정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 '황금' 형광 및 질량 분석 및 형광 단백질 분석 엔지니어링

이 실험의 목표는 새로운 금 형광 단백질을 생산하기 위해 선택적 압력 통합에 의한 재조합 단백질 생산을 위해 표준 아미노산을 비표준 아미노산으로 대체하는 것입니다. 선택적 압력 통합 방법은 새로운 화학적 특징을 가진 단백질을 생산하기 위한 것입니다. 이는 단백질 기능을 이해하거나 엔지니어링하려고 할 때 특히 유용합니다.

이 기술의 주요 장점은 일반적인 재조합 단백질 생산과 유사하기 때문에 수행이 비교적 간단하다는 것입니다. 시간 및 파장 상관 형광은 변형된 단백질의 여기 상태 역학을 조사하는 데 도움이 되며, 이를 통해 발색단에 도입된 비표준 아미노산이 광학적 특성에 미치는 영향을 더 쉽게 이해할 수 있습니다. SPI는 원칙적으로 보조영양 균주 및 화학적으로 정의된 배지를 사용할 수 있는 모든 단백질 생산 환경에 적용할 수 있습니다.

여기에는 다른 박테리아 균주와 포유류 세포 배양도 포함됩니다. 발현 조건의 타이밍과 설정은 변형되지 않은 야생형 단백질의 생성을 억제하는 것이 필수적이기 때문에 매우 중요합니다. 그렇기 때문에 온도, 유도 시간 또는 배양 매체의 조성과 같은 특정 매개변수를 최적화해야 합니다.

우리는 셀레노메티오닌과 같은 메틸 함유 아미노산을 함유한 단백질 추출물에 대한 초기 연구 후에 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 학생인 Almut Pelzer입니다. 이 절차를 시작하려면 트립토판 보조영양 E.coli 세포를 ECFP에 대한 플라스미드 발현으로 형질전환시킵니다.

단일 콜로니를 사용하여 배양 튜브에 암피실린이 보충된 5ml LB 배지의 배양 전을 접종합니다. 섭씨 37도, 200rpm에서 밤새 배양합니다. 다음날, 1리터의 삼각 플라스크에 1ml의 야간 배양을 사용하여 100ml의 보충된 NMM19 배지를 접종합니다.

그런 다음 200rpm 및 섭씨 30도의 궤도 셰이커에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 30분 동안 값이 0.05 미만으로 변할 때까지 30분마다 600나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 다음으로, 세균성 세포를 수확하기 위하여 5, 000 시간 g 및 4 섭씨 온도에 10 분 동안 배양물을 원심 분리하십시오.

디캔팅으로 상등액을 버립니다. 암피실린이 보충된 NMM19 배지에 세포를 총 부피 100ml까지 재현탁합니다. 이 현탁액을 동일한 삼각 플라스크로 다시 옮깁니다.

4-아미노-인돌을 최종 농도 1밀리몰에 추가합니다. 오비탈 셰이커에서 섭씨 30도, 200rpm에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후 IPTG를 배양액에 최종 농도 0.5 millimolar로 첨가하여 표적 유전자 발현을 유도합니다.

섭씨 30도 및 200rpm의 오비탈 쉐이커에서 밤새 배양합니다. 다음날, 10 분 동안 5, 000 시간 g 및 4 섭씨 온도에 원심 분리해서 세균성 세포를 추수하십시오. 디캔팅으로 상등액을 버립니다.

표적 단백질 정제를 수행할 준비가 될 때까지 세포 펠릿을 섭씨 영하 20도 또는 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 박테리아 세포 용해물을 준비합니다. 제조업체의 지침에 따라 크로마토그래피 컬럼을 준비한 후 결합 버퍼를 사용하여 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼을 평형화합니다.

완료될 때까지 컬럼에 용해물을 로드합니다. 크로마토그래피 수지에 결합된 금색 단백질에 주목하십시오. 결합 버퍼로 컬럼을 세척합니다.

그런 다음 용리 완충액을 사용하여 표적 단백질을 용리합니다. 금 형광 단백질을 포함하는 용리된 분획을 수집하고 풀링하며, 이는 눈에 보이는 황금색으로 식별할 수 있습니다. 그 후, 제조업체의 지침에 따라 5, 000 및 10, 000 사이의 분자량 컷오프를 가진 투석 멤브레인을 준비하십시오.

최소 2시간 동안 100ml의 완충액에 1ml의 시료를 투석합니다. 시작하려면 MS 버퍼를 사용하여 단백질 샘플을 밀리리터당 0.1mg으로 희석하여 최종 부피가 80마이크로리터가 되도록 합니다. 피펫을 조심스럽게 섞습니다.

용액을 유리 인서트가 있는 MS 자동시료주입기 바이알로 옮기고 뚜껑으로 닫습니다. 바이알을 튕겨 기포를 제거합니다. 다음으로, 두 번째 바이알에 MS 버퍼가 포함된 블랭크를 준비합니다.

