Name: 확산 및 Murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R의 셀 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 학습하세요 murine 골수성 전구세포 32D/G-CSF-R의 배양, 바이러스 감염, 증식 및 분화 분석 방법을. 이 기법은 유전자 조작이 골수세포 발달에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 교수 뤼트 Delwel 및 32D/G-CSF-R 셀 라인, 우리를 제공 하기 위한 교수가 보 Touw 및 Bosc23 셀 선 제공에 대 한 교수 다니엘 G. 되어 감사 합니다. 이 작품 MA j 체코 공화국 (GACR 15-03796S 및 GACR 17-02177S)의 그랜트의 교부 금에 의해 지원 되었다, MA-j, GA 영국 원정대 (프로젝트 번호 341015) 체코 과학 아카데미 (RVO 68378050)의 분자 유전학 연구소에서 지원 PD 프라하 찰스 대학교에서 MK, 하가 영국 원정대 (프로젝트 번호 1278217) 프라하에 있는 찰리 대학.

참고: 확장을 설명 하는 단계, 차별화, 및 32D/G-CSF-R 셀의 변환 되 게 됩니다 아래.
1입니다. 준비
<ol><li>미디어 준비
	<ol>
<li>문화 매체의 250 mL 준비: 10% 열 보충 (로스웰 파크 기념 연구소) RPMI 1640 매체 비활성화 FBS (태아 둔감 한 혈 청) 및 murine IL-3 (10 ng/mL).<ol>
<li>또는 집에서 만든 IL-3를 사용 하 여. 집에서 만든 IL 3 생산, IL-3 표현 벡터와 HEK293 세포 transduce 하 고 IL-3 표면에 뜨는22를 포함 하를 수집 합니다. 참고: 항생제, 페니실린 G 등 (100 IU/mL), 스 (100 µ g/mL), 및 gentamicin (40 µ g/mL), 달리 명시 하지 않는 한 프로토콜의 어떤 단계에서 세포 배양에 사용할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>차별 매체의 50 mL를 준비: RPMI 1640 매체 보충 10 %FBS, 그리고 인간의 G-CSF (100 ng/mL). 참고: 모든 혈 청 일괄 지원 32D/G-CSF-R 세포의 분화 (중요). 실험 시작 전에 혈 청의 다른 배치를 테스트 합니다. 4 다른 일괄 처리를 테스트 하 고 최적의 32D/G-CSF-R 세포의 분화 능력에 따라 선택 하는 것이 좋습니다. 32D/G-CSF-R 차별화 프로토콜 아래를 참조 하십시오.</li>
		<li>냉동 매체의 10 mL를 준비: RPMI 1640 매체 보충 40 %FBS, 그리고 10 %DMSO (디 메 틸 sulfoxide).</li>
	</ol></li>
	<li>레트로 바이러스의 생산
	<ol>
<li>Bosc23 셀 (6 × 106) 16 cm 배양 접시의 단일 세포 현 탁 액을 접시 하 고 10 %FBS 문화의 confluency까지 도달 80% (24 시간)를 포함 하는 18 ml DMEM (Dulbecco의 수정이 글의 중간)의 육성. 참고: 셀 문화에 단층 및 하지 양식 수 풀에서 성장 해야 합니다. 셀 세은 (여기에 제시 된 프로토콜의 나머지 부분에 대 한 유효한) 다른 방법을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 샘플의 낮은 수의 경우 현미경 Bürker 챔버를 사용 하 여 수동 계산 것이 좋습니다. 이 경우에, Trypan blue를 사용 하 여 죽은 세포의 배제에 대 한. 셀 1:1 혼합 0.4 %Trypan 파랑 PBS에. 샘플의 많은 수의 계산을 수행 하려면 자동 셀 카운터를 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>Retroviral 구문 (예: MSCV) 40 µ g, pCL 에코 (포장 벡터)23의 20 µ g, 페이 (polyethylenimine)의 80 µ l 감소-혈 청 매체 (예: Opti 메모리) (항생제) 없이 매체의 2 mL을 결합 합니다. 실 온 (RT)에서 20 분 동안이 혼합물을 품 어.</li>
		<li>신중 하 게 Bosc23 세포 매체 16 mL DMEM 2% 보완 대체 FBS. 미리 따뜻하게 사용 하기 전에 37 ° C에 매체. 참고:는 transfection 효율을 줄일 수 있습니다 그것 때문에, transfection, 동안 항생제를 사용 하지 마십시오.</li>
		<li>1.2.2에 혼합물을 추가 합니다. dropwise을 신중 하 게는 Bosc23 문화, 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어 미만 6 h 페이 독성 때문에 외피를 제한 합니다.</li>
