Name: 생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 배우세요 Sf9 세포 배양에서 바큘로바이러스를 생산하고 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정화한 후 초원심 분리로 농축하는 방법을. 이 기술은 유전자 치료 및 백신 개발 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 시작 자금 신시내티 어린이 연구 재단 (CCRF)에서 M.N. 및 혁신적인 코어 그랜트 (ICG)에서 국립 보건원의 변환 과학 발전을 위한 국가 센터에 의해 지원에 의해 부분적으로 지원 보너스 번호 UL1 TR001425입니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

프로토콜 요약을 그림 1 을 참조 하십시오.
1입니다. 잠재 플라스 미드 DNA의 정화
<ol><li>Baculoviral 플라스 미드 DNA (bacmid)14 파운드 항생제; 국물의 200 ml에서를 포함 하는 세균성 문화를 성장 대 (50 µ g/mL), 항생물질 (10 µ g/mL), 그리고 gentamycin (7 µ g/mL), 300 rpm에서 궤도 통 설정에서 37 ° C에서 16 h.</li>
	<li>표준 알칼리 성 세포의 용 해 프로토콜15를 사용 하 여 세균성 문화에서 bacmid DNA를 정화 하 고 해산 테 버퍼에 bacmid.</li>
</ol>2입니다. 잠재 생산
<ol><li>135 rpm와 폴 리 카보 네이트 혈 청-무료 곤충 배양1,2,3를 포함 하는 삼각 플라스 크에에서 28 ° C에서 궤도 흔드는 인큐베이터에 문화 Sf9 셀. 참고: Sf9 세포는 냉동된 재고에서 동 하는 경우 최소 2 주 회복 하 고 성장의 지 수 단계를 입력 셀에 대 한 수 있습니다.</li>
	<li>Trypan 파랑 얼룩 후 한 hemocytometer 성장 지 수 단계에서 수확 Sf9 셀을 계산 합니다. 씨앗 1 x 106 가능한 Sf9 셀 중간의 2 개 mL 6 잘 조직 문화 취급 접시에 잘 당. 셀 인큐베이터에서 28 ° C에서 1 시간에 대 한 연결을 허용 합니다.</li>
	<li>혈 청 무료 unsupplemented 그레이스의 곤충 문화 매체의 1 mL에 성장 매체를 바꿉니다.</li>
	<li>곤충 세포 transfection 시 약을 사용 하 여 Sf9 세포로 DNA bacmid transfect<ol>
<li>그레이스의 곤충 매체의 100 µ L 혼합 8 µ L 곤충 세포 transfection 시</li>
		<li>Bacmid DNA unsupplemented 곤충 매체의 100 µ L로의 2 µ g을 희석 하 고 vortexing에 의해 부드럽게 혼합.</li>
		<li>희석된 곤충 세포 transfection 시 약 희석된 DNA를 결합 하 고 부드럽게 혼합. 실 온에서 15 ~ 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>셀에 dropwise DNA 지질 혼합물을 추가 합니다. 약 5 h 인큐베이터에서 28 ° C에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀에서 transfection 혼합물을 제거 하 고 세척 2 mL PBS의 셀.</li>
	<li>곤충 문화 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 미디어를 변경 하지 않고 문화 인큐베이터에서 28 ° C에서 진행 합니다. 참고: 경우는 bacmid 형광 단백질을 포함, 그 식 셀 48 h 후 transfection에 검색할 수 있습니다. 잠재 transfected Sf9 세포에 의해 생산 이며 문화 매체는 이후 untransfected 세포를 감염으로 분 비 합니다. 전체 셀 인구 5 일에 잠재 감염 되 고 cytopathic 효과 라고도 하는 바이러스 성 감염의 흔적을 보여줍니다. 이러한 증가 세포 직경, 그들/과 립 세포질, 세포 성장 정지에 죽거나 lysed 세포는 세포 배양에 있습니다. 그러나, transfection 또는 감염 효율 최적 하지 않으면 문화는 분명 cytopathic 효과 표시 되지 않을 수 있습니다. Cytopathic 효과 200-400 X 배율에서 거꾸로 위상 현미경으로 구상 될 수 있다. 잠재 감염 셀 안티 gp64 항 체11얼룩에 의해 감지할 수 있습니다.</li>
	<li>수확 잠재 표면에 뜨는 5 일 후 transfection 그리고 라벨 P1 바이러스 재고.</li>
