말라와 자극된 방출 소모 (호텔 위치) 현미경을 사용 하 여 B 세포 면역 냅에 Microtubule Cytoskeletons 시각화

이 프로토콜의 전반적인 목표는 유도 방출 고갈을 위해 B 세포 면역 시냅스에서 액틴 및 미세소관 세포골격을 염색하거나 STED 현미경을 검사하고 공간적 관계에서 구조, 조직을 이미징하는 것입니다. 이 방법은 면역 시냅스 형성 중 액틴 및 미세소관 세포골격의 재조직을 포함하여 B 세포 활성화 중 세포골격 조직에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다중 컬러 STED 현미경의 주요 장점은 나노미터 규모의 해상도로 액틴 세포골격, 미세소관 네트워크 및 주요 세포골격 관련 단백질을 동시에 이미징할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 B 세포 활성화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 자연 살해 및 T 세포와 같은 다른 면역 세포 유형의 면역 시냅스 형성에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 STED를 사용하여 동시 이미징 및 다중 형광단을 위한 현미경 설정을 최적화하려면 약간의 연습이 필요하다는 것을 알게 될 것입니다. Jia 및 Madison과 함께 이 절차를 시연하는 사람은 Kate Choi와 Caitlin Pritchard입니다.

먼저 각 transfection당 2.5배 10에서 6번째까지 A20 B-lymphoma cell을 원심분리하고, 1 - 2.5 microgram의 관심 혈장 DNA가 보충된 100 microlit의 transfection 시약에 세포를 다시 현탁시킵니다. 용액을 부드럽게 혼합하고 세포의 각 분취액을 6웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 각 웰의 부피를 섭씨 37도의 완전한 배지로 2밀리리터로 조정하고 셀을 섭씨 37도의 인큐베이터에 18시간 동안 넣습니다.

다음날 아침, 1.5 18mm 원형 유리 커버 슬립을 100 % 메탄올에 담그고 커버 슬립을 약 10 분 동안 완전히 건조시킵니다. 건조된 커버슬립을 12웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰에 넣고 각 커버슬립 중앙에 400마이크로리터의 염소 항 마우스 면역글로불린 G 항체를 추가하여 중앙에 기포가 형성되고 웰로 떨어지지 않고 가장자리로 퍼지도록 합니다. 커버슬립을 실온에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 웰당 1ml의 멸균 PBS로 커버슬립을 3회 헹구어 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 마지막 세척 후 세포 파종까지 각 커버슬립을 1밀리리터의 신선하고 멸균된 PBS에 보관하십시오. 형질주입된 세포가 준비되면 원심분리를 통해 15ml 원뿔형 튜브에 수집하고 FBS가 보충된 1ml의 변형된 HEPES 완충 식염수에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

계수 후, 세포를 밀리리터 농도 및 변형 된 HEPES 완충 식염수와 FBS에 2 x 10으로 희석하고 겸자를 사용하여 각 커버 슬립을 파라핀 필름 조각으로 옮깁니다. 각 커버슬립에 250마이크로리터의 세포를 추가하고 암흑 속에서 섭씨 37도에서 15분 동안 커버슬립을 배양하여 세포가 항면역글로불린 G 코팅 표면을 가로질러 퍼질 수 있도록 합니다. 배양이 끝나면 각 슬라이드에서 과도한 식염수를 제거하고 각 커버슬립에 350마이크로리터의 고정제로 코팅하고 전체 표면이 덮이도록 주의하십시오.

실온에서 어둠 속에서 10분 후 마이크로피펫을 사용하여 각 커버슬립의 가장자리에서 고정제를 조심스럽게 흡인하고 500마이크로리터의 투과화 및 차단 버퍼로 커버슬립을 세척합니다. 그런 다음 250마이크로리터의 신선한 투과화 및 차단 버퍼로 세포를 투과화하고 차단하여 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 차단합니다. 다음으로, 과량의 완충액을 제거하고 실온의 어둠 속에서 30분 동안 50마이크로리터의 1차 관심 항체로 세포를 라벨링합니다.

배양이 끝나면 세척당 500마이크로리터의 염색 완충액으로 커버슬립을 3회 세척하고 실온에서 30분 동안 각 커버슬립에 적절한 2차 항체 50마이크로리터를 추가합니다. 2차 항체를 세척한 후 현미경 슬라이드에 10마이크로리터의 장착 시약을 추가하고 커버 슬립을 세포 면이 아래로 향하게 하여 개별 현미경 슬라이드에 장착합니다. 그런 다음 다음 날 이미징을 위해 슬라이드를 어둠 속에서 밤새 건조시킵니다.