		<li>부 화, 이후 18 ml Bosc23 매체 변경 사전 예 열 10% 포함 된 DMEM FBS, 37 ° c.에서 48 h에 대 한 셀을 육성 요리는 biosafety 수준 2 실험실에서 여기에,이 단계에서 계속 놓고 표준 안전 절차를 따르십시오.</li>
		<li>Bosc23 매체 (포함 ecotropic retroviral 입자) 50 mL 원뿔 튜브로 25 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 수집 및 4 ° c.에 저장 참고: (중요) Transfection 효율 높은 titer 바이러스 생산 90% 도달 한다.</li>
		<li>추가 18 mL 미리 따뜻하게 DMEM 10 %FBS Bosc23 세포와 24 h에 대 한 육성.</li>
		<li>1.2.6 단계를 반복 합니다. 참고: 일단 바이러스 무결성을 유지 하기 위해 동일한 온도 (4 ° C) 도달 하면 Retroviral supernatants 1.2.6 1.2.8에서 풀링된 수 있습니다.</li>
		<li>Bosc23 바이러스 supernatants 오염을 방지 하려면 스핀 4 ° c.에서 10 분 동안 1500 × g에서 수집 된 바이러스 Aliquot 바이러스, 동결 드라이 아이스 나 액체 질소를 사용 하 여 스냅 그리고-80 ° c.에 저장 그러나, 그 갓된 바이러스는 냉동된 주식 보다 감염 효율 측면에서 높은 품질의 note. 참고: (중요) 피하 반복적인 동결/녹고 바이러스, 때문에 그것은 바이러스 성 저하로 연결</li>
	</ol></li>
	<li>Lentivirus의 생산
	<ol>
<li>플레이트 HEK293T (인간 미 발달 신장 293T) 셀 (6 × 106) 16 cm 배양 접시의 단일 세포 현 탁 액 그리고 18 mL 10 %FBS 문화의 confluency까지 도달 80% (24 시간)를 포함 된 DMEM의 육성. 참고: 셀 문화에 단층 및 하지 양식 수 풀에서 성장 해야 합니다.</li>
		<li>15 µ g lentiviral 구문 (예: pGhU6), 플라스 미드 pCMVdR8.74 (개 그/폴, 12 µ g에 대 한 인코딩) 포장의 결합 및 pMD2.VSVG (1.4 µ g VSV G에 대 한 인코딩), 85.2 µ L 페이, 그리고 감소-혈 청 (항생제) 없이 매체의 2 mL. 실시간에서 20 분 동안이 혼합물을 품 어</li>
		<li>신중 하 게 2% 보완 DMEM의 16 mL HEK293T 매체를 바꿉니다 FBS. 미리 따뜻하게 사용 하기 전에 37 ° C에 매체. Transfection 효율을 줄일 수 있습니다 그것 때문에, transfection, 동안 항생제를 사용 하지 마십시오.</li>
		<li>신중 하 게 HEK293T 세포 배양에 1.3.2에 혼합물을 삭제 하 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어 페이 독성을 방지 하기 위해 6 h 이내에 부 화 기간을 제한 합니다.</li>
		<li>변경 매체 18 mL를 미리 예 열 DMEM 10% FBS 37 ° c.에서 48 h에 대 한 셀을 육성 요리는 biosafety 수준 2 실험실에서 여기에,이 단계에서 계속 놓고 표준 안전 절차를 따르십시오.</li>
		<li>HEK293T 매체 (포함 amphotropic lentiviral 입자) 50 mL 원뿔 튜브로 25 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 수집 하 고 4 ° c.에 그것을 저장합니다 참고: (중요) Transfection 효율 높은 titer 바이러스 생산 90% 도달 한다.</li>
		<li>신중 하 게 추가 미리 따뜻하게 DMEM의 18 mL 10% FBS HEK293T 셀에. 37 ° c.에 24 시간 배양</li>
		<li>1.3.6 단계를 반복 합니다. 참고: 일단 바이러스 무결성을 유지 하기 위해 동일한 온도 (4 ° C) 도달 하면 Lentiviral supernatants 1.3.6 1.3.8에서 풀링된 수 있습니다.</li>
		<li>HEK293T 세포와 바이러스 상쾌한의 오염을 방지 하려면 스핀 4 ° c.에서 10 분 동안 1500 × g에서 수집 된 바이러스 Aliquot 바이러스, 동결 드라이 아이스 나 액체 질소를 사용 하 여 스냅 그리고-80 ° c.에 그것을 저장합니다 그러나, 알 갓 바이러스 준비 냉동된 주식 보다 감염 효율 측면에서 높은 품질의. 참고: (중요) 피하 반복적인 동결/녹고 바이러스, 때문에 그것은 바이러스 성 저하로 연결</li>
	</ol></li>
	<li>GFP 기자를 포함 하는 바이러스의 적정
	<ol>
<li>씨앗 DMEM의 300 µ L에 1 × 105 NIH/3T3 세포 10% FBS 24-잘 접시에 잘 당. 7 웰 스 한 바이러스 titer에 채택 될 것입니다.</li>