	<li>PBS에는 0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 함께 어둠 속에서 빛에 민감한, 표면에 뜨는, 잠재를 저장 합니다. 또는 장기-80 ° C에서 90 일 단기 (최대) 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>곤충 문화 매체의 10 ml에서-10cm 조직 문화 취급 접시에 종자 6 × 106 Sf9 셀. 셀에 초기 잠재 표면에 뜨는 (P1) 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>잠재 표면에 뜨는 (P2) 5번째 하루 후 감염에서 수확.</li>
	<li>50 mL 삼각 플라스 크를 폴 리 카보 네이트는 250 mL에 곤충 문화 매체에서 현 탁 액 문화에서 Sf9 셀 (3 x 106 셀/mL)와 장소는 궤도 흔드는 인큐베이터에 플라스 크의 씨. 셀에 P2 재고의 2 개 mL를 추가 하 고 135 rpm에서 28 ° c.의 일정 한 온도 유지 하면서 흔들어 참고: 감염 후 3 ~ 4 일 전체 Sf9 세포 인구 cytopathic 효과, 높은 titer 잠재 생산의 표시를 보여줄 것 이다.</li>
	<li>순차적으로 증폭 하는 잠재 supernatants 원하는 볼륨 (P3P4,...) 얻을 때까지 각 후속 감염에 세포 배양의 50-fold 볼륨을 10 증가 시켜. 참고: P3 는 감염 1 l Sf9의 500 ml는 세포 배양 감염 된 수 있습니다 표면에 뜨는; P2 잠재의 10 ~ 20 mL의 라운드 3rd P4 에 5 ~ 10 L Sf9의 세포 배양의 P3 잠재 상쾌한, 100 ~ 200 mL와 함께 감염 될 수 있는 감염의 라운드 4번째 이다. 일반적으로, Sf9 세포 3 × 106 셀/mL 혈 청-무료 곤충 문화 미디어에서에서 시드 있습니다.</li>
	<li>1000 x g 세포 파편을 제거 하 여 소화 genomic DNA와 RNA를 37 ° C에서 2 h 50 단위/mL nuclease (250 단위 / µ L 재고)와 표면에 뜨는 잠재 치료 4 ° C에서 30 분 동안에 표면에 뜨는 잠재 원심 0.45 μ m 여과 장치를 통해 supernatants 필터링.</li>
</ol>3입니다. 크로마토그래피 시스템의 준비
<ol><li>샘플 및 버퍼 라인 각 살 균 물, 1 N 수산화 나트륨, 물, 순차적으로 rinsing 하 여 크로마토그래피 시스템을 준비 하 고 50 mL/min의 선형 유량에 버퍼 (20 m m 나트륨 인산 염 버퍼 포함 150 m m 염화 나트륨, pH 7.0)을 세척.</li>
	<li>버퍼 (5 이력서 살 균 20 m m 나트륨 인산 염 버퍼 포함 2 M 염화 나트륨, pH 7.0)을 청소 하는 열을 순차적으로 실행 하 여 준비 하는 헤 파 린 50 µ m 열 (10 × 10 cm, 7.9 mL 열 볼륨 (CV)의) 그리고 7 mL/min의 선형 흐름 속도로 이력서 워시 버퍼를 5.</li>
</ol>4입니다. 잠재 벡터의 정화
<ol><li>크로마토그래피 시스템을 다음과 같이 설정:<ol>
<li>표면에 뜨는 잠재 로드 입구 포트 로드 하는 예제를 사용 합니다.</li>
		<li>워시 버퍼를 로드 하기 위한 버퍼 입구 포트 a 1을 사용 합니다. 워시 버퍼의 적어도 500 mL 한 병 준비 고 워시 버퍼 라인 병 합니다.</li>
		<li>버퍼 입구 포트 a 2를 사용 하 여 로드 차입 버퍼 (20 m m 인산 나트륨 1.5 M 염화 나트륨, pH 8.0으로). 차입 버퍼의 적어도 500 mL 한 병을 준비 하 고 병으로 차입 버퍼 라인을 배치.</li>
		<li>표면에 뜨는 열 통과 잠재를 수집 하는 분수 수집기, 워시 버퍼 및 eluted 잠재에 몇 50 mL 원뿔 튜브를 삽입 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 7.9 mL 열 량 (CVs) 워시 버퍼 (40 mL) 7.0 mL/min의 선형 유량에서의 헤 파 린 열 equilibrate</li>
	<li>크로마토그래피 시스템의 샘플 펌프 (입구 샘플 포트)를 사용 하 여 선형 흐름 속도 2.0 mL/min의 헤 파 린 열에 표면에 뜨는 잠재의 250 mL 로드.</li>
	<li>자외선 (UV) 흡 광도 곡선까지 2.0 mL/min의 선형 흐름 율에 헤 파 린 열 통해 10 CVs (80 mL) 워시 버퍼의 실행 (280 nm) 기준으로 돌아왔다 고 안정 된다.</li>
