Name: 샘플 저장소 암 바이오 마커의 평가를 위한 유용한 툴으로 말린 혈액 및 혈 청 관광 명소 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 학습하세요 말린 혈액 및 혈청 관광 명소 기법을 이용하여 생체표지자를 평가하는 방법을. 이 기술은 냉동 없이 2주 이상 샘플을 보관할 수 있어 암 및 감염병 진단 연구에 활용됩니다.

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우리는 편집에 Gráinne Tierney를 감사 하 고 싶습니다.

말 초 혈액 및 혈 청 수집 하 고 건강 한 기증자와 환자는 연구에 참여를 서 면된 동의 준에서 저장 했다. 연구 프로토콜 1964 헬싱키 선언에서 윤리적인 표준 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. DBS에서 혈액 저장
<ol><li>
혈액 샘플 컬렉션
	<ol>
<li>Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 5.4 mg와 3 mL 튜브에 주변 혈액 샘플의 3 mL를 수집 합니다. 참고: 가능 한 한 빨리 DBS로 및 8 h 내 주변 혈액을 저장 합니다.</li>
		<li>보호기 카드의 하단 오른쪽 모서리에 환자 번호를 작성 합니다.</li>
		<li>신중 하 게 혈액 5 mL 피 펫으로 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DBS에 혈액
	<ol>
<li>플라스틱 및 50-200 µ L 팁 보호기 카드 (자료 테이블)에 혈액 (50 µ L)의 한 자리를 전달.</li>
		<li>1.2.1 단계를 반복 합니다. 총 3-5 핏 자국을 하십시오. 오래 된 팁 삭제 하 고 각 혈액에 대 한 새 aliquot.</li>
		<li>오픈 비 흡수 성 표면에 직접적인 햇빛을 피하는 DBS는 수평 위치에 실 온에서 건조 하룻밤 둡니다. 보호기 카드의 표지 혈액 건조 촉진을 열어 둡니다. 참고: 어떤 미 립 자 공기 또는 먼지가 건조 단계에서 다운스트림 응용 프로그램 영향을 주지 않습니다.</li>
		<li>사용까지 방 습 제와 비닐 봉투에서 실내 온도에 카드를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA 추출 DNA 추출 킷 데이터 시트 (말린된 핏 자국에 대 한 단원)에 따라 DBS에서 시작
<ol><li>
샘플 준비
	<ol>
<li>카드에서 3 건된 핏 자국을 사용 합니다. 각 카드에서 말린된 혈액 명소 고 족집게로 카드에서 그들을 분리. 작은 조각 (약 1 m m의 직경)으로 분리 된 건된 핏 자국을 잘라.</li>
		<li>1.5 mL 원심 분리기 튜브에 작은 조각을 놓으십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플 소화
	<ol>
<li>세포의 용 해 버퍼 튜브 키트 (자료 테이블)에서 제공 하는 1의 180 µ L를 추가 합니다. 가수분해 공화국의 20 µ L을 추가 카드를 발견 하는 혈액과 1.5 mL 튜브에 pipetting 전에 성분 k 세포의 용 해 버퍼 1를 혼합 하지 마십시오. Vortexing에 의해 혼합.</li>
		<li>thermoincubator에 튜브를 배치 하 고 60 분 동안 56 ° C에서 품 어. 경우는 thermoincubator 갖춘 되지 않습니다 통, 소용돌이 샘플 마다 10-15 분 이상 10 s, 샘플의 온도 감소 하도록 하지 돌. 짧게 원심 관 뚜껑에서 방울을 제거 하.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세척 단계
	<ol>
<li>200 µ L의 세포의 용 해 버퍼 2 (자료 테이블)와 10에 대 한 소용돌이 추가 s.</li>
		<li>Thermomixer 또는 온수 궤도 인큐베이터에 튜브를 놓고 10 분 동안 70 ° C에서 품 어. 경우는 thermoincubator 하지 통, 소용돌이 적어도 10 한 번 샘플 s, 샘플의 온도 감소 하도록 하지 돌.</li>
		<li>2.3.1 단계를 반복 합니다. 1.5 mL 튜브에서 차입 열 (자료 테이블) lysate의 400 µ L를 전송. 1 분 동안 6000 x g 열 원심</li>
		<li>새로운 2 mL 컬렉션 튜브로 차입 열을 놓고 오래 된 하나를 삭제 합니다.</li>
		<li>6000 x g 1 분 동안에 500 µ L의 워시 버퍼 1 (자료 테이블) 및 원심 분리기를 추가 합니다.</li>
		<li>새로운 2 mL 컬렉션 튜브로 열을 놓고 오래 된 하나를 삭제 합니다.</li>
		<li>6000 x g 1 분 동안에 500 µ L 워시 버퍼 2의 (테이블의 재료) 및 원심 분리기를 추가 합니다.</li>
		<li>새로운 2 mL 컬렉션 튜브로 열을 놓고 오래 된 하나를 삭제 합니다.</li>
		<li>막 건조 3 분 20000 x g에서 원심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
차입 단계
	<ol>
<li>새로운 1.5 mL 원심 분리기 튜브로 열을 놓고 컬렉션 튜브를 삭제 합니다.</li>
		<li>막의 중심에 증류수의 장소 50 µ L. 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
		<li>원심에서 20000 x g 1 분 수집 튜브는 eluate를 막의 중심에 다시 넣습니다.</li>
