Name: 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hypoxia의 검출에 대 한 분석 결과 내/터널링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 애벌레에서 저산소증을 검출하는 행동 분석법을. 터널링 및 굴착 행동을 모니터링하여 조직 산소 결핍을 식별하고 유전자 돌연변이 연구에 활용하는 방법입니다.

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카 렌 M. 창족의 라이스 대학에 조지 J. Schroepfer 연구 수상 2016 받는 했다. Fanli 주 라이스 대학에서 가르치는 화목의 받는 사람입니다. 블루밍턴 초파리 재고 센터, 하버드 여행 시설 서비스 비엔나 초파리 리소스 센터는 기꺼이 인정 했다.

1입니다. 애벌레의 준비
<ol><li>분석 결과, 시작 하기 전에 두 개 이상의 일 십자가의 원하는 실험 설정 하 고 Wieschaus 및 Nusslein Volhard 13 하지만 50ml 폴 리 프로필 렌을 사용 하 여 설명 대로 계란-누워 요리 조합 (최소 20 여성 및 남성 10 각) 제어 비 커 및 6.0 cm 일회용 접시 포도 agar를 포함 하 고 누 룩 얼룩져 그냥 사용 하기 전에 붙여 넣습니다. 계속 계란-누워 요리에 필요할 때까지 실 온에서 어둠 속에서 난다.</li>
	<li>포도 한 천 제조 법-결합 냉동 100 mL 100% 포도 주스 농축, 350 mL deioinized 물, 5 mL 빙하 아세트산 및 13 g D. melanogaster 천 1 L 유리 비 커에. 1-2 분 버스트, 버스트, 한 천이 모두 녹는 때까지 사이의 교 반에 전자 레인지. 솔루션을 몇 분 기다린 다음 95% 에탄올에 Nipagen (메 틸-p-hydroxybenzoate)의 10% (w/v)의 10 mL를 추가 합니다. 믹스, 다음 일회용 6.0 cm 배양 접시에 접시 당 7 mL 피 펫 젤과 4에서 3-4 h. 저장소에 대 한 실 온에서 건조 수 있도록 비닐 봉지에 0 C.</li>
	<li>효 모 제조 법-7 g 건조 효 모, 10 mL 이온된 물 붙여넣기 유니폼 일관성 때까지 주걱으로 섞는다.</li>
	<li>타임된 계란 모음 생성 실험 하 고 애벌레를 제어. 를 사용 하 여 새로운, 효 모 얼룩져, 포도 접시는 아침 시간 동안 어둠 속에서 4 시간 실내 온도에 계란 수집 합니다. 이러한 4 h 컬렉션 접시를 제거 하 고 신선한 접시를 바꿉니다. 25에서 하룻밤 4 h 컬렉션 접시를 품 어 때 애벌레의 대부분은가 부 화 다음 날 오후까지 0C. 이러한 첫 번째 탈피 애벌레를 수집 하 고 그들을 사용 하 여 설정 실험.</li>
</ol>2. 분석 결과 판 설정
<ol><li>분석 결과 접시의 준비입니다. 분석 결과의 단일 실행에 대 한 5 분석 결과 각각의 접시 10 실험 애벌레와 10 제어 애벌레의 5 접시를 준비 합니다. 1.5 cm 코르크 송곳을 사용 하 여 음식에 대 한 구멍을 만드는 각 접시에서 agar의 중앙 코어를 제거. 효 모 반죽 (0.8-0.9 g)를 구멍에 넣고 구멍을 채우고 마운드 있도록 주걱으로 부드럽게 두 드려.</li>
	<li>한 접시 준비-16 g D. melanogaster agar 2 L 유리 비 커에 물 700 mL 이온된 결합 하 고 전자 렌지 전자 레인지에서 5 분 제거 솔루션으로 소화 agar를가지고 유리 막대와 저 어. 10% (w/v) Nipagen 95% 에탄올, 믹스, 17.5 mL을 추가 다음 30 s 파열에 마이크로파 난방 뒤 모든 agar 완전히 녹아 때까지 저 어. 1 분 또는 2에 대 한 멋진 다음 플라스틱 15 mL aliquots 10 cm 플라스틱 접시에. 한 천 젤, 뚜껑 접시 커버 몇 시간 동안 실 온에서 건조 또는 하룻밤 사이 그들을 허용 합니다. 플레이트 18 ° c.에 봉인 된 비닐 봉투에 저장 참고 1: 때문에 초과 dessiccation 격판덮개의 표면에 Nipagen 결정의 형성을 방지 하려면 접시를 사용 하 여 준비의 몇 일 이내. 필요한 경우, 그들에 95% 알코올 약간 microliters 떨어지고 결정을 다시 해산 수 있습니다. 참고 2: agar의 배치는 다른 고 속성이 있을 수 있습니다. 건조 젤 판 접촉에 확고 한 천의 깨끗 하 고 그대로 원 코르크 송곳을 사용 하 여 음식 구멍 (위 참조)을 만들 때 제거 될 수 있다 충분히 탄력 해야 합니다.</li>