STED 현미경으로 세포를 이미지화하려면 먼저 STED 현미경을 켭니다. epifluorescence illumination l의 레이저를 활성화합니다.amp 현미경 소프트웨어를 엽니다. STED 공핍 레이저에 대한 매개변수를 설정하고 첫 번째 샘플을 현미경에 로드합니다.

접안렌즈를 사용하여 샘플에 수동으로 초점을 맞춰 적당한 GFP 발현을 가진 세포를 선택합니다. 선택한 셀을 확대하고 이미지화할 관심 영역을 선택합니다. 커버슬립에 가장 가까운 셀의 XY 평면에 초점이 맞춰지도록 초점을 조정합니다.

그런 다음 소프트웨어의 Acquire 탭에서 Sequential Scan 패널의 Between Frames 옵션을 선택하여 이미지 획득을 순차적 프레임 획득으로 설정합니다. 각 형광단에 대한 STED 레이저 출력을 설정하고 슬라이드 막대를 사용하여 실험에 사용된 형광단에 따라 레이저 출력을 조정합니다. 해상도를 높이고 배경 신호를 줄이려면 Acquisition 설정을 열고 드롭다운 메뉴를 사용하여 1보다 큰 값을 선택하여 라인 및/또는 프레임 평균을 높입니다.

각 형광단에 대한 게인 옵션과 시간 확보에 대한 특정 값을 확인하여 시간 게이트 STED에 대한 적절한 형광 신호를 획득하고 STED 레이저 출력을 증가시켜 해상도를 향상시킵니다. 형광 신호를 너무 많이 잃지 않으면서 해상도를 개선하기 위해 사용되는 현미경 샘플과 형광단의 획득 시간을 최적화하는 것이 중요합니다. 그런 다음 재현성을 보장하기 위해 여러 이미지를 수동으로 획득하고 제조업체의 지침에 따라 디콘볼루션 소프트웨어 패키지를 사용하여 이미지를 디컨볼루션합니다.

A20 B-림프종 세포의 경우, 고정된 NT 면역글로불린 항체에 퍼집니다. 디콘볼루션 소프트웨어와 함께 사용되는 STED 현미경은 컨포칼 현미경 검사만 사용하는 것보다 세포골격 구조에 대한 고해상도 이미지를 제공합니다. 컨볼루션 이미지의 디콘볼루션은 이미지의 해상도를 크게 향상시키지만, 디컨볼루션된 STED 이미지는 디컨볼루션 컨포칼 이미지보다 더 상세한 구조 정보를 제공합니다.

단색 STED는 전체 B 세포 세포골격 네트워크의 3차원 초고해상도 이미지를 획득하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이러한 다색 STED 이미지에서는 수지상 액틴의 주변 고리 염색이 미세소관 염색과 함께 관찰될 수 있습니다. 형광 융합 단백질로 transfection된 세포를 사용할 때 최적의 발현 수준을 달성하고 과발현으로 인한 아티팩트를 방지하는 것이 중요한 고려 사항이며, 형광 융합 단백질의 발현이 너무 낮으면 이미지 품질이 저하됩니다.

전체 관심 영역을 포함하기 위해 신중하게 초점을 맞추는 것도 중요합니다. 예를 들어, 이 이미지에서는 미세소관 네트워크의 일부만 커버슬립에 가장 가까운 초점면 내에 있어 샘플의 완전한 분석을 방해했습니다. 이 기술을 숙달하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.

하루는 샘플 준비 및 염색을, 하루는 STED 이미징을 위해 사용됩니다. 세포를 transfection하는 데 사용할 혈장의 양을 적정하는 것을 기억하는 것이 중요하며, 이를 통해 이미징 중에 검출할 수 있는 충분한 형광 단백질의 발현을 얻는 동시에 과발현으로 인한 아티팩트를 방지할 수 있습니다. 이 절차에 따라, 다른 형광 융합 단백질의 발현을 유도하여 세포골격 역학 및 조직을 조절하는 다른 단백질의 국소화를 촉진하거나 다른 세포 과정에 관여하는 단백질의 세포 내 분포를 시각화할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 면역 시냅스 형성에 관여하는 세포골격 구조 및 단백질의 이미징을 위해 STED 현미경을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 글루타르알데히드와 같은 고정제로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이러한 종류의 시약을 사용할 때는 항상 화학 흄 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.