	<li>때 잠재 입자 덤플링 열에서 해리 4.0 mL/분 시계는 크로마에 단백질의 날카로운 차입 피크의 선형 유량에서 차입 버퍼의 5 CVs (40 mL) 7.9 mL 헤 파 린 열에서 잠재 입자 elute.</li>
	<li>-차입, 즉시 eluted 잠재 상쾌한 다음 원심 분리 동안 삼투성 충격에서 잠재 입자의 비활성화를 방지 하기 위해 물에 20 m m 나트륨 인산 염 버퍼를 사용 하 여 10 배 희석.</li>
	<li>분수의 각각의 100 µ L를 저장, 잠재 상쾌한, 워시 버퍼와는 eluate 로드 하는 동안 수집 열 흐름 통해 포함 한. HT1080 정화 과정 (참조 섹션 6) 평가 하에 이러한 잠재 분수를 감염.</li>
	<li>버퍼와 워시 버퍼를 청소 하는 열과 열을 청소. 마지막으로, 7.0 mL/min의 선형 흐름 속도로 5 이력서 살 균 20% 에탄올에 물과 열을 린스와 4 ° c.에 저장</li>
	<li>물, 1 N 수산화 나트륨, 물로 다시와 50.0 mL/min의 선형 흐름 속도로 물에 20% 에탄올 크로마토그래피 시스템을 청소 하 고 시스템 20% 에탄올에 저장.</li>
</ol>5입니다. 잠재의 농도
<ol><li>전 압력솥을 사용 하 여 원심 분리기 튜브 소독. 조직 문화 후드에서 각 ultracentrifuge 튜브를 표면에 뜨는 잠재의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 균형에 의해 튜브 무게를 측정 하 고 메 마른 PBS 가진 ultracentrifuge 튜브의 내용의 무게를 조정 합니다.</li>
	<li>Ultracentrifuge 튜브의 각 양동이 남서 32 Ti로 터의 반대에 놓습니다.</li>
	<li>80000 × g에서 실행 하는 ultracentrifuge 4 ° c.에 90 분</li>
	<li>조직 문화 후드에서 ultracentrifuge 튜브를 열고 aseptically 잠재 펠 릿을 제거 하지 않고 액체를 발음 합니다.</li>
	<li>적극적으로 200 µ L 0.5% (w/vol) BSA 포함 하는 PBS와 아래로 pipetting으로 각 튜브의 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>Cryovials (병 당 50 ~ 100 µ L) 집중된 잠재 전송 하 고-80 ° c.에 저장</li>
</ol>6입니다. 잠재의 적정
<ol><li>감염, 전날 HT1080 세포 세포 Trypan 푸른 얼룩 후 한 hemocytometer를 사용 하 여 계산 합니다. 2 ml Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 포함 하는 6-잘 접시에 잘 당 종자 1 x 105 HT1080 세포. 감염의 시간에 세포의 정확한 수를 확인할 수 씨앗 몇 가지 추가적인 우물. 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 세포 문화. 참고: HT1080 세포 그들은 표현 하는 다른 셀 라인16에 비해 heparan 황산 염의 더 높은 수준으로 적정 사용 됩니다. 때문에 HT1080 세포 부착, 적정은 간단 하 고 전통적인 Sf9 기반으로 적정을 사용 하 여에 비해 적은 시간이 소요.</li>
	<li>감염의 날, 우물에서 셀을 계산 하 여 잘 당 셀의 수를 결정 합니다. 희석된 원래 잠재 되어 따로 설정 했다 열 정화, 이전 및 샘플에서 열 흐름 통해, 세척, 차입 분수를 추가 하 여 세포를 감염. 각 샘플에 대 한 희석과 실험적으로 감염 잠재 입자에 따라 볼륨을 확인 하 고 3 중에 각 잘 감염.</li>
	<li>감염 후 2 일 관심사의 유전자의 표현에 대 한 셀을 분석 합니다. 셀 경우에 그들은 형광 성 단백질 (예: GFP)17익스프레스 교류 cytometer를 사용 하 여 분석할 수 있습니다.</li>
	<li>계산 titers (전염 성 단위 mL 당) 감염, 희석 비율, 및 수식을 사용 하 여 셀에 형광 단백질의 백분율의 때에 존재 하는 셀의 수에 따라: (형광 단백질의 감염 × 비율 동안 셀 수 긍정적인 세포 × 희석 요인) / mL에 잠재의 볼륨. 참고: 예를 들어 감염 시 잘 당 세포의 총 수는 1.2 × 105, 형광 단백질의 비율 5%, 희석 비율 100, 이며 추가 희석된 잠재의 볼륨은 10 µ L는 titer 인지 6 × 107 전염 성 단위 (IU) /mL입니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