		<li>원심 분리기 튜브 20000 x g 에서 1 분에 대 한 폐기는 막.</li>
		<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 측정 합니다.</li>
		<li>사용까지-20 ° C에서의 저장소 DNA 참고: DBS에서 추출한 DNA 사용할 수 있습니다 SNP 평가 등 여러 가지 분석을 수행 하기 위해 실시간 PCR 또는 DNA 생어 시퀀싱에 의해.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 혈 청 스토리지 DSS에 대 한
<ol><li>
혈액 샘플 컬렉션
	<ol>
<li>7 mL EDTA 없이 7 mL 튜브에 주변 혈액 샘플을 수집 합니다. 실 온에서 30 분 동안 응고 혈액 샘플을 둡니다.</li>
		<li>보호기 카드의 하단 오른쪽 모서리에 환자 번호를 작성 합니다.</li>
		<li>혈액 샘플을 실 온에서 15 분 동안 980 x g 에서 원심 참고: 가능 한 한 빨리 DSS로 및 8h 이내 혈 청을 저장 합니다.</li>
		<li>조심 스럽게는 상쾌한 튜브에서 제거 하 고 새로운 15 mL 튜브에 그것을 전송. 신중 하 게 혈액 5 mL 피 펫으로 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DSS에서 야생 하는 혈 청
	<ol>
<li>플라스틱 고 혈 청 (50 µ L) 보호기 카드에의 한 자리를 전송. 3-5 피 관광 명소의 총에이 단계를 반복 합니다. 참고: 각 자리에 혈 청의 정확히 50 µ L 플라스틱을 매우 주의 해야 합니다. 혈 청 하지 카드의 점선에서 넘어가 야 한다.</li>
		<li>하룻밤 실 온에서 건조 하는 DSS를 둡니다. 보호기 카드의 표지 혈액 건조 촉진을 열어 둡니다.</li>
		<li>사용까지 방 습 제와 비닐 봉투에서 실내 온도에 카드를 저장 합니다. 저장은 14 일 이상,-20 ° c.에 카드를 저장</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ELISA 분석 결과 DSS에서 시작
<ol><li>
DSS에서 단백질 elute
	<ol>
<li>필요한 경우, 각 샘플에 대 한 DSS를 녹여. DSS (직경 약 1 m m) 작은 조각으로 잘라. PBS의 400 µ L 1.5 mL 튜브에 조각을 넣어.</li>
		<li>4 ° c.에 하룻밤 샘플을 흔들어 참고: 낮은 강도에서 그들을 흔들어. PBS는 동요 하는 동안 튜브의 커버를 젖은 하지 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절 한 희석 후 ELISA 키트 지침에 따라 분 비 단백질/성장 요인 분석에 대 한 혈 청 샘플으로 단백질 eluate를 사용 합니다. 참고:이 절차 DBP 탐지9잘 작동합니다. 다른 ELISA 분석 실험에 대 한 최적화 단계를 필요할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Bertagnolio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+drug+resistance+surveillance+using+dried+whole+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots.</a> Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).</li>
<li>Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+filter+paper+for+the+collection+and+analysis+of+human+whole+blood+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens.</a> J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).</li>
<li>Garrido, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype+variability%2C+virological+response+and+drug+resistance+assessed+on+dried+blood+spots+collected+from+HIV+patients+on+antiretroviral+therapy+in+Angola%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola.</a> J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).</li>
<li>Steegen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+detecting+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+in+DNA+extracted+from+whole+blood+or+dried+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots.</a> J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).</li>
