확산 및 Murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R의 셀

본 실험의 전반적인 목표는 마우스 골수성 32D-G-CSF-R 세포에서 관심 유전자를 과발현 또는 억제시켜 유전적으로 변형하고, 이러한 변화가 해당 세포주의 증식 및 중성구 분화에 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이 방법은 관심 단백질이 골수성 전구 세포의 성장 및 분화에 어떻게 관여하는지와 같은 혈액학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 세포주의 주요 장점은 무제한의 증식 능력을 갖추고 있으며, 유전적 조작이 용이하고, 비용이 상대적으로 저렴하며, 특정 실험적 접근 방식에 필요한 어느 정도의 생물학적 단순화를 가능하게 한다는 점입니다. 오늘 이 절차를 시연할 사람은 제 실험실의 박사 과정 학생인 Petr Danek입니다.

열-불활성화된 10% 소태아혈청과 10 nanograms per milliliter의 murine interleukin-3가 첨가된 RPMI-1640 배지 250 milliliters를 준비합니다. 그런 다음 분화 배지 50 milliliters를 준비합니다.

16cm 페트리 접시에 10% fetal bovine serum이 첨가된 18mL DMEM 배지를 넣고 Bosc23 세포의 단일 세포 현탁액을 분주합니다. 세포 합류도가 80%에 도달할 때까지 약 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 MSCV 레트로바이러스 컨스트럭트, PCL-echo 패키징 벡터, poly-ethylenimine 및 항생제가 없는 저혈청 배지를 혼합합니다. 이 혼합물을 Flowbox 내의 실온에서 20분 동안 배양합니다. 이후 Bosc23 세포 배양액을 37°C로 예열된 2% fetal bovine serum 첨가 DMEM 배지 16mL로 조심스럽게 교체합니다. 다음으로, 레트로바이러스 혼합액을 Bosc23 세포 위에 한 방울씩 떨어뜨려 첨가합니다. 그런 다음 배양물을 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 Bosc23 배양액을 흡입하여 제거하고, 10% fetal bovine serum이 함유된 예열된 DMEM 배지 18 milliliters를 첨가합니다. 세포를 37 degrees Celsius에서 48시간 동안 배양합니다. 25 milliliter serological pipette을 사용하여 Bosc23 바이러스가 포함된 배지를 50 milliliter conical tube에 옮겨 담습니다. 튜브를 4 degrees Celsius에서 보관합니다. 그 후 Bosc23 세포에 10% fetal bovine serum이 함유된 예열된 DMEM 배지 18 milliliters를 첨가하고 세포를 24시간 동안 배양합니다.

바이러스 상층액을 4°C에서 1,500 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 그다음 바이러스를 소분하여 액체 질소로 급속 냉동시킨 후 -80°C에서 보관합니다.

6-웰 플레이트의 각 웰에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 3mL의 DMEM 배지를 사용하여 하나의 바이러스를 타이터링하기 위한 NIH/3T3 세포를 분주합니다. 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 바이러스 입자를 볼텍싱하지 않고 미리 데워둔 배지로 바이러스를 희석합니다. NIH/3T3 세포에서 배양액을 흡입하여 제거하고, 각 웰에 희석된 바이러스 1mL를 첨가합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 희석된 바이러스 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고 10% 소태아혈청이 함유된 DMEM 배지 2mL로 교체한 후, 다시 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 기존 배지를 흡입하여 제거하고 2µg/mL 푸로마이신(puromycin)이 함유된 DMEM 배지로 교체합니다. 3일마다 또는 배지가 노랗게 변할 때마다 푸로마이신이 함유된 신선한 배지로 교체하며 세포 배양을 계속합니다.

감염 후 10일에서 12일 사이에 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 인산완충식염수로 가볍게 세척합니다. 그다음 실온에서 1mL의 크리스탈 바이올렛 용액으로 2분 동안 염색합니다. 염색 후 인산완충식염수로 조심스럽게 두 번 세척합니다. 현미경 하에서 각 웰에 존재하는 청색 콜로니의 총 개수를 측정합니다.

6-웰 플레이트에 32D-G-CSF-R 세포를 접종합니다. 감염 다중도(multiplicity of infection) 10에서 40 사이로 바이러스를 첨가합니다. 그다음 polybrene을 최종 농도가 8 µg/mL가 되도록 세포에 첨가하고 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다. 배양 후, 세포를 15 mL 튜브에 모으고 4 °C에서 450 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 32D 세포는 1 × 10⁶ cells/ml 이상의 농도로 성장할 경우 분화 능력을 부분적으로 상실할 수 있으므로, 제때 세포를 분할하고 배양액이 과성장하지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다.