여기에 제시 된 프로토콜 Sf9 셀 서 스 펜 션 문화에 잠재의 생산과 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 잠재의 정화에 설명 합니다. 이 프로토콜에 사용 되는 매개 변수 수익률을 극대화 하 고 잠재 감염의 비활성화를 최소화 합니다. 여기에 제공 된 프로토콜 표시 복구에 비해 잠재 입자의 크게 향상 된 복구는9다른 사람에 의해 달성 됩니다.
때문에 광범위 한 호스트 범위와 조직 차 있는 굴곡 운동, 여러 연구는 중앙 신경 조직, 간, 눈, 난소, 전립선, 그리고 잠재 중재 유전자 배달5,6,7,8 고환에서 실시 되었다 . 자살 유전자, 종양 억제 유전자, 그리고 유전자 인코딩 종양 관련 항 원을 성공적...

잠재는 lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9에서에서 백신 및 재조합 단백질의 생산을 위해 주로 사용 된다 재조합 Autographa californica multicapsid 핵 polyhedrosis 바이러스 (AcMNPV)를 사용 하 여 곤충 세포 1 , 2 , 3 , 4. 최근에, 그것은 유전자 치료 응용 프로그램5에 대 한 유망한 벡터로 나오고. 광범위 한 호스트 및 조직 차 있는 굴곡 운동 것으로 알려져, 무부하 및 확산 세포 감염, 비 병원 성 이며 호스트 염색체4,,56으로 통합 하지 않습니다. 또한, 잠재 미래 임상 생산1처리 폐쇄 시스템에 대 한 확장 가능 하 혈 청 무료 서 스 펜 션 문화에서 생산 수 있습니다.
잠재 입자의 순수성은 세포 독성7,,89를 최소화 하면서 효과적인 변환 달성 하기 위한 중요 합니다. 잠재는 ultracentrifugation 또는 접선 교류 여과 (TFF)는 infectivity에 제한 된 영향에 의해 집중 될 수 있습니다. 그러나,이 절차는 뿐만 아니라 바이러스 입자를 집중 하지만 또한 세포 파편과 단백질 Sf9에서 문화, 독성 생체 외에서 (개인적인 관찰) 될 수 있는 염증 또는 사용 하는 경우 면역 반응을 일으킬 수 있습니다 vivo에서. 이 문제를 방지, 바이러스 주식 집중 매우 사용 하는 경우에 특히 감염 잠재 정화 하 여 입자 오염에서 분리 해야 합니다.
여러 가지 방법은 정화 및 잠재 벡터10,,1112의 농도 대 한 보고 되었습니다. 사용 가능한 접근의 덤플링을 친화성 크로마토그래피 단백질12오염의 낮은 농도와 정화의 한 단계 높은 수준의 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 잠재13,14에 대 한 수용 체로 heparan 황산 염의 식별을 기반으로 합니다. 열 및 잠재의 바인딩 Sf9 셀 상쾌한 로드, 후 열 생리 (isotonic) 버퍼 언바운드 또는 바운드 느슨하게 오염 입자를 제거 하 세척 될 수 있다. 헤 파 린에 바인딩이 되돌릴 수 있기 때문에, 잠재 입자 삼투성 충격12비활성화를 방지 하기 위해 생리 (isotonic) 소금 농도를 즉시 희석 한 높은 소금 버퍼 eluted 수 있습니다. 또한,에 캡처 뿐만 아니라 잠재, 생산 및 차입 크로마토그래피 열에서 수행할 수 있습니다 현재 좋은 제조 관행 (cGMP)와 호환이 되는 폐쇄 시스템 프로세스를 사용 하 여.
여기, 우리는 제조, 정화, 및 전염 성 잠재 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 원심 분리의 농도 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 짧게, 우리 Sf9 부착 문화에 잠재 플라스 미드 DNA와 세포의 transfection에 의해 잠재를 생산 하 고 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 전염 성 잠재 확장. 우리는 잠재 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 정화 하 고 마지막 단계로 서 ultracentrifugation를 사용 하 여 높은 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 벡터를 집중.