<li>Costenaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+load+detection+using+dried+blood+spots+in+a+cohort+of+HIV-1-infected+children+in+Uganda%3A+correlations+with+clinical+and+immunological+criteria+for+treatment+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).</li>
<li>Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+glutathione+and+glutathione+disulfide+in+the+blood+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase-deficient+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns.</a> BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).</li>
<li>Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practice+in+the+measurement+and+interpretation+of+lysosomal+acid+lipase+in+dried+blood+spots+using+the+inhibitor+Lalistat+2%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2.</a> Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).</li>
<li>Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+25+inflammatory+markers+and+neurotrophins+in+neonatal+dried+blood+spots+by+immunoassay+with+xMAP+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology.</a> Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).</li>
<li>Amadori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+receptor+polymorphisms+or+serum+levels+as+key+drivers+of+breast+cancer+development%3F+The+question+of+the+vitamin+D+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway.</a> Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).</li>
<li>Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+hepatitis+B+virus+from+dried+blood+spots+by+polymerase+chain+reaction+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification.</a> J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).</li>
<li>Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+commercial+ELISA+for+the+detection+of+measles-specific+immunoglobulin+G+%28IgG%29+in+dried+blood+spots+collected+from+children+living+in+low-resource+settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings.</a> J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).</li>
<li>Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA-based+assay+for+IP-10+detection+from+filter+paper+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples.</a> Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).</li>
<li>St Julien, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+quality+genome-wide+genotyping+from+archived+dried+blood+spots+without+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification.</a> PLoS One. 8 (5), e64710(2013).</li>
<li>Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+fentanyl+analogs+in+dried+blood+spots+by+flow-through+desorption+coupled+to+online+solid+phase+extraction+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry.</a> Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