		<li>37 ° C에서 바이러스를 해 동 하 고 추가 1, 5, 10, 50, 100 그리고 500 µ L 바이러스 NIH/3T3 문화. 추가 하지 마십시오 어떤 바이러스 부정적인 제어에 잘. 37 ° c.에서 48 h에 대 한 바이러스의 세포 배양</li>
		<li>NIH/3T3 세포의 트립 신/EDTA (ethylenediaminetetraacetic 산) 30 µ L를 사용 하 여 수확 (0.25 %Trypsin, PBS에 0.01 %EDTA) FACS (형광 활성화 된 세포 분류) 튜브에 250 µ L PBS에 셀을 배치 하 고.</li>
		<li>각 샘플24cytometry 여 GFP+ 세포의 주파수를 결정 합니다. Hoechst 33258 같은 생존 염료의 추가 의해 죽은 세포를 제외 합니다.</li>
		<li>GFP+ (도금된 셀 수와 GFP+ 세포의 비율에 따라), 세포의 총 숫자를 계산 하 고 바이러스 감염에 대 한 사용의 볼륨에 대 한 플롯. 참고: 감염의 (중요) 효율 도달 고원 큰 바이러스 성 복용량 적용 됩니다 때. 따라서, 그것은 효율성 선형 범위 (예를 들어 표 1에 표시 된)에서 발생 하는 어떤 감염에 바이러스 농도에 따라 titer를 추정 하는 것이 중요. GFP+ 셀 수 주어진된 바이러스 볼륨에서 기능 바이러스 성 입자 (TU-단위 변환)의 수를 나타냅니다. ML 당 투 수를 다시 계산.</li>
	</ol></li>
	<li>Puromycin 기자를 포함 하는 바이러스의 적정
	<ol>
<li>시드 3 ml DMEM의 5 × 104 NIH/3T3 세포 10% FBS 6 잘 플레이트;에 잘 당 6 우물 titer 1 바이러스를 사용 합니다. 37 ° c.에 하룻밤 문화</li>
		<li>표 2에 표시 된 대로 다음 날 바이러스 희석. 바이러스, 희석을 사용 하 여 미리 따뜻하게 DMEM 10 %FBS. 와 동 하지 마십시오.</li>
		<li>NIH/3T3 세포에서 문화 매체를 제거 하 고 희석된 바이러스의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>부드럽게 바꿉니다 바이러스 포함 된 매체 미리 따뜻하게 DMEM의 2 mL 10 %FBS, 고 37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>부드럽게 NIH/3T3 매체를 바꿉니다 미리 따뜻하게 DMEM 10 %FBS 포함 puromycin (2 µ g/mL)의 2 mL.</li>
		<li>37 ° C 그리고 puromycin 매 3 일을 신중 하 게 새로 고침 매체 또는 중간 노란색에 문화.</li>
		<li>감염 후 10-12 일, 각 우물에서 매체를 발음 하 고 PBS로 부드럽게 씻어.</li>
		<li>크리스탈 바이올렛 솔루션 (20% 에탄올과 dH2O 0.5% 크리스탈 바이올렛)의 1 mL와 stain RT, 2 분 하 고 신중 하 게 PBS와 두 번 씻어.</li>
		<li>각 잘 (X4 확대) 현미경에 파란색 식민지를 계산 합니다. 아니 식민지 부정적인 제어에 잘 관찰 해야.</li>
		<li>TU/mL 희석 요인 고려의 총 숫자를 계산 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 확장 및 32D/G-CSF-R 셀의 유지 보수
<ol><li>32D/G-CSF-R 셀이 고정 되어 있으면 한 약 수 1 분 동안 37 ° C 물 욕조에 세포를 해 동 하 고 10% 보충 미리 따뜻하게 RPMI 1640 매체의 10 mL에 직접 유리병에서 세포를 부 어 15 mL 튜브에서 FBS. 튜브 3 시간 및 400 × g.에 아래로 셀 스핀 반전 상쾌한을 제거 하 고 0.3 × 106 셀/mL의 농도에서 IL-3 포함 문화 매체에 셀 resuspend.</li>
	<li>최적의 세포 성장 농도 0.25-0.5 × 106 셀/mL. 0.1-0.2 × 10의 농도에 그들을 데리고 2 일 마다 셀 분할6 셀/mL. 참고: (중요) 32D/G-CSF-R 셀 부분적으로 그들의 능력을 1 × 106 셀/mL 이상의 농도에 성장 하는 경우를 차별화 하를 잃을 수 있습니다. 따라서, 그것은 매우 시간에 32D/G-CSF-R 셀을 분할 하는 것이 중요입니다.</li>
	<li>필요에 따라 동결 하 고 오랜 기간-80 ° C에 또는 액체 질소에 대 한 셀 aliquots를 저장 합니다. 3 × 106 셀 아래로 회전 시키십시오, 상쾌한, 제거 하 고 냉동 매체의 1 mL에 resuspend. 튜브-80 ° c.에는 냉동 컨테이너에 배치 장기 저장을 위해 액체 질소를 셀 위치를 변경할.</li>
</ol>3. 32D/G-CSF-R 셀의 변환
<ol><li>0.3 × 106 셀/mL의 농도에서 6 잘 플레이트에 플레이트 32D/G-CSF-R 셀.</li>
	<li>10과 40 사이 나 (감염의 다양성)에 도달 하는 바이러스의 적절 한 금액을 추가 합니다. 참고: 높은 MOI는 GFP+ 세포의 증가 비율으로 관심사의 유전자의 표현의 상부에서 발생 합니다. 10;의 나와 셀 0.3 × 106 감염 예: 3 × 106 화 32D/G-CSF-R 셀에 추가 해야 합니다.</li>