	<li>분석 결과 접시에 애벌레를 설정합니다. 기계적 압력을 사용 하 여 곡선의 플라스틱 microspatula의 팁을 제공 하는 "접착제" 애벌레를 따기 위해 효 모 붙여넣기 팁을 찍어. 첫번째 탈피 애벌레를 개별적으로 선택 하 고 음식 마운드에 가까운 한 접시에 그들을 배치. 모두 실험 10 애벌레와 제어 genotypes의 적어도 5 개의 복제 접시를 준비 합니다. 완료 되 면, 모자 및 라벨 각 접시와 접시 (뚜껑 쪽) 실 온에서 어두운 공간에서 설정할 수 있습니다. (우리 실험실에서이 22 ° C).</li>
</ol>3. 모니터링 분석 결과 플레이트
<ol><li>해 현미경 매일 번호판을 검사 하 고 애벌레는 음식 위에 또는 한 천 표면에 수를 기록 합니다. 어떤 눈에 보이는 죽은 또는 죽어가는 애벌레 note 때, 그리고 세 번째 탈피에 애벌레 이동 본은 한 층으로 터널링 하는 경우 note. 참고 날짜는 pupae 형태를 시작 하 고 어떤 번데기 이상이 참고. 모든 애벌레가 죽거나 pupated 때까지 매일 관찰을 계속 합니다.</li>
	<li>Pupae 신중 하 게에서 제거 접시 휘어 바늘과 포도 접시에 괴 롭 히 고. 원하는 경우, 계속 성인으로 얼마나 많은 eclose를 결정 하는 번데기를 모니터링.</li>
</ol>4. 이미징에 대 한 번호판 시험 준비
<ol><li>조심 스럽게 제거 하 고 각 격판덮개의 중앙 우물에서 모든 효 모 식품 폐기.</li>
	<li>부드럽게 수돗물으로 각 접시 홍수 하 고 부드러운 예술가 페인트 브러시를 사용 하 여 한 천 표면에 추적 된 파편을 조심 스럽게 문질러. 교체 물 여러 번 하 고 각 플레이트는 완전히 깨끗 한 때까지 부드러운 솔 질 계속 합니다. 플레이트 이온된 수와 최종 린스, 그들 모자 주고 건조 하룻밤 실 온에 둡니다. 참고: 한 천으로 터널링 하는 것은 음식 마운드 주위 가장 강렬 (그림 2 참조). 그 결과, 음식 구멍의 변죽은 일반적으로 초기 1.5 cm 직경 넘어 확장 됩니다. 또한,이 지역에서 일된 한의 취약성 작은 조각의 터널링된 천 청소 하는 동안 구멍의 둘레에서 손실 될 수 발생할 수 있습니다. 이러한 문제를 도울 수 젤 agar 농도 증가 하지만 이미지 J 정량 단계 (아래 참조) 중 수정 가능.</li>
</ol>5입니다. 터널링의 정량
<ol><li>판 이미지. 밝은 흰색 선으로는 agar에 터널을 보기 위하여 검은색에 찍은 각 판의 이미지를 준비 합니다. 참고: 우리 DNA 젤이이 단계에 대 한 이미지를 일반적으로 사용 되는 시스템을 사용 하 여 참조 테이블의 재료 및 시 약. 대안 영상 디지털 카메라 또는 휴대 전화 카메라와 같은 tiff 파일을 생성할 수 있는 시스템 적당 한 이미지를 생산 하기 위해 조정 될 수 있습니다.</li>
	<li>애벌레 터널링 quantitate을 퍼블릭 도메인 프로그램 NIH 이미지 J를 사용 합니다. Http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html에서 프로그램을 다운로드. 프로그램에 대 한 자세한 내용은 http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html에가 서. 참고: 다른 이미징 시스템 quantitate 터널링에 사용 될 수 있습니다. NIH 이미지 제이에 아래의 지침 적용</li>
	<li>터널링 플레이트의 tiff 파일 이미지를 연 후 정량 전체 agar 표면 나타냅니다 하지만 접시의 플라스틱 가장자리 밖으로 작물에 대 한 영역을 정의 하는 타원형 도구를 사용 합니다.</li>
	<li>검은 선으로 보여주는 터널와 접시의 반전 이미지를 생산 하는 자동 임계값을 적용 합니다. 색상 선택기 및 흰색 페인트 브러시 도구를 사용 하 여 한 천 보다는 터널에 손상을 나타내는 어떤 블랙 영역 밖으로.</li>
	<li>분석 풀 다운 메뉴에서 선택 세트 규모 | 규모를 제거 하려면 클릭 다음 (또한 아래 분석) 측정을 설정 창에서 지역 및 임계값 한도확인 하 고.</li>
	<li>Cntrl 키 + M 키 픽셀에서 검은 영역 (터널)을 표시를 누릅니다.</li>
	<li>복사 및 붙여넣기 (예: Excel) 정량 분석을 허용 하는 스프레드시트 프로그램으로 각 접시에 대 한 픽셀 값이입니다.</li>