<table><tbody><tr><td>Akta Avant 150</td><td>GE 헬스케어</td><td>28976337</td><td>크로마토그래피 시스템</td></tr><tr><td>POROS Heparin 50 &micro; m 컬럼</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4333414</td><td>Heparin 컬럼</td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman-Coulter</td><td>비카탈로그 항목</td><td>고속</td></tr><tr><td>폴리알로머 초원심분리기</td> 튜브 <td>Beckman-Coulter</td><td>326823</td><td>고속</td></tr><tr><td>MaxQ 8000 오비탈 쉐이커 인큐베이터에서 바이러스 집중&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>비카탈로그 항목</td><td>현탁액 배양용 셰이커</td></tr><tr><td>250 mL 삼각 플라스크</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>238071</td><td>현탁 배양용 플라스크</td></tr><tr><td>1 L 삼각 플라스크</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>238072 현탁 배양용 플라스크</td></tr><tr><td>현미경 (Olympus CKX41)</td><td>Olympus</td><td>비카탈로그 항목</td><td>세포 모니터링 및 계수&nbsp;</td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>바큘로바이러스 상등액</td></tr><tr><td>50ml 코니컬 튜브</td> 정화용 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td>바큘로바이러스 상등액 6웰 플레이트 채취용</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-200-80</td><td>조직 배양 처리 플레이트</td></tr><tr><td>10cm 플레이트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-772E</td><td>조직 배양 처리 플레이트</td></tr><tr><td>Stericup-HV, 0.45&nbsp; &마이크로; m, PVDF</td><td>EMD-Millipore SCHVU05RE</td><td></td><td>여과 장치</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15160-054</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Vector Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10360-014</td><td>Baculovirus 발현 시스템</td></tr><tr><td>DH10B-T1R&nbsp; 유능한 세포</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12331-013</td><td>바크미드 TE 완충액에 대한 유능한 세포</td></tr><tr><td></td><td>사내</td><td>비카탈로그 항목</td><td>10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.</td></tr><tr><td>Plasmid Maxiprep kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K2100-06</td><td>바크미드 정제용</td></tr><tr><td>Sf9 세포</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11496-015</td><td>곤충 세포</td></tr><tr><td>Grace' 곤충 세포 배양 배지</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11605-094</td><td>형질 주입 배지</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20012227</td><td>세포 세척, 희석 시료</td></tr><tr><td>HyClone SFX-곤충 세포 배지</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30278.02</td><td>무혈청 곤충 세포 성장 배지</td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>DNA와 RNA</td></tr><tr><td>를 분해하는 효소Baculovirus 플라스미드 (bacmid) DNA</td><td>자체</td><td>비카탈로그 아이템</td><td>Bacmid for Baculovirus Production</td></tr><tr><td>Cellfectin II&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10362</td><td>곤충 세포용 트랜스펙션 시약</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>바큘로바이러스</td></tr><tr><td>안정화 Cryovial</td><td>Thomas Scientific</td><td>1222C24</td><td>바큘로바이러스</td></tr><tr><td>HT1080 세포주</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>섬유아세포 세포주</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>성장 저장 세포주용 배지</td></tr><tr><td>세척 완충액</td><td>사내</td><td>비카탈로그 품목</td><td>150mmol/l 염화나트륨을 함유한 20mmol/l 인산염 완충</td></tr>액 <tr><td>용출 완충액</td><td>사내</td><td>비카탈로그 품목</td><td>1.5 mol/l 염화나트륨을 함유한 20mmol/l 인산염 완충액</td></tr><tr><td>컬럼 세척 완충액</td><td>사내</td><td>비카탈로그 품목</td><td>2.0 mol/l 염화</td></tr><tr><td>나트륨을 함유한 20 mmol/l 인산염 완충액멸균수</td> 사<td>내</td><td>비카탈로그 항목</td><td>Akta Avant 세척</td></tr><tr><td>용 수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>1.09137</td><td>Akta Avant 세척</td></tr>용 <tr><td>에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>E7073</td><td>Akta Avant 세척용</td></tr></tbody></table>