이 프로토콜은 실험실 직원 또는 혈액 샘플의 정확한 처리를 위해 필요한 인프라 없는 경우 필터 종이에 혈액 및 혈 청을 저장 하기 위한 잠재력을 조사 합니다. 특히, 전체 혈액 또는 혈 청 표준 튜브 또는 손가락 찌 르 기에 의해 수집 된이 메서드를 사용 하 여 저장할 수 있습니다 그리고 혈액 컬렉션 직후-20 ° C 또는-80 ° C에서 샘플을 동결 필요가 없습니다. DBS/DSS/혈 무결성에 어떤 변화 없이 최대 14 일 동안 실내 온도에 유지 수 있습니다. 저장소에 대 한 중요 한 문제가 온도 보다 더 많은 생물 학적 재료의 특성에 영향을 미치는 수 분의 존재 이다. 방 습 제와 함께 비닐 봉지를 사용 하 여이 문제를 방지할 수 있습니다. 카드 비닐 봉지 안에 수 분이 저장 동안 문제가 된다. 미 립 자 공기/방울/먼지 또는 습기에서에서 발생 하는 문제 되지 야간 보육10동안 관찰 되었다. 우리는 이전 사용 필터 종이를 이탈리아와 아프리카 동료11<...

암 바이오 마커를 연구의 주요 목표는 새로운 생물 학적 진단, 예측 환자의 예 후 및 환자는 특정 치료에 응답 여부를 확인 하기 위해 사용할 수 있는 매개 변수 id입니다. 이 연구 분야는 혁신적인 암 치료의 발견에 대 한 기본 이며 맞춤형된 치료에 중요 한 역할.
바이오 마커 식별 및 유효성 검사의 각 단계 동안 수행 하는 절차는 안정적이 고 재현 되어야 합니다. 변환 연구의 성공 위한 초석 혈액 및 혈 청 등 생물 샘플의 올바른 스토리지입니다. 이것은 분자 생물학 실험 또는 단백질 분석 실험을 수행 하는 데 사용할 수 있는 고품질 생물 학적 자료를 얻기 향한 첫 번째 단계입니다.
강력한 데이터를 얻기 위해 충분 한 환자를 모집 하 되 연구 필요는 합니다. 모든 학회-80 ° C에서 샘플을 저장할 수 또는 드라이 아이스에 다른 국제 센터에 샘플을 보낼 수 있습니다. 혈액 컬렉션에 대 한 필터 종이 사용 하 여 혈액 및 혈 청을 저장 하기 위한 간단한 방법 이며 샘플1,2의 즉시 동결을 요구 하지 않는다. 종이, 건조 하룻밤 왼쪽 및 실내 온도1,2에서 최대 14 일 동안 저장 후에 한 방울의 혈액 또는 혈 청을 발견하실 수 있습니다. 이 연구원은 다른 실험실에 샘플을 보낼 시간을 제공 합니다. 말린된 피를 사용 하 여 명소 (DBS) 그리고 말린된 혈 청 반점 (DSS) 따라서 선진국과 개도국에서 기관 간의 협력을 단순화 수 있습니다.
사용의 용이성을 감안할 때, DBS 샘플링은 널리 이용 된다 분석 실험의 여러 종류에 serological 또는 유전 다운스트림 분석에 대 한. 예를 들어 과거에는, DBS 했다 자주 사용 에이즈 개발 도상국1,2,3,,45에 상영. 이 저장 방법의 또 다른 장점은 손가락-거 시기, 따라서 테스트 6,,78을 심사 하는 신생아에 대 한 그것의 사용에서 혈액 샘플을 수집할 수 있습니다. 쉬운 샘플 처리 및 전송은 특히 원격 사이트에서 수집 된 샘플에 대 한 DBS의 이점이 더 실험실 장비입니다. 이전 발행물에서 DBS와 DSS 백인, 아프리카 환자9시리즈에서 비타민 D와 비타민 D 의무적인 단백질 (DBP) 테스트를 사용 우리. 우리의 아프리카 동료 드라이 아이스를 얻을 수 있었다. 두 개의 소수 민족 인구 비타민 D 경로 차이 이해 하는 생물 학적 마커 비교, 우리는 추가 필터 종이 표준 조건 하에서 저장 된 샘플을 사용 하 여 프로시저 개선. DBS/DSS 절차를 최적화 한 후 우리는 DBP와 두 동료에 환자 혈 청의 비타민 D를 분석할 수 있었다. 우리는 또한 아프리카9DBS와 백인에 대 한 전체 혈액에서 DNA 추출 후 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp)의 수를 평가. 현재 프로토콜 고품질 혈액 샘플 ELISA 분석 실험 분자 생물학에서 배열 하는 다운스트림 분석의 종류를 영향을 주지 않고 실내 온도에 저장 될 수 있습니다. 센터 시설 표준 저장 조건 없는 또는 사용 되 연구에서 생물 학적 자료를 관리 하는 것이 좋습니다. 다음 프로토콜 이러한 최적화 절차의 극치를 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>Whatman 단백질 절약 카드 903 단백질 절약 카드, 100/pk&lrm;</td><td>Sigma</td><td>Z761575</td><td>다운스트림 분석을 위해 실온에서 시료를 보관하는 데 유용</td></tr><tr><td>Falcon Serological Pipettes, 5 mL</td><td>Stem cell</td><td>#38003</td><td></td></tr><tr><td>50-200 &micro; L 팁</td><td>Star-Lab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 원심분리 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA 마이크로키트</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>이것은 소량의 DNA를 분리하도록 설계된 DNA 추출 키트입니다&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>This is report as Lysis Buffer 1 in the</td></tr><tr><td>text Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>This is report as Lysis Buffer 2 in the</td></tr><tr><td>text QIAamp mini elute column</td><td>Qiagen</td><td></td><td>This is report as column in the text</td></tr><tr><td>AW1&nbsp; (QIAamp DNA microkit에 포함)</td><td>Qiagen</td><td></td> 이것은 AW2&nbsp; <td>텍스트에서 Wash Buffer 1로 보고됩니다</td></tr><tr><td>. (QIAamp DNA microkit에 포함)</td><td>Qiagen</td><td></td> 이것은 Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit R& <td>텍스트에서 Wash Buffer 2로 보고됩니다</td></tr><tr><td></td><td>. D 시스템</td><td>DVDBP0</td><td></td></tr></tbody></table>

