스 팩</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CN0035A/CN0025A</td><td></td></tr><tr><td>Histological reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalin, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Absolute alcohol, 100% Denatured</td><td>ChemSupply</td><td>AL048-20L-P</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올(2-프로판올)</td><td>Merck</td><td>100995</td><td></td></tr><tr><td>Xylene(무황)</td><td>ChemSupply</td><td>XT003-20L</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's Haematoxylin</td><td>Amber Scientific</td><td>MH-1L</td><td>필터 사용 전</td></tr><tr><td>Eosin, 수성 염색</td><td>Amber Scientific</td><td>EOCA-1L</td><td>필터 사용 전</td></tr><tr><td>Wright-Giemsa Stain, modified</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WG80-2.5L</td><td>사용 전 희석(Giemsa 20%, 탈이온수 80%)</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Grale Scientific</td><td>11031/5</td><td></td></tr><tr><td>DPX 마운팅 매체</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>Molecular biology reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>이 연구에서 사용된 ureB 프라이머의 어닐링 온도는 61°C입니다. C</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>키트에는 10x PCR 완충액 및 염화마그네슘</td></tr><tr><td>dNTP가 포함되어 있습니다.</td><td>Bioline</td><td>BIO-39028</td>은 <td>사용 전 멸균 뉴클레아제가 없는 물에서 10mM로 희석</td></tr>합니다. <tr><td>분자 등급 Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>탄산수소</td>나트륨 <td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td><td>A475-500G</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트</td><td>Chem-Supply</td><td>MA048-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2002-1G</td><td>탈이온수에 용해</td></tr><tr><td>Polymyxin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4932-5MU</td><td>탈이온수에 용해</td></tr><tr><td>Trimethoprim (&ge; 98% HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7883</td><td>100%(절대) 에탄올</td></tr><tr><td>암포테리신</td><td>Amresco (Astral Scientific)</td><td>E437-100MG</td><td>탈이온수에 용해</td></tr><tr><td>Bacillus licheniformis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0125</td><td>탈이온수에 용해</td></tr><tr><td>Naladixic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878</td><td>탈이온수에 용해</td></tr><tr><td>기타 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methoxyflurane (Pentrhox)</td><td>Medical Developments International</td><td>해당</td><td></td>없음</tr><tr><td>파라핀 왁스</td><td>Paraplast Plus, Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>장비 및 플라스틱 제품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxoid 혐기성 항아리</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>HP0011/HP0031</td><td></td></tr><tr><td>COPAN 파스퇴르 피펫</td><td>Interpath Services</td><td>200CS01</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R 원심분리기</td><td></td><td></td><td>2,200 rpm에서 4°F에서 10분 동안 원심분리로 세균 펠릿 수집; C</td></tr><tr><td>23 g 정밀 글라이드 바늘</td><td>BD Bioscience</td><td>301805</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis, VWR</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Portex 세밀 보어 폴리에틸렌 튜빙</td><td>Smiths Medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 급식 카테터</td><td>Instech&nbsp; Laboratories</td><td>FTP20-30</td><td></td></tr><tr><td>1 mL tuberculin luer slip 일회용 주사기</td><td>BD Bioscience</td><td>302100</td><td></td></tr><tr><td>1.2 - 2 mL 튜브용 Eppendorf micropestle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z317314</td><td>위 균질화에 사용되는 오토클레이브 폴리프로필렌 유봉</td></tr><tr><td>GentleMACs Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>마우스 위 조직에 사전 설정된 gentleMACS 프로그램 사용</td></tr><tr><td>M 튜브 (주황색 캡)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 형광계</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>멸균 플라스틱 루프</td><td>LabServ</td><td>LBSLP7202</td><td></td></tr><tr><td>냉각판, Leica EG1160 임베딩 시스템</td><td>Leica Biosystems</td><td>해당</td><td></td>없음</tr><tr><td>Tissue-Tek Base Mold System, Base Mold 38 x 25 x 6</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4124</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek III Uni-Casette 시스템</td><td>사쿠라, Alphen aan den Rijn</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>Microtome, Leica RM2235</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Charged SuperFrost Plus 유리 슬라이드</td><td>Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