	<li>중앙 구멍은 일반적으로이 지역에서 강렬한 터널링으로 확장 됩니다. Quantitate 누락 된 터널링, "임계값 제한"을 취소 하 고 자동 선택 도구 사용 하 여 중앙 구멍을 정의. Cntrl 키 +이 영역의 픽셀 값을 가져오기 위해 M 키를 누릅니다. 1.5 c m 구멍의 픽셀 값이이 값에서 뺍니다 고 단계 5.6에서에서 얻은 터널링 값 차이 추가 합니다.</li>
	<li>일부 번호판에 대 한 중앙 구멍 untunneled agar 구멍에 인접 한 영역을 포함 하는 터널링 된 한 천 조각을 누락 수 있습니다. 이러한 판 사용에 대 한 중앙 구멍을 quantitating 때 색상 선택기 및 페인트 브러시 터널링 된 영역을 정의 하 여 정량에서 터널링 비 지역 제외 누락 지역에 걸쳐 검정색 막대를 추가 하려면 도구. 참고 1: 실험적인 애벌레 어떤 터널링을 수행 하는 경우이 정량 평균 터널링 격판덮개의 세트 및 제어의 통계 비교에 대 한 값과 실험 값의 계산을 허용 한다.</li>
</ol>

<ol><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+responses+to+oxygen+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li>
<li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://mcb.asm.org/content/22/19/6842.full">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li>
<li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC534649/">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li>
<li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li>
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<li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

우리 여기에 D. melanogaster 애벌레 조직 hypoxia을 감지 하도록 설계 된 간단한 분석 결과 제시 했습니다. 진단 초기 애벌레 생활 및 애벌레 생활에서 늦게 터널링 하는 층의 부재에 음식 고 분으로 감소 내 기반으로 합니다. 애벌레 크롤 링 음식 소스에서 조 마이그레이션을 발생할 수 있으며 따라서 분석 결과의 하나의 중요 한 측면은 적은 수 애벌레의 큰 초과 음식 존재 분석 됩니다. 균 메 틸-p hydroxyl benzoate (Nipagen)의 한 천 배지를 포함 분석 결과 중 곰 팡이 성장을 방지 하기 위해 필수적 이기도 합니다.
보면 한 천 배지 분석 결과 있는 가변성의 원천이 될 수 있습니다. 일반적으로, 애벌레, 애벌레의 다른 컬렉션 또는 부모의 다른 배치에서 동일한 유전자의 분석 결과에 그들의 행동에 비교적 제한 된 변화를 보여줍니다. 반면, 한 천 배지 또는 다른 일에 만들어진 agar의 다른 배치와 터널링에 차이 얻을 수 있습니다. 한 규정 따라서 제어 하 고 실험적인 애벌레 모두 테스트 해야 동일한 배치 준비에서 한 천 배지를 사용 하 여. 다른 제조 업체에서 한 천 또는 동일한 제조에서 심지어 출하 고 그들의 힘에 다를 수 있습니다 하 고 그래서 여기 최적의 젤을 달성 하는 데 사용 하는 2.2%에서 위쪽으로 agar 농도 조정 해야 할 수 있습니다. 우리는 야생 타입 애벌레 3% 한 천 젤을 통해 쉽게 뚫 수 있습니다 나타났습니다.
이 분석 결과의 가치를 입증, 우리는 그것를 사용의 억제 기능을 가진 애벌레에 잠재적인 조직 hypoxia 조사 uninflatable . 기관에 우리의 발견이이 유전자의 tracheal 식의 손실 산소를 생산할 수 있는 가설에 대 한 강력한 지원을 제공: btl-Gal4 > UAS-uif RNAi 애벌레 음식과 층 동안 터널링의 완전 한 부재에 뚫으 보여 세 번째 탈피입니다. 우리의 이전 연구에서 다른 genotypes의, 우리는 hypoxia 유발 손실 음식 내 층 터널링의 손실 및 btl로 완전 하지 않습니다 관찰-Gal4 > UAS-uif RNAi 애벌레 공부 여기 유사 하 게 행동. 이 분석 결과의 실패 한 터널링 구성 요소는 그러므로 산소의 강한 표시를 제공 한다.