	<li>최종 농도 8 µ g/mL에 polybrene를 추가 하 고 37 ° c.에 6 h에 대 한 품 어 또는 스핀 접종 절차: 스윙 양동이 터를 사용 하 여 자란 접시에 30 ° C에서 90 분 동안 1200 × g에서 원심 고 37 ° c.에 3 h에 대 한 품 어</li>
	<li>수집 셀, 15 mL 튜브에 전송 하 고 5 분 (4 ° C) 450 × g에서 회전.</li>
	<li>상쾌한, 수송과 세포 배양의 6 ml에서 resuspend, T25 세포 배양 플라스 크, 고 37 ° c.에서 문화에</li>
	<li>48 h 후, 세포를 수확 하 고 5 분 (4 ° C) 450 × g에서 그들을 회전. 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>GFP 기자 경우: 500 µ L 흐름 cytometry 정렬을 사용 하 여 PBS 및 정렬 GFP+ 셀의 셀 배치. Puromycin 기자 벡터를 포함 하는 경우: puromycin의 2 µ g/mL를 포함 하는 배양 세포 에서도.</li>
	<li>추가 분석 및 실험에 대 한 필요에 따라 셀을 확장 합니다. 참고: (선택 사항) Transduced 셀 미디어-80 ° C에서 냉동 컨테이너에서에 냉동 고 추가 액체 질소에 저장 될 수 있습니다.</li>
</ol>4. 32D/G-CSF-R 세포 확산 분석 결과
<ol><li>확산 속도 0.2 × 106 세포 배양의 1ml에 평가 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어를</li>
	<li>셀의 수를 계산 하는 다음 날 고 문화 매체를 사용 하 여 0.2 × 106 셀/mL의 농도에 다시 그들을 희석. 37 ° c.에서 밤새 품 어 세포 농도 및 표 3를 사용 하 여 매일 문화에 적용 하는 희석의 기록을 유지.</li>
	<li>로 확산 평가 하는 데 필요한 많은 일에 대 한 4.2 단계를 반복 합니다. 참고: 확산 분석 실험의 길이 관심사의 유전자의 영향에 따라 달라 집니다. 강한 형의 경우 8-9 일 (참조 그림 3A)는 상당한 효과 관찰 하기에 충분 한 수 있습니다. 그러나, 가벼운 표현 형의 경우 오랜 시간 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>표 3에 표시 된 대로 확산 곡선을 함으로써 세포 성장을 평가 합니다.</li>
</ol>5. 32D/G-CSF-R 세포 감 별 법 분석 결과
<ol><li>0.2 × 106 32D/G-CSF-R 세포 cytokines 없이 RPMI 매체와 두 번 씻는 다. 참고: 문화 G-CSF의 추가 하기 전에 세척 단계 중요 하다, 때문에 잔여 일 3의 존재는 차별화를 억제 수 있습니다.</li>
	<li>1 mL 차별화 매체 (100 ng/mL G-CSF 포함)는 24 잘/접시 셀 농도 0.2 × 106 셀/mL (0 일)의 결과에 셀을 배치 합니다. 37 ° c.에 하룻밤 문화</li>
	<li>셀/mL (1.2.1 단계) 위에 표시 된의 수를 계산 합니다.</li>
	<li>Cytospin 2-5 × 104 셀 (76 X 26 mm) 유리 슬라이드에 20 × g에서 필요한 어댑터와 원심 분리기를 사용 하 여.</li>
	<li>24 잘/접시 (1 일)에 0.2 × 105 셀/mL의 농도에서 차별화 매체와 플레이트 셀을 새로 고칩니다. 오래 된 접시를 삭제 하 고 날 새로운 플레이트 5.6 단계를 진행.</li>
	<li>2 ~ 7 일에 5.3-5.5 단계를 반복 합니다. 단계 4에서에서 설명한 G-CSF의 세포 증식을 평가 합니다. 참고: (중요) 차별화, 동안 세포 증식 속도가 느려집니다, 따라서 G-CSF의 3 ~ 4 일 후 그것은 높은 농도에 문화 세포에 적절 한.</li>
	<li>셀 형태에 따라 32D/G-CSF-R 세포의 분화 상태를 평가 합니다.<ol>
<li>RT 5 분에 대 한 메탄올에 5.4 단계에서 셀을 수정 하 고 건조를 슬라이드를 둡니다. 참고: 하루 0 ~ 7에서에서 슬라이드에 RT, 저장 고 동시에 고정 될 수 있습니다. 마찬가지로, 그들은 또한 보관할 수 있습니다 RT에 고정 후 오랜 동안.</li>
		<li>5 월-그 룬 발트 Giemsa 얼룩 다음 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 셀을 얼룩.</li>
		<li>확대 X40 및 현미경을 사용 하 여 얼룩진된 셀을 시각화.</li>
		<li>계량 수 폭발, 판매인 차별화 된 세포와 성숙한 granulocytes 설명 그림을 사용 하 여 그림 1 과 표 4에 설명.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