헬리코박터 감염과 위 pathologies의 마우스 모델

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

헬리코박터 파일로리 는 세계 인구의 절반에 사망률 및 인 간에 있는 사망률의 중요 한 원인이 위 병원 체 이다. 여러 마우스 모델 위 헬리코박터 감염의 분자 및 세포 메커니즘에 의하여 헬리코박터 박테리아 인간의 호스트의 위 식민지와 원인 질환 연구 개발 되었습니다. 여기, 우리는 프로토콜을 설명: 1) 세균성 정지 intragastric gavage; 통해 쥐의 비보에 감염에 대 한 준비 2) 연쇄 반응 (PCR)와 가능한 계산;에 의해 마우스 위 조직, 세균성 식민 수준을 결정합니다 그리고 3) 조직학 병리학 변화 평가. 설정 하려면 Helicobact어 쥐에 감염, 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 먼저 정지 (≥105 식민지 형성 단위, CFUs를 포함 하는) 중 헬리코박터 파일로리 의 마우스 식민지 긴장의와 주사는 또는 다른 위 Helicobacter 종 동물에서와 같은 헬리코박터 felis. 적절 한 시간-포인트 후 감염에서 위장 excised 고 해 부 sagittally 2 개의 동등한 조직 파편으로 동굴 및 본문 영역을 구성 하는 각각. 다른 조직학 처리를 거쳐야 하는 동안 이러한 조각 중 하나는 가능한 계산 또는 DNA 추출에 사용 됩니다. 세균성 식민과 뱃속에 histopathological 변경 Warthin-별이 빛나는, Giemsa 또는 Haematoxylin 및 오신 (H & E) 얼룩으로, 적절 한으로 얼룩진 위 조직 단면도에 정기적으로 평가 될 수 있습니다. 추가 면역 분석 또한 immunohistochemistry 또는 면역 형광 마우스 위 조직 단면도에 의해 이루어져야 수 있습니다. 아래에 설명 된 프로토콜으로 인간 관련 헬리코박터 에 닮은 위 pathologies의 쥐에 있는 평가 수 있도록 설계 된 질병, 염증, 선 위축 및 림프 여 포 형성을 포함 하 여. Inoculum 준비 및 intragastric gavage 프로토콜 쥐, 살 모 넬 라 Typhimurium 등 Citrobacter rodentium식민지 다른 장의 인간 병원 체의 병 인 연구에 적응 될 수 있습니다.

이 프로토콜 murine 마우스 모델 (그림 1) 헬리코박터 와 H. felis intragastric 감염을 달성 하는 구강 기법을 설명 합니다. 안락사, 다음 위장은 제거, 무게와 동굴, 몸과 위 조직 (그림 2)의 선 비 영역을 구성 하는 2 동등한 반으로 나누어. 선 비 지역 어떤 분석을 수행 하기 전에 제거 됩니다.
동물의 성공적인 식민지는 일반적으로 헬리코박터에 가능한 계산을 수행 하 여 확인-위 homogenates, 감염 하 고 이후에 HBA 접시 (그림 3)에 개별 식민지를 열거. 또는, PCR H. felis H. felis 와 H. pylori ureB 유전자 (그림 4...

마우스 감염 및 위장 미생물으로 인 한 질병 연구에 귀중 한 비보에 모델을 나타냅니다. 여기, 세균성 식민과 헬리코박터 파일로리의 마우스 모델에서 histopathological 변화를 공부 하는 데 사용 하는 방법 설명-관련 질병.

헬리코박터 감염과 위 Pathologies의 마우스 모델

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

이 방법은 미생물의 구성원, 특히 헬리코박터 속의 영향, 염증 및 암에 대한 위장학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 헬리코박터 감염의 연구와 생리적 조건 하에서 위장에 미치는 영향을 허용한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 헬리코박터 감염또는 항생제, 약물 또는 백신을 포함한 그 결과를 예방하거나 제거하기 위한 치료법의 개발로 확장됩니다.이 방법은 헬리코박터 감염의 병인에 특정 통찰력을 제공합니다. 그러나, 몇몇 기술은 그밖 위장 병원체의 연구 결과에 적응될 수 있습니다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 은 마우스에 감염을 확립 할 수있는 세균 성 무분비의 준비와 투쟁 할 것이다.헬리코박터 분리는 시험관 내에서 광범위한 하위 문화를 겪지 않은 마우스 식민지 균주로 알려져 있습니다. 또한 이러한 균주에 대한 체외 하위 배양 횟수를 기록해야 합니다. 세균 현탁액을 15 밀리리터 폴리스티렌 튜브에 추가하고 플라스틱 루프를 사용하여 각 배양에서 개별 유리 현미경 슬라이드로 10-20 마이크로 리터 방울 하나를 전송합니다.그런 다음, 100배 배율로 위상 대비 현미경 검사에서 박테리아의 생존력과 운동성을 평가한다. 대부분의 박테리아가 간균 모양을 가지고 있는 경우에만 H.pylori inocula를 사용하십시오. H.felis inocula는 주로 헬리칼 모양의 박테리아를 포함해야 합니다.그리고 개별, 일회용, 1 밀리리터 주사기에 이노큘러를로드합니다. 각 주사기를 23게이지 바늘로 장착하고 플라스틱 파라핀 필름을 사용하여 일회용 폴리에틸렌 카테터를 각 바늘에 부착합니다. 다음으로, 목과 꼬리의 스크러프에 의해 6-8주 된 특정 병원체 및 헬리코박터가 없는 마우스를 수동으로 억제하고, 열린 턱의 중앙에 카테터 1개를 삽입한다.카테터를 식도쪽으로 코테터를 안내하여 마우스의 목을 확장하여 식도를 통해 위장에 쉽게 접근할 수 있도록 하고 카테터의 대부분 또는 전부가 더 이상 보이지 않고 저항이 느껴질 때까지 기관으로부터 멀리 떨어진 곳에 있습니다. 그런 다음 최적의 식민지화 및 질병 병리학을 보장하기 위해 다섯 번째 박테리아에 적어도 10 번 10 번 전달합니다. 실험이 끝나면 미세하고 구부러진 가위를 사용하여 위장의 절제를 위해 복강을 엽니다.더 큰 곡률을 따라 위를 자르고, 잔류 식품을 제거하기 위해 세척당 신선한 PBS의 50 밀리리터 튜브 1개로 장기를 두 번 부드럽게

