초파리 melanogaster 애벌레에서 Hypoxia의 검출에 대 한 분석 결과 내/터널링

이 분석의 전반적인 목표는 정상적인 산소 수치에도 불구하고 조직 저산소증을 앓고 있는 초파리 유충을 식별하는 것입니다. 초파리에는 유충의 느리고 가난한 성장과 일부 유충의 느린 성장을 일으키는 많은 돌연변이가 있습니다. 이 분석은 해당 부류의 유충 내에서 조직 저산소증을 앓고 있는 유충을 식별합니다.

궁극적으로 이 분석은 다양한 생리학적 과정을 통해 조직에서 산소 결핍을 일으키는 더 많은 돌연변이를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 이 분석에 대한 아이디어는 기도 또는 기관이 손상된 유충이 두 가지 이상한 행동을 보인다는 관찰에서 비롯되었습니다. 이러한 비정상적인 행동은 유충 생활 초기에 먹이 속으로 굴을 파지 못하는 것과 방황 단계에서 더 부드러운 하층으로 터널을 뚫지 못하는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 알을 낳는 접시에 대조군 및 실험적 유전자 교배를 설정합니다. 시간 제한 알 수집을 시작하기 전에 최소 이틀 동안 파리를 어둠 속에 두십시오. 시간 제한 난자를 채취하려면 이른 아침에 신선한 효모 페이스트로 장식된 새 포도 한천 플레이트로 성체를 옮기고 성체가 4시간 동안 접시에 알을 낳을 수 있도록 합니다.

4 시간 후, 성인을 신선한 포도 한천 플레이트로 옮깁니다. 다음으로, 섭씨 25도에서 밤새 4시간 수집 플레이트를 배양합니다. 다음 날 오후쯤이면 대부분의 애벌레가 부화할 것입니다.

각 실험 그룹당 최소 50명을 확보하도록 계획합니다. 단일 분석 실행의 경우 실험 그룹당 최소 5개의 분석 플레이트를 준비합니다. 가열하여 파리 한천 16g과 탈이온수 700ml를 추가합니다.

95% 에탄올에 17.5ml의 니파젠을 준비합니다. 한천 용액이 거의 완전히 용해 될 때까지 가열하십시오. 그런 다음 한천 용액에 Nipagen 용액을 넣고 한천이 완전히 용해될 때까지 가열합니다.

한천 용액을 잠시 식힌 다음 10cm 플레이트에 15ml의 한천 용액을 넣습니다. 한천이 굳으면 접시에 뚜껑을 덮고 실온에서 몇 시간 또는 밤새 건조시킵니다. 경화된 한천은 만졌을 때 단단해야 하며 조각을 잘라낼 때 부서지지 않아야 합니다.

한천이 경화되면 1.5cm 코르크 보드를 사용하여 각 플레이트의 한천 젤에 중앙 구멍을 만듭니다. 그런 다음 신선한 효모 페이스트로 구멍을 깔끔하게 채웁니다. 유충을 분석 플레이트로 옮기려면 간단한 도구를 만드십시오.

플라스틱 마이크로주걱의 끝 부분으로 곡선을 구부리고 끝을 효모 페이스트에 담궈 유충에 접착되도록 합니다. 이제 첫 번째 instar 유충을 개별적으로 집어 음식 더미에 가까운 한천 접시에 놓습니다. 각 실험 그룹에 대해 각각 10마리의 유충이 있는 최소 5개의 플레이트를 준비합니다.

분석 복제 간의 재현성을 보장하려면 각 분석 플레이트에 10마리의 유충만 배치하는 것이 중요합니다. 분석 플레이트를 주의 깊게 확인하여 마이크로스패튤라 팁으로 유충을 분만할 때마다 단 한 마리의 유충만 이동하는지 확인하십시오. 접시가 적재되면 라벨을 붙이고 덮은 다음 뚜껑 면이 위로 향하게 하여 실온에서 어두운 곳에 두십시오.

모든 유충이 죽거나 번데기가 될 때까지 매일 각 접시를 검사하십시오. 다음은 분석 2일차부터 8일차까지 야생형 균주에 대한 플레이트의 예입니다. 둘째 날에는 유충이 먹이에 묻히고 터널이 생기지 않습니다.

터널 공사는 3일째에 시작되어 5일째에서 8일 사이에 최대치에 이르며, 유충은 방황을 멈추고 터널에서 번데기가 됩니다. 구부러진 바늘로 번데기를 포도 접시에 조심스럽게 옮기고 원하는 경우 번데기가 얼마나 많이 들어 있는지 세십시오. 번데기의 형성을 기록하고 번데기의 이상을 평가하십시오.