비록 btl-Gal4 > uif RNAi 애벌레 행동 특성을 보였다는 잘라(ue) 저 산소 증의 진단-Gal4 > UAS-uif RNAi이이 이상이 전시 하지 않았다. Btl 고 잘라(ue) Gal4 드라이버 다른 단계에서 그리고 애벌레 기관 내 다른 패턴에 표시 됩니다. Btl-Gal4 드라이버 embryogenesis에 그것의 개발에서 시작 하 고 애벌레 생활을 통해 계속 tracheal 시스템을 통해 표현 된다. 반면,는 잘라(ue)에서 Gal4 식-Gal4 드라이버만 한다의 morphogenesis 후 미 발달 생활의 끝에 시작 하 고 지 느 러 미 줄기의 주요 경도 혈관의 극단적인 후부 섹션으로 제한 됩니다 tracheal 시스템입니다. uif 최저 Gal4 줄으로 줄일 수 없습니다 따라서 uif 식 일찍 충분히 또는 광범위 하 게 동작을 실행 하는 데 필요한 산소의 일부 임계값을 생성 하기에 충분이 분석 결과 측정.
이전 연구 3 탈피 애벌레 (10%) 산소의 저급에 노출 감소 성장을 보여을 발견 하 고 pupariation 14의 발병을 지연. Btl-Gal4 > 세 번째 탈피에 UAS-uif RNAi 애벌레 여기 공부 진행 하지만 그들의 성장과 pupation 요금에 효과 더 발음 했다: 그들은 컨트롤과 아래 아주 작은 지방 조직 보다 상당히 작은 표 (그림 3) 피와 유일한 작은 분수 (~ 10%)는 pupariation을 시도 했다. 이 차이 제안 btl-Gal4 > uif 최저는 기관에 그들의 전체 애벌레 생활 내내 존재 했다 또는 그것을 더 생산 하기 때문에 UAS-uif RNAi 애벌레 hypoxia의 훌륭한 정도 경험 세 번째 탈피에 심각한 산소 박탈 합니다. 어떻게 uif 함수는 기관에서의 손실 되지 않도록 산소 운반은 불분명이 시점에서. Btl의 기관-Gal4 > UAS-uif RNAi 애벌레 표 피 (그림 3), 그들은 공기를 포함 하 고 액체 항목 기능 손상 지점 손상 되지 했다 표시를 통해 쉽게 볼 수 있었다. 그것은 공식적으로 가능한 그러므로 uif 기능의 손실에 의해 만들어진 tracheal 손상 hypoxia 하지만 오히려 몇 가지 다른 결함 억제 터널링을 유도 하지 않는. Genotypes 이전 공부, 우리가 늦은 제 3 탈피 애벌레 15에 터널 실패는 LDH mRNA7의 높은 수준, 분해 하 고 산소의 정식 표시기와 관련 된 결정. Btl에 대 한 산소의 따라서, 최종 확인-Gal4 > UAS-uif RNAi 애벌레 (와 나중에 검사 하는 애벌레에서이 분석 결과의 사용) RT-PCR LDH mRNA 수준 또는 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 표시기의 사용을 평가 하기 위해 포함 세포내 산소 수준 (예를 들어 참조 16).

분자 유전 도구 D. melanogaster 에서 사용할 수 있는 정교한 배열 진화론 보존된 생물 학적 과정의 연구에 대 한 귀중 한 유기 체 게. 주요 분자 응답 산소 가용성을 진화에 걸쳐 보존을 입증 하 고 신호 경로 1,2, 이들의 보편적인 구성 요소에 대 한 통찰력을 생성 하는 D. melanogaster 사전 연구 3,4,,56.
D. melanogaster 애벌레에 감각 신경 기능 해 부 하기 위한 연구의 일환으로, 우리는 정상적인 산소 수준 7에서 조직 저 산소 증에 의해 활성화 될 입증 하는 두 행동 응답 확인. 음식, 뚫으, 이들 중 하나는 매우 Wingrove와 O'Farrell 8보고 낮은 산소 수준에 응답 관련. 두 번째 동작, 후반 3 탈피 단계, 방황 하는 동안 부드러운 층에 터널을 실패 하지 되었습니다 이전 발견 했다로 hypoxia 관련. 우리는 7, 터널링 하는 층을 억제 또한 낮은 산소 수준에 야생 타입 방황 애벌레를 노출 따라서 모두 hypoxia에서 발생 한 이러한 행동-중 유도 조직 손상 또는 낮은 산소 섭취 수준 수립 결정. 여기는 관측 애벌레 부 화 후 즉시 시작 되 분석 결과 우리는이 두 hypoxia 유발 행동을 quantitate를 개발에 대해 설명 합니다.