상층액을 제거하고, 열불활성화된 10% fetal bovine serum과 10 nanograms per milliliter의 murine interleukin-3가 첨가된 6 milliliters의 RPMI-1640 Medium이 담긴 T25 배양 플라스크에 세포를 재현탁한다. 세포를 37 °C에서 48시간 동안 배양한다.

사이토카인이 포함되지 않은 RPMI-1640 배지로 32D-G-CSF-R 세포를 2회 세척합니다. 그런 다음 0일 차에 24-웰 플레이트의 1 mL 분화 배지에 세포를 접종하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 세포가 성숙한 과립구로 분화하는 데는 7~9일이 소요됩니다. 이후 trypan blue를 사용하여 죽은 세포를 제외한 세포 수를 측정합니다.

IL-3가 분화 과정을 억제할 수 있으므로, 세포를 GCSF에서 배양하기 전에 사이토카인의 모든 흔적을 제거하는 것이 절대적으로 중요합니다.

필요한 어댑터를 장착한 원심분리기에서 20 ×g로 5분 동안 세포를 유리 슬라이드에 사이토스핀(Cytospin)합니다. 그 다음, 상온에서 메탄올로 5분 동안 세포를 고정하고 세포를 건조시킵니다. 제조사의 프로토콜에 따라 May-Grunwald Giemsa 염색법을 사용하여 세포를 염색합니다. 염색이 완료되면, 40배율로 염색된 세포를 관찰합니다.

세포 형태를 기반으로 염색된 세포 중 모세포(blast), 중간 분화 세포 및 성숙 과립구의 수를 정량화하십시오.

여기에 interleukin-3 및 granulocyte colony stimulating factor 함유 배지에서 32D-G-CSF-R 세포의 증식을 보여주는 그래픽 표현이 제시되어 있습니다. x축은 처리 기간(일)을 나타내며, y-axis는 로그 스케일의 세포 수를 나타냅니다. 검은색 플롯은 세포를 interleukin-3 함유 배지에서 배양했을 때의 증식을 보여줍니다. 파란색 플롯은 granulocyte colony stimulating factor 함유 배지에서 배양했을 때 세포 증식이 감소했음을 보여줍니다.

여기에 과립구 colony 자극 인자가 포함된 배지에서 32D-G-CSF-R 세포의 비율과 분화 형태를 보여주는 대표적인 파이 차트와 May-Grunwald Giemsa 염색 결과가 제시되어 있습니다. 파이 차트는 과립구 colony 자극 인자 처리 후 0일, 2일, 4일, 6일째의 모세포, 중간 분화 세포 및 호중구의 비율을 보여줍니다. 0일째의 Giemsa 염색 세포는 크고 특징적인 핵과 어두운 세포질을 가지고 있습니다. 6일째에는 핵의 크기가 감소하고 세포질은 확대되었으나 어둡지 않습니다.

여기에 제시된 대표적인 파이 차트는 과립구 집락 자극 인자가 포함된 배지에서 대조군 MSCV 벡터와 비교하여 BCR-ABL 융합 단백질을 형질전환시켰을 때 모세포(blast cells)의 비율이 더 높게 나타남을 보여줍니다. 하단 패널의 Giemsa 염색 결과는 대조군 또는 BCR-ABL 융합 단백질을 형질전환시킨 세포의 대표적인 모습입니다.

MSCV 대조군 벡터를 도입한 세포는 6일째에 호중구 분화가 일어났으나, BCR-ABL을 도입한 세포는 대부분 모세포(blast cells) 형태를 보였으며 성숙한 호중구는 관찰되지 않았습니다.

이 기술을 완전히 익히면, 적절하게 수행했을 때 이틀 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 32D-G-CSF 수용체 세포를 명시된 농도로 배양하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 절차 이후에는 추가적인 질문에 답하기 위해 이동 분석(migration assays) 및 생존 실험과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 렌티바이러스 및 레트로바이러스 도입을 통한 유전자 조작, 증식, 분화, 그리고 이 세포들의 증식 및 분화 평가를 포함하여 32D-G-CSF 수용체 세포주를 다루는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 바이러스를 다루는 것은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 보호 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.