두 바이알을 HPLC 자동시료주입기에 넣습니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 MS 기기를 준비하고 보정합니다. 전기 분무 이온화, 비행 시간 질량 분석법과 결합된 고성능 액체 크로마토그래피를 위해 자동 시료 주입 부피를 5마이크로리터로 설정합니다.

빈 실행에 대한 작업 목록을 만든 다음 GdFP 샘플 실행을 만듭니다. 주입 부피, 해당 자동 시료 주입기 바이알 위치를 할당하고 작업 목록을 실행합니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시간 및 파장 상관 단일 광자 계수를 위해 금 형광 단백질 용액과 검출기를 준비합니다.

단 하나 광자 세는 소프트웨어를 사용하여, 대략 10, 000의 조사가 형광 붕괴 곡선의 취득 최대에서 누적될 때까지 대략 200, 초당 000 광양자의 세는 비율로 형광 방출을 취득하십시오. 그런 다음 샘플 큐벳을 PBS 완충액에 콜로이드 실리카로 채워진 1cm 석영 큐벳으로 교체합니다. 레이저 필터를 꺼내고 검출기의 중앙 채널에서 470나노미터 광자를 획득하기 위해 격자를 조정합니다.

그런 다음 방출 최대값에서 약 10, 000 카운트가 누적될 때까지 기기 응답 함수를 획득합니다. 텍스트 프로토콜에 요약된 대로 결과 데이터를 변환, 피팅 및 플롯하여 방출 파장에 대한 형광 감쇠 시간의 의존성을 나타내는 감쇠 관련 스펙트럼을 얻습니다. 이 연구에서는 질량 분석법을 사용하여 금 형광 단백질이라고 하는 스펙트럼 적색 편이 녹색 형광 단백질 유형 형광 변이체가 성공적으로 생성되는지 확인합니다.

야생형 ECFP는 발색단 성숙 후 28, 283.9 달톤의 단백질 질량을 계산하지만 금 형광 단백질의 해당 질량은 28, 313.9 달톤입니다. 금 형광 단백질의 디콘볼루션된 ESI-MS 스펙트럼은 약 28, 314.1 달톤에서 주질량 피크를 나타내며, 이는 이론적 값에서 10ppm 미만으로 벗어납니다. 이것은 선택적 압력 통합에 의한 비표준 아미노산의 통합을 확인합니다.

ECFP의 흡수 스펙트럼은 434나노미터와 452나노미터에서 두 가지 특성 최대값을 갖습니다. 대조적으로, 금 형광 단백질은 최대 466 나노 미터의 하나의 넓은 적색 편이 흡수 띠를 특징으로합니다. EGFP의 최대 흡수는 488 나노미터로 더욱 적색편이되지만, 금 형광 단백질의 형광 방출 스펙트럼과 GdFP의 해당 스톡스 이동은 Aequorea victoria 녹색 형광 단백질의 모든 유도체 중 가장 적색편이가 있음을 의미합니다.

단일 광자 계수로 모니터링되는 시간 분해 형광 방출이 여기에 나와 있습니다. 붕괴 곡선은 550 나노미터보다 600 나노미터에서 약간 더 빠른 형광 감소를 나타냅니다. 금 형광 단백질의 형광 방출은 pH에 크게 의존하며, 이는 많은 녹색 형광 단백질 변이체에서 일반적으로 발생합니다.

여기에서 볼 수 있듯이 낮은 pH에서 형광이 뚜렷하게 감소하지만 스펙트럼 특성은 일정하게 유지됩니다. 이 기술을 완전히 익히면 형질전환된 박테리아 세포의 콜로니 또는 동결된 글리세롤 스톡에서 시작할 때 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 표적 아미노산이 고갈되었는지 확인하는 것이 중요합니다.

ncAA는 세포에 흡수되어야 하고, 생체 적합성이 있어야 하며, 선택한 보조 영양 균주에 의해 단백질에 통합되어야 합니다. 이 절차에 따라 엔지니어링 목적으로 다양한 단백질을 생성할 수 있습니다. 단백질 안정성 분석기와 같은 표적 단백질 분석법에 따라 효소 활성 분석법, 형광 분광법 또는 단백질 결정화를 사용하여 비표준 아미노산이 기능적 및 구조적 특성에 미치는 영향을 설명할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 합성 생물학 분야에서 매우 유용한 것으로 입증되어 새로운 자연 단백질과 단백질체를 제공했습니다. 이것은 단백질 공학을 위한 화학적 용량을 확장합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 선택적 압력 통합에 의해 비표준 아미노산을 재조합 단백질에 통합하는 방법, 질량 분석법으로 인공 아미노산의 도입을 확인하는 방법, 시간 분해 형광으로 형광 단백질을 분석하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다.