초기 애벌레 단계에 있는 hypoxic 응답 이전 검사 하지는 및 따라서 애벌레 생활 내내 분석을 수행 하는 것입니다 우리의 분석 결과의 중요 한 구성 요소. -느린 개발, 불 쌍 한 성장, 및 운동 부진-저 산소 증의 확실 한 발현의 대부분 겹칠 애벌레 고기 많은 돌연변이 의해 생산. 하지만 우리 hypoxia로만 세 번째 탈피 애벌레 터널 7완전 한 실패 보여 것으로 나타났습니다. 따라서, 우리는 심지어 애벌레 우리의 hypoxic 애벌레 보다 더 성장 및 운동 손상, 여전히 수행 몇 가지 터널링 hypoxic 애벌레는 결코 7터널링 반면 결정. 이 분석 결과의 또 다른 중요 한 요소가입니다 따라서 때 산소는 다 면 발현 성 고기 몇 가지 다른 스트레스 나 변화 고장 아닌 특정 집합의 소스를 설정 하는 방법을 제공 합니다. 분석 결과의 데모, 여기 우리가 특성화의 감소 tracheal 식이 애벌레의 응답에 사용 설명 uninflatable, 애벌레 항공 9에서 작동 하는 유전자.
우리는이 분석 결과 가난한 성장 및 느린 동작을 포함 하는 애벌레 고기 특성화에 종사 하는 연구자에 게 가치가 있을 것입니다 정시. 결과, 유통, 사용, 또는, 응답을 좌우 하는 새로운 유전자를 몸 전체에 산소 수 식별 합니다. 추가, 프로토콜을 차단 하는 돌연변이에이 분석 결과 통합 산소를 생산 하는 돌연변이 확인 하는 직접적인 경로 제공할 것 이다. 이 분석 결과 또한 여기에 설명 된 hypoxia 유발 타고 난 행동 elicits 회로 분석에 귀중 한 것입니다. 이러한 종류의 신경 네트워크 분석은 많은 현재 연구의 초점 고 D. melanogaster 유 충의 간단한 신경 시스템은 자동화 된 동작 개 해 부에 대 한 중요 한 시스템. 감각 뉴런 애벌레 산소 인식에 관련 된 이미 확인 되었습니다, hypoxia 유발 응답 10,11에 대 한 완전 한 회로 정의 향한 첫 번째 단계를 제공 하. 우리의 분석 결과 사용 하 여 선택적 신경 최저 GAL4 UAS 시스템12 을 통해 함께 묘사 또한 신경 네트워크의 구성 요소에 대 한 명확한 경로입니다.

<table><tbody><tr><td><강한>시약</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>탈수 효모&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉동 포도 주스 농축</td>액 <td>Welch's</td><td></td><td>&nbsp; 대부분의 대형 슈퍼마켓에서 사용 가능</td></tr> 빙<tr><td>초산</td><td>시그마-알드리치</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>초파리 한천</td><td>Apex Bioresearch 제품</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>메틸-파라-하이드록시벤조에이</td><td>트 Apex Bioresearch 제품</td><td>20-658</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50ml 폴리프로필렌 비커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6.0cm 일회용 페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>08757100B</td><td></td></tr><tr><td>10cm 일회용 플라스틱 페트리 접시</td><td>E+K Scientific</td><td>EK-24104</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 마이크로 주걱</td><td>Corning Incorporated</td><td>3012</td><td></td></tr><tr><td>구부러진 티징 바늘</td><td>Nasco</td><td>S08848MH</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td></td><td></td><td>10-30X의 모든 현미경 확대</td></tr></tbody></table>

초파리 melanogaster 애벌레에서 hypoxia의 검출에 대 한 분석 결과 내/터널링

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

동물에 산소 박탈 산소 분포와 방해 하는 내부 조직 손상 또는 낮은 대기 산소 수준에 노출에서 발생할 수 있습니다. 그것은 또한 산소 감지 뉴런의 탈 선 행동 정상적인 산소 수준 존재 hypoxia-같은 동작을 유도 수 가능. D. melanogaster, 낮은 산소 수준에서 개발 억제 성장 및 느린 동작의 애벌레 단계 동안에 발생합니다. 그러나, 산소 적자의 이러한 설립된 발현 상당히 많은 변이 성장, 스트레스 반응 또는 운동 조절의 고기와 중복. 결과, 현재 아무 분석 결과 돌연변이 나 비정상적인 신경 행동에 의해 유도 된 때 ii) hypoxia-같은 동작에 의해 유도 된 i) 세포 저 산소 증을 식별 하기 위해 사용할 수 있다.