생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

잠재는 전통적으로 재조합 단백질 및 백신의 생산을 위해 사용 되었습니다. 그러나, 최근에, 잠재 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 유망한 벡터로 떠오르고 있다. 여기, 잠재 Sf9 세포의 부착 문화에 잠재 플라스 미드 DNA (bacmid)의 과도 transfection에 의해 생산 됩니다. 원하는 볼륨을 얻을 때까지 잠재 이후에 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 Sf9 셀에 확장 됩니다. 그것은 다음 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 표면에 뜨는 문화에서 정화. 바이러스 표면에 뜨는 잠재 봉투 당단백질에 대 한 상쾌한 덤플링의 선호도 때문에 잠재 입자를 바인딩하는 덤플링 열에 로드 됩니다. 열 오염 물질을 제거 하는 버퍼와 세척 하 고 높은 소금 버퍼 열에서 잠재는 eluted. eluate isotonic 소금 농도를 희석 하 고 잠재 입자는 더 ultracentrifugation를 사용 하 여 집중. 이 메서드를 사용 하 여 잠재 전염 성 입자의 25% 회복으로 최대 500-fold 집중 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 1 L 문화에서 생산 고는 잠재의 정화를 보여줍니다, 하지만 메서드 수 수 확장-최대 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 임상 등급 벡터를 생산 하기 위해 폐쇄 시스템 정지 문화.