분석 플레이트 내의 터널을 이미지화하려면 먼저 각 플레이트의 중앙 웰에서 모든 효모 식품을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 각 접시에 수돗물을 부드럽게 붓고 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 한천 표면에 자국이 있는 파편을 조심스럽게 문지릅니다. 일부 한천 조각은 터널링이 가장 심한 곳에서 부서질 수 있습니다.

이 문제는 나중에 수정할 수 있습니다. 계속해서 물을 여러 번 교체하고 접시가 완전히 깨끗해질 때까지 이물질을 부드럽게 털어냅니다. 그런 다음 탈이온수로 플레이트를 마지막으로 헹구고 덮고 실온에서 밤새 건조시킵니다.

한천 젤의 일부가 파손되거나 손상되지 않도록 부드러운 물의 흐름과 부드러운 브러시 스트로크를 사용하여 한천 플레이트를 청소하는 것이 중요합니다. 다음 날, 터널을 밝은 흰색 선으로 표시하기 위해 검은색 배경을 사용하여 플레이트의 tiff 파일 이미지를 준비합니다. 젤 문서화 시스템은 이 단계에서 잘 작동합니다.

그런 다음 Oval 도구로 Image J를 사용하여 이미지의 터널링을 정량화하고 페트리 플레이트의 플라스틱 가장자리를 포함하되 포함하지 않는 한천 겔을 정의합니다. 그런 다음 자동 임계값을 적용하여 플레이트의 반전 이미지를 생성하여 터널이 검은색 선으로 표시되도록 합니다. 터널이 없는 어두운 영역을 수정하려면 색상 선택기와 페인트 브러시 도구를 사용하여 해당 영역을 흰색으로 만듭니다.

그런 다음 Analyze(분석) 풀다운 메뉴에서 Set scale(스케일 설정)을 선택하고 클릭하여 scale을 제거합니다. 그런 다음 Analyze(분석) 아래의 Set measurements(측정 설정) 창으로 이동하여 Area(영역) 및 Limit to threshold(임계값 제한)를 확인합니다. 이제 M 키와 함께 Control 키를 눌러 이미지의 검은색 영역을 터널링된 영역을 나타내는 픽셀 단위로 측정합니다.

중앙 구멍 주위의 한천 침식을 통해 손실된 터널링을 정량화하려면 Limit to threshold(임계값 제한)를 선택 취소합니다. 지팡이 도구를 사용하여 중앙 구멍을 정의하고 Control과 M을 눌러 구멍 값을 픽셀 단위로 측정합니다. 이 값에서 지름이 1.5cm인 구멍의 픽셀 값을 뺍니다.

이전에 얻은 픽셀 값에 차이를 더하여 총 터널링 픽셀 값을 제공합니다. 누락된 한천이 터널링의 중앙 고리를 넘어 확장되는 플레이트의 경우, 정량화가 중앙 영역 외부의 영역을 포함하지 않도록 추가 단계가 필요합니다. 색상 선택기 및 페인트 브러시 도구를 사용하여 그림과 같이 검은색 막대를 추가하여 수량화된 영역을 제한합니다.

설명된 분석은 기관에서 팽창할 수 없는 유전자의 기능이 손상된 유충의 잠재적인 저산소증을 조사하는 데 사용되었습니다. 유전자는 Gal4 UAS를 통해 RNAi를 억제하였다. 두 개의 Gal4 라인이 사용되었습니다.

Breathless Gal4는 전체 기관 시스템의 모든 발달을 통해 표현됩니다. 또는 cut(ue)Gal4, 유충 생활 동안 작은 기관 섹션에서 강하게 발현됩니다. 대조군 유충에는 Gal4 계통 중 하나가 포함되어 있었지만 팽창되지 않은 RNAi는 없었습니다.

팽창되지 않은 RNAi를 유도하는 cut(ue)Gal4를 가진 유충은 성장과 행동 측면에서 발달 전반에 걸쳐 대조군과 구별할 수 없었습니다. 그러나 blt-Gal4로 기관 전체에 걸쳐 팽창할 수 없는 RNAi를 강력하게 억제하면 섭식 단계에서 굴을 파지 못하고 높은 사망률을 초래했습니다. 이 유충은 또한 방황 단계에서 터널이 전혀 없음을 보여주었습니다.

더욱이, 숨이 가쁜 Gal4 실험용 유충은 대조군보다 더 작고, 더 가늘고, 더 느렸으며, 다른 모든 그룹이 번데기를 한 후에도 오랫동안 유충으로 남아 있었다. 이 비디오를 시청한 후에는 초파리 유충이 먹이 더미에 굴을 파거나 부드러운 하층으로 터널을 뚫는 정도를 모니터링하여 조직 저산소증을 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 터널링이 전혀 없다는 것은 조직 저산소증의 강력한 지표입니다.