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

헬리코박터 감염과 위 병리학의 마우스 모델

이 비디오는 마우스 모델에서 위내 배절 기술을 통한 헬리코박터 파일로리 감염의 확립을 보여줍니다. 세균 현탁액은 입을 통해 위장으로 삽입되는 카테터를 통해 투여됩니다. 접종된 박테리아는 위에 군집하여 감염을 일으키며, 이는 숙주-병원체 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

생쥐의 헬리코박터 감염 통제를 위한 위내 배기(Intragastric Gavage) 기법

이 비디오에서는 감염 후 생쥐의 위 조직에서 헬리코박터 파일로리 부하를 정량화하여 집락화를 확인하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

감염된 쥐 위장에서 헬리코박터 파일로리 부하의 정량화

이 동영상은 위 병원균인 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)를 오가노이드 내강에 미세주입하여 위 오가노이드 감염 모델을 확립하는 방법을 보여줍니다. 이 모델은 위 세포의 감염으로 인한 변화를 연구하는 데 도움이 됩니다.

Establishing an Infection Model Through Infection Model Through Microinjection of Gastric Organoids with Pathogenic Bacteria(위 오가노이드와 병원성 세균의 미세주입을 통한 감염 모델 구축)

Citrobacter rodentium 감염이 장의 세균 감염을 공부뿐만 아니라 마우스의 면역 반응 및 대장염를 개최 할 수있는 중요한 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 장벽 무결성, 병원체 부하와 손쥐 전염성 대장염에 대한 병원체 및 호스트 공헌의 철저한 특성을 허용하는 조직 학적 손상의 측정을 설명합니다.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; 마우스 모델 : 감염성 대장염에 대한 공부 병원체 및 호스트 기부

여기에서는 Cag Type IV 분비 시스템(Cag-T4SS)으로 알려진 발암성 박테리아 소기관을 시각화하는 방법을 설명합니다.  우리는 Cag-T4SS가 다양한 철 가용성 조건에 반응하여 H. pylori의 표면에서 차등적으로 생성된다는 것을 발견했습니다.

고해상도 전자 현미경 헬리코박터 파이로리 CAG 유형 IV 분비 시스템 필리

이 기사는 생쥐를 이용한 위식도 역류의 수술 절차를 보여줍니다. 이러한 모델은 위식도 역류 질환 및 잠재적으로 배럿 식도 및 식도암 연구의 메커니즘 및 치료법에 유용한 도구입니다.

마우스와 위식도 역류의 외과 모델

줄기세포 유래 배양은 감염병을 모델링할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 여기에서는 성체 줄기 세포에서 유래한 마우스 및 인간 위 오가노이드의 배양에 대해 설명합니다. 오가노이드에는 위 병원균인 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)가 미세주입됩니다.

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

본 연구에서는 이전 내시경 생검을 통해 위 저등급 상피내 종양으로 진단된 환자를 체계적으로 평가하고, 내시경 점막하 박리술(ESD)로 병변을 완전히 절제하여 병리학적 진단을 도출하여 병리학적 악화 위험을 증가시킬 수 있는 요인을 분석하였다.

위 저등급 상피내 종양의 병리학적 에스컬레이션을 위한 위험 예측 모델 구축 및 평가

이 프로토콜은 원래 쥐 장을 위해 개발된 '스위스 롤' 기법을 수정한 전체 위 면역염색법을 개략적으로 설명합니다.

수정된 스위스 롤 기법을 이용한 생쥐 위근층의 향상된 공간 지도 작성

학습하세요 Helicobacter pylori 감염 마우스 모델을 통해 위염증과 암 발생 메커니즘을 연구하는 방법을. 조직병리학 분석과 세균 접종 기술을 활용하여 위장병학 및 미생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

헬리코박터 감염과 위 Pathologies의 마우스 모델

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