실험적인 모델의 연구의 주요 문제 중 하나입니다. 기본 인간과 동물 세포 가장 생물학적으로 관련 데이터를 생산으로, 이러한 모델 윤리적 우려를 포함할 수 있습니다 고은 종종 비싼 및 정교한 분리/배양 절차와 관련 된. 1 차 셀 숫자에 제한 됩니다 그리고 유전자 조작 하기 어렵다. 또한, 1 차 셀 데이터 해석29을 복잡 하 게 수 있습니다 다양 한 세포 유형의 구성 유형이 다른 인구를 대표 한다. 대조적으로, 셀 라인 생물학 물자의 거의 무제한 소스 제공, 비용 효과, 고을 윤리적인 문제를 무시할. 그러나, 그것은 라인 유전자 수는 근원의 그들의 조직에서 다 phenotypically 인공 실험 시스템 간주 됩니다 해당 셀을 고려 하는 것이 중요. 그럼에도 불구 하 고, 셀 라인 다른 실험적인 접근법과 결합 될 때, 재현할 수 및 생물학 관련 데이터의 생성에 대 한 유용한 모델을 제공 합니다.
32D cl-3 셀 뿐 아니라 32D/G-...

조 혈 줄기 및 조상 인구 유기 체 세포 (호 중구, 호 산 구는, basophils, 및 monocytes) 골수성 계보에서를 포함 하 여 성숙한 셀의 큰 범위를 제공 합니다. Myelopoiesis, 조 혈 줄기 세포에서 골수성 세포의 생산을 구동 하는 과정 이라고 변화 하는 요구에 대 한 응답에서 골수성 세포로 성숙의 적절 한 생산 이며 스트레스와 유기 체의 적절 한 대처에 대 한 전제 조건 조건, 감염 등 혈액 손실입니다. 성숙한 골수성 세포의 부족 한 생산 병원 체, 감소 된 혈액 응고, 및 다른 생명을 위협 조건1,2를 발생할 수 있습니다. 또한, 골수성 혈통 개발에서 변경 관련 혈액 악성 종양, 급성 골수성 백혈병 (AML)3등 된 수도 있습니다. Myelopoiesis 변경 결함 세포 표면 수용 체4, 녹음 방송 요인5, 변경된 식에에서 장애 신호 경로6, 변이 형성의 결과로 같은 다양 한 이유로 인해 발생할 수 있습니다 / 7oncogenes 또는 종양 억제기 유전자8의 비활성화의 활성화.
다양 한 방법은 골수성 개발, 연구 하 고이 과정에서 특정 유전자 변경의 영향을 평가 개발 되었습니다. Myelopoiesis를 공부 하는 데 사용 하는 일반적인 방식 기본 세포와 유전자 변형 쥐를 포함 한다. 이러한 모델 생물학 관련 데이터의 수집을 허용, 하지만 그들은 특정 제한이 있다. 일차 전지를 사용 하 여 셀의 수를 제한 및 변경 유전자 발현 및 후속 생물 학적 또는 생화학 분석 가능성을 축소 하는 문화의 제한 기간 발생 합니다. 유전자 변형 쥐 비용이 고 생물 칭의의 합리적인 학위 필요. 또한, vivo에서 모델 작업 지정된 된 프로세스에 관심사의 유전자의 역할을 이해 복잡성의 정도 추가 합니다. 따라서, 이러한 제한을 우회 하는 대체 접근 필요 합니다. 셀 라인 명백한 이점이 있다: (1) 그들은 생 화 확 및 생물 학적 연구에 대 한 충분 한 자료를 생성 수 무제한 확산 능력을가지고, (2) 그들은 (최저, 녹아웃, 유전자 조작에 취약 overexpression), (3) 비용은 상대적으로 낮은, 그리고 (4) 그들은 생물 학적 단순화 특정 실험적인 접근에 필요한 정도의 허용.
부모의 일 3 (인터 루 킨-3) 종속 32D 셀 라인에서 친구 murine 백혈병 바이러스9C3H/HeJ 마우스 골 수 세포의 감염에 의해 Greenberger와 동료에 의해 1983 년에 설립 되었다. 여러 32D 클론 문학에서 설명 했다: cl-239, cl-310및 cl 1011. 32D cl-3 셀 IL 3에 증식 하 여 치료 granulocyte-콜로 니 자극 인자 (G-CSF)10시 neutrophilic 차별화를 받아야 표시 했다. 그와 반대로, 32D cl-10의 세포, IL-3 의존 하면서 원래 했다 하지 차별화 G-CSF 치료에 대 한 응답. 1995 년에 박사가 보 Touw의 그룹 retrovirally이 수용 체11의 기능적으로 중요 한 영역을 식별 하기 위해 야생 종류와 돌연변이 형태의 G-CSF 수용 체 (G-CSF-R) 32D cl-10 셀을 불리고. 이 연구 결과 마찬가지로 IL 3에 의존, 32D/G-CSF-R 세포의 생성 하지만 IL-3 G-CSF의 교체 후 6 ~ 10 일 이내 셀 격 증 하 고 irreversibly 성숙한 호 중구로 차별화를 중지 합니다. 이러한 속성 32D cl-3 및 2 개의 잘 정의 된 성장과 감 별 법 요인-일 3 G-CSF로 변조 수 murine neutrophilic 차별화의 32D/G-CSF-R 셀 단순화 된 모델을 확인 합니다. 지난 십년 동안 여러 그룹 사용 32D/G-CSF-R 셀 확산에 특정 유전자의 역할 및 문화12,13,,1415 에 골수성 세포의 분화 연구 , 16, 그리고 G-CSF 신호17,18공부 하. 중요 한 것은,이 셀 라인을 사용 하 여 얻은 결과 기본 세포와 유전자 변형 마우스16,19,,2021얻은 데이터와 상관 된다. 따라서, 우리가 널리 사용 하 고 잘 설립 모델, 32D/G-CSF-R 셀 골수성 차별화 병행이이 문제를 해결 하는 다른 접근에 사용 될 수 있는 연구에 귀중 한 시스템 대표 믿습니다.
여기, 상세한 프로토콜 32D/G-CSF-R 셀 라인의 처리를 설명 하는 커버 확장, 차별화, 및 확산의 평가 및 이러한 셀의 제공 됩니다. 32D/G-CSF-R 세포의 유전 수정에 대 한 자세한 정보를 retroviral 또는 lentiviral 변환 뿐만 아니라 바이러스 적정에 대 한 프로토콜에 의해 제공 됩니다. 또한, 32D/G-CSF-R 세포의 잠재적인 응용 프로그램을 보여 주는 몇 가지 대표적인 결과 제공 됩니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 분말 배지</td><td>Merck, Kenilworth, NJ, USA</td><td>T 121-10</td><td>, NaHCO3 없음, L-글루타민</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>포함 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 환원 혈청 배지</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>31985-047</td><td>L-글루타민, 페놀 레드</td></tr><tr><td>태아 소 혈청(FBS)</td><td>PAA Laboratories(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)</td><td>MT35011CV</td><td>32D/G-CSF-R 세포</td></tr><tr><td>태아 혈청(FBS)</td>의 분화를 위해 <td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10270</td><td>HEK293T, NIH3T3, BOSC23 세포 배양에 사용</td></tr><tr><td>페니실린</td><td>시그마-알드리치(미국 뉴저지주 케닐워스 머크)</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치(미국 뉴저지주 케닐워스 머크)</td><td>S9137</td><td>스트렙토마이신 황산염 분말</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>murine IL-3</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>human G-CSF</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td><td>23966</td><td>Linear, MW 25,000 (PEI 25000)</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, 미국 뉴저지)</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>VWR Chemicals, Radnor, PA, USA</td><td>0458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; nwald Giemsa</td><td>DiaPath, Martinengo, BG, 이탈리아</td><td>10802</td><td></td></tr></tbody></table>