샘플 저장소 암 바이오 마커의 평가를 위한 유용한 툴으로 말린 혈액 및 혈 청 관광 명소

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

혈액 샘플 품질은 실시간 PCR 또는 ELISA 등 정확한 다운스트림 분석을 위해 중요 합니다. 생물 재료의 올바른 보관 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 결과 달성 하기 위해 출발점입니다. 모든 샘플 저장소 혈액 컬렉션에서 같은 방식으로 취급 한다. 수행을 분석에 따라 전체 혈액 및 혈 청 샘플 저장 되어야 한다-20 ° C 또는-80 ° C에서 사용까지. 혈액/혈 청 샘플을 피하기 위해 여러 동결-해 동 aliquoted 해야 합니다. 또 다른 중요 한 문제는 다른 한 실험실에서 운송 중 샘플 조건입니다. 드라이 아이스는 사용할 수 없습니다 또는 운송 몇 일 보다 더 오래 걸립니다, 대안 필요 합니다. 한 옵션 혈액 컬렉션에 대 한 필터 종이 사용 하는 것입니다. 여기, 우리 혈액에 대 한 방법을 제안 및 활용 하는 혈 청 샘플 컬렉션 핏 자국 (DBS)을 건조 혈 청 반점 (DSS)를 건조. 우리는 실시간 PCR에 의해 몇몇 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp)의 다운스트림 평가 위한 DBS에서 DNA를 추출 하는 절차를 개발 했다. 우리는 또한 DSS에서 eluted 단백질에서 시작 하는 ELISA 분석 결과 최적화. 이 메서드는 다른 ELISA 분석 실험 또는 단백질을 평가 하는 절차와 함께 사용할 수 있습니다.

우리는 생물 학적 재료의 품질에 영향을 주지 않고 혈액 및 혈 청 실내 온도에서 저장 하 DBS 및 DSS 절차의 이용을 했다. 그림 1 단백질 카드 보호기 없이 혈액 및 혈액 수집 후의 예가 나와 있습니다. 확인 필터 종이에 저장 및 혈액을 elute 절차 샘플 품질 방해 하지 않습니다, 우리는 표준 저장 방법으로 비교를 수행 합니다. 우리는 프로토콜 섹션에서 보고 2 mL 튜브에 수집 또는 DBS로 저장 된 전 혈의 3 일치 샘플에서 DNA를 추출. 5 개의 Snp 실시간 PCR에 의해 분석 되었다. 데이터 일치 샘플에 대 한 얻은 100% 조화 된 했다.
ELISA 분석, 관련 우리 2 mL 튜브에 수집 된 혈 청의 8 샘플 저장 (그리고-80 ° C에서 즉시 저장) 및 DSS (-20 ° C에서 그리고 ...