흐름 다이어그램 (그림 1)에서 제시 하는 프로토콜이입니다. 단계는 bacmid 생산 부착 문화 접시에, 혈 청 무료 정지 문화, nuclease 치료에 원심 분리와 여과, 정화 후속 증폭에 잠재 하는 DNA와 Sf9 세포의 과도 transfection를 포함 그리고 ultracentrifugation와 농도 정화 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 다음.
후 녹고, Sf9 세포 복구를 2 주 이상 필요 하 고 성장의 지 수 단계에 입력. 적극적으로 성장 하는 Sf9 세포 부착 문화에서 bacmid DNA와 페는. Transfection, 잠재 봉투 glycoproteins, 식 후 2 일 gp64 감지 되며 그 후, 잠재 생산 시작된11. 잠재 능력 복제 이...

이 프로토콜에서 잠재 Sf9 세포로 잠재 플라스 미드의 과도 transfection에 의해 생산 이며 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 증폭. 상쾌한 덤플링 친화성 크로마토그래피에 의해 순화 하 고 ultracentrifugation에 의해 더 집중. 이 프로토콜은 생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화에 대 한 유용 합니다.

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 곤충 세포 배양에서 바큘로바이러스를 생성하고, 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 초원심분리로 농축하는 것입니다. 최종 제품은 생체 내 유전자 전달 또는 백신으로 사용할 수 있습니다. 이 방법은 유전자 치료 응용을 위해 정제 및 농축된 바큘로바이러스를 사용하고자 하는 연구자에게 도움이 될 수 있습니다.바큘로바이러스 입자에는 Sf9 배양의 세포 파편과 단백질이 포함되어 있을 수 있으며, 이는 사람에게 사용될 때 염증이나 면역 반응을 유발할 수 있습니다. 독성을 피하기 위해 바큘로바이러스를 정제하여 오염 입자와 분리합니다. 절차의 일부는 제 연구실의 연구 조교인 Marilou Narciso가 시연할 것입니다.현탁액 배양을 설정하려면 곤충 배양 배지에서 50ml의 Sf9 세포를 250ml 폴리카보네이트 삼각 플라스크에 시딩합니다. 그리고 플라스크를 오비탈 셰이커 인큐베이터에 넣습니다. P2 바큘로바이러스 스톡을 2ml씩 세포에 넣고 섭씨 28도의 일정한 온도를 유지하면서 135rpm으로 흔듭니다.감염 후 4일이 지나면 전체 Sf9 세포 집단에서 세포병성 효과가 나타나는데, 이는 역가 바큘로바이러스 생성이 높다는 것을 나타냅니다. 원하는 부피가 얻어질 때까지 바큘로바이러스를 순차적으로 증폭하고, 각 후속 감염에서 세포 배양 부피를 10배에서 50배까지 증가시킵니다. 최종 바큘로바이러스 상등액을 1000g, 섭씨 4도에서 30분간 원심분리하여 세포 파편을 분리한 후, 상등액을 깨끗한 용기에 옮기고 섭씨 37도에서 2시간 동안 밀리리터당 50단위의 뉴클레아제로 처리하여 게놈 DNA와 RNA를 소화합니다.마지막으로 0.45미크론 여과 장치를 통해 바이러스 상층액을 여과합니다. 입구 포트 A1의 세척 버퍼 라인을 최소 500ml의 세척 버퍼가 들어 있는 병에 배치하여 크로마토그래피 시스템을 설정합니다. A2 버퍼 Inlet 포트를 사용하여 용리 버퍼를 로드합니다.여러 개의 50ml 원뿔형 튜브를 분획 분취기에 삽입하여 컬럼 통과 바큘로바이러스 상등액, 세척 완충액 및 회피된 바큘로바이러스를 수집합니다. 헤파린 컬럼을 5개의 7.9ml 컬럼 부피의 세척 버퍼로 분당 7ml의 선형 유속으로 평형을 이룹니다. 분당 2ml의 선형 유속으로 주입구 시료 포트의 시료 펌프를 사용하여 헤파린 컬럼에 250ml의 바큘로바이러스 상등액을 주입합니다.그런 다음 자외선 흡광도 곡선이 기준선으로 돌아오고 안정될