확산 및 murine 골수성 전조 32d/g-csf-r의 셀

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

조 혈 줄기와 조상 세포 생물학의 이해 재생 의학 및 혈액 병 리 치료에 대 한 중요 한 의미를 갖는다. 가장 관련성이 높은 데이터를 취득 될 수 있다 vivo에서 모델 또는 기본 문화권을 사용 하 여에 불구 하 고 조 혈 줄기와 조상 세포의 낮은 풍부 상당히 그들의 조사에 대 한 적합 한 기술을 풀을 제한 합니다. 따라서, 세포의 사용 검사 또는 큰 휴대 번호를 필요로 하는 분석의 성능에 대 한 생물학 자료의 충분 한 생산을 수 있습니다. 여기 자세한 설명, 판독, 및 myelopoiesis 및 neutrophilic 분화에 관련 된 프로세스의 조사를 위해 사용 되는 확산 및 감 별 법 분석 실험의 해석 하는 것이 선물이. 이러한 실험 32D/G-CSF-R cytokine 종속 murine 골수성 세포 선, IL-3의 확산 및 G-CSF 차별화 능력을 보유 하 고 사용 합니다. 32D/G-CSF-R 셀을 처리 하기 위한 프로토콜 최적화 제공 하며 주요 함정 및 기술된 분석 및 예상된 결과 손상 시킬 수 있는 단점에 대해. 또한,이 문서 lentiviral retroviral 생산, 적정, 및 32D/G-CSF-R 셀의 변환에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 이 세포의 유전자 조작 기본 조 혈 줄기와 조상 세포 또는 vivo에서 모델 결과 보완할 수 있는 기능과 분자 연구를 성공적으로 수행을 채택 될 수 있다 설명 합니다.

확산 및 32D/G-CSF-R 세포의 분화
32D/G-CSF-R 프로 증식 및 프로 차별화 조건 하에서 세포의 확산을 평가, 32D/G-CSF-R 셀 IL 3, G-CSF, 각각 포함 된 미디어에서 경작 했다. IL-3 포함 매체 (10 ng/mL)에 경작 하는 세포 (그림 2A) 약 24 시간 모든 분할 관찰 되었다. G-CSF (100 ng/mL) 확산 점차적으로 감속 하 고 4 일 (그림 2A) 후 중지와 IL-3의 교체 시. 또한, G-CSF cytospun 5 월-그 룬 발트 Giemsa 얼룩 세포를 사용 하 여 존재 배양 세포의 분화 상태 평가 했다. 그것은 하루 0 (G-CSF 치료의 시작) 전에,에 셀 미 숙 myeloblast 같은 형태학, 큰 핵...

여기 자세한 위한 프로토콜 murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R 셀 라인 경작, 수행 하는 바이러스 성 감염, 확산 및 감 별 법 분석 실험 수행 되 게 됩니다. 이 셀 줄은 골수성 세포 개발, 골수성 세포 성장 및 neutrophilic 분화의 유전자의 역할을 공부 하 고 적합 합니다.