이 프로토콜 주변 혈액 및 혈 청/플라즈마 다운스트림 분석 단일 염기 다형성 (SNP) 평가 및 ELISA 분석 결과 등을 저장 하는 간단 하 고 유용한 방법을 설명 합니다.

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

이 방법은 개발도상국 환자의 바이오마커를 연구할 수 있는 기회와 같은 중개 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동결 없이 최소 2주 동안 혈액 및 혈청 샘플을 보관할 수 있고 qPCR 및 ELISA와 같은 다운스트림 분석을 위한 고품질 재료를 제공할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 암 및 전염병과 같은 질병의 진단으로 확장됩니다.이 방법은 산전 질환 연구 또는 HIV와 같은 감염 병리학 분석과 같은 진단 또는 연구 분야에도 적용될 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 냉동 샘플을 사용할 수 없는 백인과 아프리카 사례 시리즈 간의 바이오마커를 비교하기 시작했을 때 처음 떠올랐습니다. 이 방법의 시각적 시연은 혈액 탐지 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.이 절차에서는 3ml의 혈액 샘플을 5.4mg의 EDTA가 함유된 3ml 튜브에 수집합니다. 세이버 카드의 오른쪽 하단 모서리에 환자 코드 번호를 씁니다. 5ml 피펫으로 혈액을 조심스럽게 다시 현탁시킵니다.다음으로, 피펫팅을 하고 혈액 한 점을 세이버 카드에 옮깁니다. 각 혈액 분취액에 대해 새로운 팁을 사용하여 스포팅을 반복하여 총 3-5개의 핏줄을 얻습니다. 건조된 혈흔 또는 DBS를 실온에서 밤새 건조시키도록 두고, 세이버 카드의 덮개를 개방된 비흡수성 표면 위에 수평으로 열고 직사광선을 피하십시오.다음 날에는 카드를 사용할 때까지 건조제가 든 비닐 봉지에 넣어 실온에서 보관하십시오. 세이버 카드에서 세 개의 마른 혈액 반점에서 DNA를 추출합니다. 카드에서 각 DBS를 잘라내고 카드에서 분리하는 것으로 시작합니다.분리된 DBS를 직경 약 1mm의 작은 조각으로 자릅니다. 하나의 DBS에서 작은 조각을 1.5ml 원심분리기 튜브에 넣습니다. 샘플을 분해하려면 시판되는 DNA 추출 키트에서 180마이크로리터의 용해 버퍼를 튜브에 추가한 다음 볼텍싱으로 20마이크로리터의 proteinase K.Mix를 추가합니다.튜브를 보온 인큐베이터에 넣고 섭씨 56도에서 60분 동안 흔들면서 배양합니다. 배양이 끝나면 튜브를 잠시 원심분리하여 뚜껑에서 방울을 제거합니다. 200마이크로리터의 용해 버퍼 2를 추가하고 10초 동안 볼텍싱하여 세척을 시작합니다.튜브를 온도 혼합기에 넣고 섭씨 70도에서 10분 동안 배양합니다. elusion 컬럼을 새 2ml 수집 튜브에 넣고 이전 튜브를 버립니다. 500마이크로리터의 세척 버퍼와 6000배 중력에서 1분 동안 원심분리기를 추가합니다.컬럼을 새 2ml 수집 튜브에 넣고 기존 튜브를 버립니다. 500마이크로리터의 세척 버퍼 2를 추가하고 6000배 중력에서 1분 동안 원심분리합니다. 컬럼을 새 2ml 수집 튜브에 넣고 기존 튜브를 버립니다.20, 막을 말리기 위하여 3 분 동안 중력에 000배 분리기. DNA를 용리하려면 컬럼을 새로운 1.5ml 원심분리 튜브에 넣고 수집 튜브를 폐기합니다. 50마이크로리터의 증류수를 멤브레인 중앙에 놓고 실온에서 10분 동안 배양합니다.20, 1 분 동안 000 시간 중력에서 튜브를 원심분리하십시오. 