production-purification-baculovirus-for-gene-therapy

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오에서는 헤파린 친화성 크로마토그래피를 사용하여 곤충 세포 상층액에서 바큘로바이러스를 분리하는 기술을 시연합니다. 분리는 컬럼의 헤파린과 바큘로바이러스 외피 당단백질 사이의 친화력에 의해 촉진됩니다.

헤파린 친화성 크로마토그래피 기반 바큘로바이러스 정제: 곤충 세포 상등액에서 바큘로바이러스를 분리하는 기술

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

본 프로토콜에서는, 고유 분해 가능한 GST-태그 및 그의 작은 태그를 조합하여 재조합 단백질의 정제를 허용하는 매우 효율적이고 비용 효과적인 소량의 단백질 정제 방법을 보여준다.

GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

Kindlins는 인테그린을 ​​통해 세포 부착 해 기본적인 그러나 그들의 연구는 세균의 호스트에서 재조합을 표현에서 발생하는 어려움에 의해 방해되었다. 우리는 여기에서 배큘로 바이러스에 감염된 곤충 세포에서의 효율적인 생산 방법을 설명합니다.

의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서

여기서는 배큘로 바이러스 또는 포유류 발현 시스템, 및 초 원심 정제를 사용하여 바이러스 입자의 합성을위한 프로토콜을 제시한다. 이것은 매우 최적화 방법은 안전하고 유연하게 타겟으로 백신 바이러스 항원을 확인하는 데 사용된다.

표현과 예방 접종에 대한 바이러스 입자의 정제

이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.

과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

이온 채널의 정화는 종종 도전, 하지만 일단 달성, 그것은 잠재적으로 수 체 외에서 조사 기능 및 채널의 구조. 여기, 표현과 포유류 bestrophin 단백질, 캘리포니아2 +의 가족의 정화에 대 한 단계적 절차 설명-Cl- 채널을 활성화.

표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화

여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 생화학, 생물리, 구조 연구에 사용되는 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제(PRMT)의 발현 선별 및 생산을 위한 견고한 플랫폼이다. 밀리그램 수량의 물질은 대부분의 PRMT 및 진핵 발현 플랫폼을 요구하는 관심있는 다른 단백질을 위해 생성될 수 있다.

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 재조합 PRMT 단백질 생산

본 프로토콜에서, AAV2 벡터는 바쿨로바이러스(BV)-AAV2-녹색 형광단백질(GFP) 또는 BV-AAV2-rep-cap 감염Sf9 세포를 현탁액 배양에서 감염한 Sf9 세포를 결합하여 스포드옵테라 검거다(Sf9) 곤충 세포를 공동 배양하여 생성된다. AAV 입자는 세제, 명확성, 친화열 크로마토그래피에 의해 정제되며 접선 흐름 여과에 의해 농축됨을 사용하여 세포로부터 방출된다.

바쿨로바이러스-곤충세포배양시스템을 이용한 아데노 관련 바이러스(AAV)2 벡터의 생산 및 정화를 위한 공정 개발

인간 막 수송체의 구조 및 생화학적 연구에는 밀리그램 단위의 안정적이고 온전하며 균질한 단백질이 필요합니다. 여기서는 코돈 최적화 유전자를 사용하여 인간 용질 운반체 수송체를 스크리닝, 발현 및 정제하는 확장 가능한 방법을 설명합니다.

구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

배우세요 Sf9 세포 배양에서 바큘로바이러스를 생산하고 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정화한 후 초원심 분리로 농축하는 방법을. 이 기술은 유전자 치료 및 백신 개발 연구에 필수적입니다.

생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

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