우리는 최근 두 가지 독특한 동작이 D. melanogaster 애벌레 hypoxia의 내부 탐지에 대 한 응답의 정상적인 산소 수준에서 발생 하는 확인 했습니다. 첫째, 모든 단계에서 같은 애벌레 음식 근원에서 멀리 떨어져 straying 종종 음식으로 내 피하. 둘째, 부드러운 층으로 터널링, 방황 3 탈피 단계 동안 일반적으로 발생 하는 완전히 폐지 애벌레 hypoxic 있다면. 여기서 설명 하는 분석 결과 감지 하 여 이러한 동작을 quantitate 설계 및 따라서 내부 손상 보다는 낮은 외부 산소에 의해 유도 된 산소를 감지 하는 방법을 제공 하. 천 층 및 효 모 반죽의 중앙 플러그 분석 결과 접시 애벌레 생활을 통해 동물을 지원 하기 위해 사용 됩니다. 위치와 애벌레의 상태 추적 매일으로 그들은 제 3 먼저 탈피에서 진행 합니다. 방황 단계 천 층으로 터널링의 NIH ImageJ를 사용 하 여 pupation 후 quantitated입니다. 분석 결과 것입니다 결정에 때 hypoxia 돌연변이 표현 형의 구성 요소 값의 되며, 따라서 문제의 유전자의 행동의 가능한 사이트에 대 한 통찰력을 제공.

이 분석 결과의 값의 데모로 서 우리는 그것을 사용 애벌레는 유전자의 장애인 기능에 잠재적인 hypoxia 조사 uninflatable (uif)는 기관에. uif 애벌레 tracheal 셀의 꼭대기 표면에 강하게 표현 되는 큰 막 횡단 단백질을 인코딩합니다. Uif 의 돌연변이 tracheal 오작동 9인 조직 hypoxia 나타낼 수 있는 탈 선 행동을 전시 하 이전 지적 했다. 우리는 특별히 Gal4 UAS 시스템을 사용 하 여 애벌레 기도에 uif 식 억제. 두 Gal4 라인 사용 되었다: i) 숨 (btl)-Gal4 그들의 배아 개발 및 ii의 시작 부분에서 기관에 강하게 표현) (ue)를 잘라-Gal4 식의 작은 후부 지역에서 시작 embryogenesis의 끝에 주요 지 트렁크 한다 애벌레 생활 7에 걸쳐이 지역에 강한 식 계속 됩니다. UAS-uif RNAi 라인 비엔나 초파리 연구 센터 (VDRC ID #1050)에서 얻은 했다.
위의 프로토콜에 설명 된 대로 5 애벌레 설정 4 십자가의 각 다음과 같이 새로 부 화 첫 탈피의 번호판을 복제 합니다.
실험 1 1) 제어 1-(ue)를 잘라-Gal4 구획-S (+) x 2) 실험 1-(ue)를 잘라-Gal4 x UAS-uif RNAi
실험 2 3) 제어 2- btl-Gal4 구획-S (+) x 4) 실험 2- btl-Gal4 x UAS-uif RNAi
컷(ue)의 동작-Gal4 &gt; 실험 1의 UAS-uif RNAi 애벌레는 컨트롤 컷(ue)의 비교 되었다-Gal4 &gt; + 내, 터널링 및 pupation, (그림 1 생존 동물 및 그림 2). 대조적으로, 초기에 개발 (실험 2)에서 전체 tracheal 시스템 전체 다운 규제 uif 식 생산 현저 하 게 다른 응답. Btl-Gal4 &gt; UAS-uif RNAi 애벌레 표시 모두 행동 발현의 조직 hypoxia-식품 내 고 나중에 애벌레(그림 1 및 그림 2 터널링 하는 층의 총 부재 감소 ). 실험적인 애벌레 또한 눈, 얇은 및 컨트롤 (그림 3) 보다 더 부진 했다 고 분석 결과의 과정 동안 높은 사망률을 보였다. 위에서 설명 했 듯이, 감소 성장 부진, organismal 죽음 애벌레 저 산소 증의 증상으로 알려져 있습니다. 또한, 실험 애벌레 pupation 시도를 실패 하 고 남아의 대부분으로 3 탈피 애벌레 긴 후 제어 애벌레 pupated 했다. 