용리액을 모아 멤브레인 중앙에 다시 놓습니다. 20, 1 분 동안 000 시간 중력에 관을 다시 원심 분리하십시오.멤브레인을 버립니다. 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정 한 후 사용할 때까지 DNA를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 이 절차를 위해 먼저 EDTA가 없는 7ml 튜브에 7ml의 말초 혈액 샘플을 수집합니다.혈액 샘플을 실온에서 30분 동안 응고시키도록 둡니다. 세이버 카드의 오른쪽 하단 모서리에 환자 코드 번호를 씁니다. 혈액 샘플을 실온에서 15분 동안 1100배 중력으로 원심분리합니다.튜브에서 상등액을 제거하고 새 15ml 튜브로 옮깁니다. 5ml 피펫으로 혈액을 조심스럽게 다시 현탁시킵니다. 피펫팅하고 세럼 한 지점을 세이버 카드에 옮깁니다.반점을 반복하면 총 3-5개의 핏자국이 생깁니다. 건조된 혈청 반점을 세이버 카드의 덮개를 연 상태로 실온에서 밤새 건조시킵니다. 다음 날에는 카드를 사용할 때까지 건조제가 든 비닐 봉지에 넣어 실온에서 보관하십시오.보관 기간이 14일 이상인 경우 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 필요한 경우 각 샘플에 대해 DSS를 해동하여 ELISA 분석을 준비합니다. DSS에서 단백질을 용출하려면 DSS 하나를 직경 약 1mm의 작은 조각으로 자르고 1.5ml 튜브에 넣습니다.그런 다음 4마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 밤새 섭씨 4도의 저속으로 샘플을 흔듭니다. 다음 날, 시판되는 키트를 사용하여 분비 단백질 또는 성장 인자 분석을 위한 혈청 샘플로 용리된 단백질을 적절하게 희석하여 사용합니다.이 프로토콜에서 혈액 및 혈청 샘플은 실온에서 여과지에 건조된 반점으로 보관되었습니다. 대표적인 단백질 절약 카드는 혈액 채취 전후에 표시됩니다. 여과지에 보관하는 것과 혈액을 용출하는 절차가 샘플 품질을 방해하지 않는지 확인하기 위해 비타민 D 결합 단백질 또는 DBP 수치에 대한 ELISA 분석을 2밀리리터 튜브에 채취한 8개의 혈청 샘플에 대해 수행하고 섭씨 영하 80도에서 즉시 보관하거나 건조된 혈청 반점으로 수집했습니다.일치하는 샘플 간의 변동 계수 또는 CV는 2%에서 24% 사이였으며 평균 CV는 9.6%였습니다.이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 10, 15분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 분자 생물학 또는 단백질 분석의 다운스트림 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 중개 연구 및 바이오마커 분석 분야의 연구를 가능하게 하여 표준 조건에서 생물학적 샘플을 저장할 수 있는 실험실 장비를 갖춘 전 세계 기관과 협력할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 혈액 샘플을 건조된 혈액 및 혈청 반점에 올바르게 보관하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 혈액 및 화학 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 실험복을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