확산 및 Murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R의 셀

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

본 실험의 전반적인 목표는 마우스 골수성 32D-G-CSF-R 세포에서 관심 유전자를 과발현 또는 억제시켜 유전적으로 변형하고, 이러한 변화가 해당 세포주의 증식 및 중성구 분화에 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이 방법은 관심 단백질이 골수성 전구 세포의 성장 및 분화에 어떻게 관여하는지와 같은 혈액학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 세포주의 주요 장점은 무제한의 증식 능력을 갖추고 있으며, 유전적 조작이 용이하고, 비용이 상대적으로 저렴하며, 특정 실험적 접근 방식에 필요한 어느 정도의 생물학적 단순화를 가능하게 한다는 점입니다. 오늘 이 절차를 시연할 사람은 제 실험실의 박사 과정 학생인 Petr Danek입니다.열-불활성화된 10% 소태아혈청과 10 nanograms per milliliter의 murine interleukin-3가 첨가된 RPMI-1640 배지 250 milliliters를 준비합니다. 그런 다음 분화 배지 50 milliliters를 준비합니다.16cm 페트리 접시에 10% fetal bovine serum이 첨가된 18mL DMEM 배지를 넣고 Bosc23 세포의 단일 세포 현탁액을 분주합니다. 세포 합류도가 80%에 도달할 때까지 약 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 MSCV 레트로바이러스 컨스트럭트, PCL-echo 패키징 벡터, poly-ethylenimine 및 항생제가 없는 저혈청 배지를 혼합합니다. 이 혼합물을 Flowbox 내의 실온에서 20분 동안 배양합니다. 이후 Bosc23 세포 배양액을 37°C로 예열된 2% fetal bovine serum 첨가 DMEM 배지 16mL로 조심스럽게 교체합니다. 다음으로, 레트로바이러스 혼합액을 Bosc23 세포 위에 한 방울씩 떨어뜨려 첨가합니다. 그런 다음 배양물을 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.배양이 끝나면 Bosc23 배양액을 흡입하여 제거하고, 10% fetal bovine serum이 함유된 예열된 DMEM 배지 18 milliliters를 첨가합니다. 세포를 37 degrees Celsius에서 48시간 동안 배양합니다. 25 milliliter serological pipette을 사용하여 Bosc23 바이러스가 포함된 배지를 50 milliliter conical tube에 옮겨 담습니다. 튜브를 4 degrees Celsius에서 보관합니다. 그 후 Bosc23 세포에 10% fetal bovine serum이 함유된 예열된 DMEM 배지 18 milliliters를 첨가하고 세포를 24시간 동안 배양합니다. 바이러스 상층액을 4°C에서 1,500 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 그다음 바이러스를 소분하여 액체 질소로 급속 냉동시킨 후 -80°C에서 보관합니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 3mL의 DMEM 배지를 사용하여 하나의 바이러스를 타이터링하기 위한 NIH/3T3 세포를 분주합니다. 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 바이러스 입자를 볼텍싱하지 않고 미리 데워둔 배지로 바이러스를 희석합니다. NIH/3T3 세포에서 배양액을 흡입하여 제거하고, 각 웰에 희석된 바이러스 1mL를 첨가합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 희석된 바이러스 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고 10% 소태아혈청이 함유된 DMEM 배지 2mL로 교체한 후, 다시 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 기존 배지를 흡입하여 제거하고 2µg/mL 푸로마이신(puromycin)이 함유된 DMEM 배지로 교체합니다. 3일마다 또는 배지가 노랗게 변할 때마다 푸로마이신이 함유된 신선한 배지로 교체하며 세포 배양을 계속합니다.감염 후 10일에서 12일 사이에 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 인산완충식염수로 가볍게 세척합니다. 그다음 실온에서 1mL의 크리스탈 바이올렛 용액으로 2분 동안 염색합니다. 염색 후 인산완충식염수로 조심스럽게 두 번 세척합니다. 현미경 하에서 각 웰에 존재하는 청색 콜로니의 총 개수를 측정합니다.6-웰 플레이트에 32D-G-CSF-R 세포를 접종합니다. 감염 다중도(multiplicity of infection) 10에서 40 사이로 바이러스를 첨가합니다. 그다음 polybrene을 최종 농도가 8 µg/mL가 되도록 세포에 첨가하고 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다. 배양 후, 세포를 15 mL 튜브에 모으고 4 °C에서 450 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 32D 세포는 1 × 10⁶ cells/ml 이상의 농도로 성장할 경우 분화 능력을 부분적으로 상실할 수 있으므로, 제때 세포를 분할하고 배양액이 과성장하지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다.상층액을 제거하고, 열불활성화된 10% fetal bovine serum과 10 nanograms per milliliter의 murine interleukin-3가 첨가된 6 milliliters의 RPMI-1640 Medium이 담긴 T25 배양 플라스크에 세포를 재현탁한다. 세포를 37 °C에서 48시간 동안 배양한다.사이토카인이 포함되지 않은 RPMI-1640 배지로 32D-G-CSF-R 세포를 2회 세척합니다. 그런 다음 0일 차에 24-웰 플레이트의 1 mL 분화 배지에 세포를 접종하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 세포가 성숙한 과립구로 분화하는 데는 7~9일이 소요됩니다. 이후 trypan blue를 사용하여 죽은 세포를 제외한 세포 수를 측정합니다. IL-3가 분화 과정을 억제할 수 있으므로, 세포를 GCSF에서 배양하기 전에 사이토카인의 모든 흔적을 제거하는 것이 절대적으로 중요합니다. 필요한 어댑터를 장착한 원심분리기에서 20 ×g로 5분 동안 세포를 유리 슬라이드에 사이토스핀(Cytospin)합니다. 그 다음, 상온에서 메탄올로 5분 동안 세포를 고정하고 세포를 건조시킵니다. 제조사의 프로토콜에 따라 May-Grunwald Giemsa 염색법을 사용하여 세포를 염색합니다. 염색이 완료되면, 40배율로 염색된 세포를 관찰합니다.세포 형태를 기반으로 염색된 세포 중 모세포(blast), 중간 분화 세포 및 성숙 과립구의 수를 정량화하십시오.여기에 interleukin-3 및 granulocyte colony stimulating factor 함유 배지에서 32D-G-CSF-R 세포의 증식을 보여주는 그래픽 표현이 제시되어 있습니다. x축은 처리 기간(일)을 나타내며, y-axis는 로그 스케일의 세포 수를 나타냅니다. 검은색 플롯은 세포를 interleukin-3 함유 배지에서 배양했을 때의 증식을 보여줍니다. 파란색 플롯은 granulocyte colony stimulating factor 함유 배지에서 배양했을 때 세포 증식이 감소했음을 보여줍니다.여기에 과립구 colony 자극 인자가 포함된 배지에서 32D-G-CSF-R 세포의 비율과 분화 형태를 보여주는 대표적인 파이 차트와 May-Grunwald Giemsa 염색 결과가 제시되어 있습니다. 파이 차트는 과립구 colony 자극 인자 처리 후 0일, 2일, 4일, 6일째의 모세포, 중간 분화 세포 및 호중구의 비율을 보여줍니다. 0일째의 Giemsa 염색 세포는 크고 특징적인 핵과 어두운 세포질을 가지고 있습니다. 6일째에는 핵의 크기가 감소하고 세포질은 확대되었으나 어둡지 않습니다.여기에 제시된 대표적인 파이 차트는 과립구 집락 자극 인자가 포함된 배지에서 대조군 MSCV 벡터와 비교하여 BCR-ABL 융합 단백질을 형질전환시켰을 때 모세포(blast cells)의 비율이 더 높게 나타남을 보여줍니다. 하단 패널의 Giemsa 염색 결과는 대조군 또는 BCR-ABL 융합 단백질을 형질전환시킨 세포의 대표적인 모습입니다.MSCV 대조군 벡터를 도입한 세포는 6일째에 호중구 분화가 일어났으나, BCR-ABL을 도입한 세포는 대부분 모세포(blast cells) 형태를 보였으며 성숙한 호중구는 관찰되지 않았습니다.이 기술을 완전히 익히면, 적절하게 수행했을 때 이틀 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 32D-G-CSF 수용체 세포를 명시된 농도로 배양하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 절차 이후에는 추가적인 질문에 답하기 위해 이동 분석(migration assays) 및 생존 실험과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 렌티바이러스 및 레트로바이러스 도입을 통한 유전자 조작, 증식, 분화, 그리고 이 세포들의 증식 및 분화 평가를 포함하여 32D-G-CSF 수용체 세포주를 다루는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 바이러스를 다루는 것은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 보호 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