일부 애벌레는 결국 용 (그림 1A) 없이 죽기 전에 15 일 이상 살아 남았습니다. 실험적인 애벌레의 몇 가지 pupate 했지만 모든 경우에 비정상적인 pupae 가능한 성인을 생성 하지 않았다 형성 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> 그림 1입니다. 음식 내와 애벌레 개발의 정량입니다. (A) 4 genotypes 여기에 공부에 대 한 음식 고 분 외부 라이브 애벌레의 백분율입니다. 5 분석 결과 번호판 각 유전자 형에 대 한 사용에 대 한 평균을 표시 됩니다. Btl의 ~ 70% 부 화 후 3 일-Gal4 &gt; 음식 또는 다른 3 genotypes agar 표면에 아무 애벌레 발견 된 반면 UAS uif RNAi 애벌레는 음식 밖에 있었다. Btl-Gal4 &gt; UAS uif RNAi 애벌레 죽을 천천히 살아 그들의 ~ 15 %4-20 일 사이 부 화 후 15 일. X 축 따라 검은색 화살표 여기 고 (B)에 3 개의 다른 genotypes의 모든 애벌레 pupated 했다 하루를 나타냅니다. (B) 죽은 애벌레 4 genotypes 위해 외부 표시의 백분율입니다. 각 유전자 형에 대 한 분석 결과 5 판에 대 한 평균을 표시 됩니다. 죽은 btl-Gal4 &gt; UAS uif RNAi 애벌레 대부분 죽어 시간이 지남에 축적 음식 밖에. 모든 다른 genotypes pupation 생존 (C) 비율 생존 pupation 4 genotypes에 대 한 공부. 각 유전자 형에 대 한 분석 결과 5 판에 대 한 평균을 표시 됩니다. Btl의 정상적인 pupae 없음-Gal4 &gt; UAS uif RNAi 유전자 형이 생산 되었다. 그림을 통해 오차 막대 SEMs를 나타냅니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> 그림 2입니다. 애벌레 터널링의 정량입니다. (A) 모든 4 개의 genotypes에 대 한 분석 결과 번호판의 예 정량 터널링에 대 한 준비 후 공부. Btl에 대 한 터널링의 완전 한 부재를 참고-Gal4 &gt; UAS uif RNAi 애벌레. 분석 결과 플레이트는 10 cm 배양 접시. (B) 터널링 정량 4 genotypes에 대 한 이미지 J에서 파생 된. 각 유전자 형에 대 한 분석 결과 5 판에 대 한 픽셀 값을 평균입니다. Btl에 대 한 관찰 되었다 아니 터널링-Gal4 &gt; UAS uif RNAi 애벌레. 오차 막대 SEMs =. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> 그림 3입니다. Btl의 비교-Gal4 &gt; UAS uif RNAi 및 btl-Gal4 &gt; + 애벌레 Btl에 대 한 비슷한 나이 (부 화 후 6 일)의 애벌레-Gal4 &gt; UAS uif RNAi (A) 및 btl-Gal4 &gt; + genotypes (B). 빨간색 화살표 등 트렁크 한다 가리킵니다. 두 애벌레 같은 배율에서 몇 군데입니다. 눈금 막대 = 0.5 m m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

프로토콜 정상적인 대기 산소 수준에서 산소를 발생 하는 초파리 melanogaster 애벌레를 식별 하는 간단한 분석 결과를 설명 합니다. 이 프로토콜에 hypoxic 애벌레를를 겹치는 고기 느린 성장 부진 등을 보여 주는 다른 돌연변이 구별 될 수 있습니다.