바이오 마커는 질병이나 건강의 직접 측정 한 생물학적 지표입니다. 인구 및 사회 과학, 바이오 마커, 전송을 쉽게 얻을 수 있으며, 분석 할 필요가있다. 말린 혈액 스팟 (DBS) 컬렉션이이 요구 사항을 충족, 높은 응답 속도로 현장에서 수집하고 생체의 다양한 분석 할 수 있습니다.

건강 바이오 마커의 혈액 스팟 컬렉션 인구 연구에의 참여를 극대화하기 위해 건조

여기에서는 간단한 수동 단백질 침전 단계와 온라인 컬럼 추출을 사용하여 건조된 혈액 반점에서 면역억제제 타크로리무스를 정량화하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS) 분석에 대해 설명합니다.

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

준비 하 고 그들의 최종 분석에 대 한 건조 혈액 명소 (DBS)의 처리는 여전히 저조한 대부분 진단 응용 프로그램에 대 한 표준화 됩니다. 이 단점을 극복 하기 위해 포괄적인 단계별 프로토콜은 제안 하 고 이후 바이러스 성 감염의 마커를 탐지 하기 위한 그것의 효과 관한 평가.

말린된 피 명소-준비 및 Immunoassays 및 분자 기술 사용에 대 한 처리

피부 종양은 모스 (Mohs) 현미경 수술 후 폐기됩니다. 임상 지원 직원이 임상 작업을 방해하지 않고 하류 실험실 응용을위한 피부 종양 ( 예 : 편평 세포 암종, 기저 세포 암종 및 흑색 종) 샘플을 효과적으로 처리하고 저장할 수있는 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다.

클리닉 기반 생물 저장소의 설립

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

바이오뱅크는 생물의학 연구를 위한 중요한 자원이며 유럽 종양학 연구소의 중개 및 디지털 의학 부서를 위한 바이오뱅크는 이 분야의 모델입니다. 여기에서는 다양한 유형의 인간 생물학적 샘플 관리를 위한 바이오뱅크의 표준 운영 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

중개 의학을 위한 바이오뱅크: 최적의 시료 관리를 위한 표준 운영 절차

액체 생검은 종양학 번역 연구에 대한 우리의 접근 방식에 혁명을 일으켰으며, 샘플 수집, 품질 및 보관은 성공적인 임상 적용을위한 중요한 단계입니다. 여기에서는 대부분의 번역 연구 실험실에 적용 할 수있는 다운스트림 순환 프리 DNA 응용 프로그램에 대한 표준화되고 검증 된 프로토콜을 설명합니다.

다운스트림 순환 프리 DNA 응용을 위한 표준화된 액체 생검 사전 분석 프로토콜

이 백서에서는 전혈에서 무세포 DNA 및 순환 종양 세포와 같은 물질을 쉽고 효율적으로 분리하고 수집하기 위한 자동화 장비의 적용에 대해 설명합니다.

임상 샘플에서 암 관련 물질의 자동 분리 및 수집

바이오마커 프로가스트린 방출 펩타이드(ProGRP)로 예시된 건조 혈청 샘플에서 저농도 바이오마커를 측정하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 항체 코팅된 마그네틱 비드는 프로테오타입 ProGRP 펩타이드의 선택적 클린업 및 농축에 사용됩니다. 포획된 펩타이드는 이후 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법으로 분석됩니다.

표적 질량분석법 기반 단백질 분석의 마이크로샘플링 저농도 단백질

이 프로토콜은 근치적 전립선 절제술 표본에서 샘플 수집을 용이하게 하는 방법을 설명합니다. 목표는 해부병리학적 기준에 따라 표본의 조직 샘플을 Biobank에 저장하기 전에 매핑, 특성화 및 미시적 매크로 절개하는 것입니다.

개선된 샘플링 기법 및 조직학적 특성 분석을 통한 전립선 종양 바이오뱅킹 신뢰성 향상

이 프로토콜은 나노입자에 대한 맞춤형 단백질 코로나 프로파일링을 위한 SDS-PAGE 분석을 표준화하여, 암 특이적 신호의 재현 가능하고 확장 가능하며 저비용으로 검출할 수 있게 합니다. 췌장 관성 선암의 조기 진단을 위해 설계된 이 프로토콜은 연구 및 임상 환경 모두에서 복잡한 단백질체학적 방법에 대한 실용적이고 REASSURED에 맞춘 대안을 제공합니다.

조기 암 발견을 위한 맞춤형 단백질 코로나 프로파일링을 위한 표준화된 SDS-PAGE 워크플로우

학습하세요 말린 혈액 및 혈청 관광 명소 기법을 이용하여 생체표지자를 평가하는 방법을. 이 기술은 냉동 없이 2주 이상 샘플을 보관할 수 있어 암 및 감염병 진단 연구에 활용됩니다.

샘플 저장소 암 바이오 마커의 평가를 위한 유용한 툴으로 말린 혈액 및 혈 청 관광 명소

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