proliferation-differentiation-murine-myeloid-precursor-32dg-csf-r

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

이 프로토콜은 태아의 척추 코드에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유래를 설명하고 이식이나 oligodendrocytic 혈통의 연구 중 체외 유지.

E13 생쥐에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유도

이 동영상은 다분화능 골수 기질 세포(BMSC)에서 슈반 세포 유사 세포를 얻는 방법을 보여줍니다. 초기에 BMSC는 저산소증(hypoxia) 치료를 받은 후 신경 전구 세포(neuronal progenitor cell)로 직접 분화합니다. 그 후, 특정 배지 및 배양 조건을 사용하여 이러한 전구 세포가 슈반 세포와 같은 세포로 형질전환을 유도합니다.

골수 기질 세포에서 Schwann 세포 유사 세포 생성

이 프로토콜은 FACS - 매개 세포 분리, 유체 역학적 유전자 전달하고, Peyer의 패치 면역 부분 집합의 흐름 분석과 관련된 기술을 사용하여, 일반적인 돌기 세포의 전구 세포에서 Peyer의 패치 plasmacytoid 수지상 세포의 분화를 평가하는 실험 절차에 대해 설명합니다.

조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가

이 연구에서는 Flt3 리간드가 있는 상태에서 AC-6 공급세포와 공통 림프구 전구세포를 공동 배양하여 pDC를 효율적으로 생성할 수 있는 체외 배양 시스템을 제시합니다.

AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

골수 내에서 골수 간질 세포 (MSC)가 존재합니다. 우리의 프로토콜은 hypoxic preconditioning을 통해 세포의 인구를 풍요롭게하고 이후 그들이 성숙한 Schwann 세포가되도록 지시합니다.

성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리

여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

여기서, 우리는 4개의 골수성 혈통에 제대혈 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성 및 사이토카인 유도분화를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 적용은 CD34+ 세포의 골수성 분화에 대한 골수성 질환 돌연변이 또는 소분자의 영향에 대한 조사를 포함한다.

인간 코드 혈액 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 범골수성 분화

여기에서는 신선한 마우스 골수 및 비장에서 직접 조기 파열 형성 단위 적혈구 (BFU-e) 및 콜로니 형성 단위 적혈구 (CFU-e) 전구 세포를 전향 적으로 분리하기위한 새로운 유세포 분석 방법을 설명합니다. 단일 세포 전사체 데이터를 기반으로 개발된 이 프로토콜은 조직의 모든 적혈구 전구체를 고순도로 분리한 최초의 프로토콜입니다.

유세포분석에 의한 마우스 조직으로부터 파열 형성 단위 및 콜로니 형성 단위 적혈구 전구체의 식별 및 분리

학습하세요 murine 골수성 전구세포 32D/G-CSF-R의 배양, 바이러스 감염, 증식 및 분화 분석 방법을. 이 기법은 유전자 조작이 골수세포 발달에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

확산 및 Murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R의 셀

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