초파리 melanogaster 애벌레에서 Hypoxia의 검출에 대 한 분석 결과 내/터널링

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

이 분석의 전반적인 목표는 정상적인 산소 수치에도 불구하고 조직 저산소증을 앓고 있는 초파리 유충을 식별하는 것입니다. 초파리에는 유충의 느리고 가난한 성장과 일부 유충의 느린 성장을 일으키는 많은 돌연변이가 있습니다. 이 분석은 해당 부류의 유충 내에서 조직 저산소증을 앓고 있는 유충을 식별합니다.궁극적으로 이 분석은 다양한 생리학적 과정을 통해 조직에서 산소 결핍을 일으키는 더 많은 돌연변이를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 이 분석에 대한 아이디어는 기도 또는 기관이 손상된 유충이 두 가지 이상한 행동을 보인다는 관찰에서 비롯되었습니다. 이러한 비정상적인 행동은 유충 생활 초기에 먹이 속으로 굴을 파지 못하는 것과 방황 단계에서 더 부드러운 하층으로 터널을 뚫지 못하는 것입니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 알을 낳는 접시에 대조군 및 실험적 유전자 교배를 설정합니다. 시간 제한 알 수집을 시작하기 전에 최소 이틀 동안 파리를 어둠 속에 두십시오. 시간 제한 난자를 채취하려면 이른 아침에 신선한 효모 페이스트로 장식된 새 포도 한천 플레이트로 성체를 옮기고 성체가 4시간 동안 접시에 알을 낳을 수 있도록 합니다.4 시간 후, 성인을 신선한 포도 한천 플레이트로 옮깁니다. 다음으로, 섭씨 25도에서 밤새 4시간 수집 플레이트를 배양합니다. 다음 날 오후쯤이면 대부분의 애벌레가 부화할 것입니다.각 실험 그룹당 최소 50명을 확보하도록 계획합니다. 단일 분석 실행의 경우 실험 그룹당 최소 5개의 분석 플레이트를 준비합니다. 가열하여 파리 한천 16g과 탈이온수 700ml를 추가합니다.95% 에탄올에 17.5ml의 니파젠을 준비합니다. 한천 용액이 거의 완전히 용해 될 때까지 가열하십시오. 그런 다음 한천 용액에 Nipagen 용액을 넣고 한천이 완전히 용해될 때까지 가열합니다.한천 용액을 잠시 식힌 다음 10cm 플레이트에 15ml의 한천 용액을 넣습니다. 한천이 굳으면 접시에 뚜껑을 덮고 실온에서 몇 시간 또는 밤새 건조시킵니다. 경화된 한천은 만졌을 때 단단해야 하며 조각을 잘라낼 때 부서지지 않아야 합니다.한천이 경화되면 1.5cm 코르크 보드를 사용하여 각 플레이트의 한천 젤에 중앙 구멍을 만듭니다. 그런 다음 신선한 효모 페이스트로 구멍을 깔끔하게 채웁니다. 유충을 분석 플레이트로 옮기려면 간단한 도구를 만드십시오.플라스틱 마이크로주걱의 끝 부분으로 곡선을 구부리고 끝을 효모 페이스트에 담궈 유충에 접착되도록 합니다. 이제 첫 번째 instar 유충을 개별적으로 집어 음식 더미에 가까운 한천 접시에 놓습니다. 각 실험 그룹에 대해 각각 10마리의 유충이 있는 최소 5개의 플레이트를 준비합니다.분석 복제 간의 재현성을 보장하려면 각 분석 플레이트에 10마리의 유충만 배치하는 것이 중요합니다. 분석 플레이트를 주의 깊게 확인하여 마이크로스패튤라 팁으로 유충을 분만할 때마다 단 한 마리의 유충만 이동하는지 확인하십시오. 접시가 적재되면 라벨을 붙이고 덮은 다음 뚜껑 면이 위로 향하게 하여 실온에서 어두운 곳에 두십시오.모든 유충이 죽거나 번데기가 될 때까지 매일 각 접시를 검사하십시오. 다음은 분석 2일차부터 8일차까지 야생형 균주에 대한 플레이트의 예입니다. 둘째 날에는 유충이 먹이에 묻히고 터널이 생기지 않습니다.터널 공사는 3일째에 시작되어 5일째에서 8일 사이에 최대치에 이르며, 유충은 방황을 멈추고 터널에서 번데기가 됩니다. 구부러진 바늘로 번데기를 포도 접시에 조심스럽게 옮기고 원하는 경우 번데기가 얼마나 많이 들어 있는지 세십시오. 번데기의 형성을 기록하고 번데기의 이상을 평가하십시오.분석 플레이트 내의 터널을 이미지화하려면 먼저 각 플레이트의 중앙 웰에서 모든 효모 식품을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 각 접시에 수돗물을 부드럽게 붓고 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 한천 표면에 자국이 있는 파편을 조심스럽게 문지릅니다. 일부 한천 조각은 터널링이 가장 심한 곳에서 부서질 수 있습니다.이 문제는 나중에 수정할 수 있습니다. 계속해서 물을 여러 번 교체하고 접시가 완전히 깨끗해질 때까지 이물질을 부드럽게 털어냅니다. 그런 다음 탈이온수로 플레이트를 마지막으로 헹구고 덮고 실온에서 밤새 건조시킵니다.한천 젤의 일부가 파손되거나 손상되지 않도록 부드러운 물의 흐름과 부드러운 브러시 스트로크를 사용하여 한천 플레이트를 청소하는 것이 중요합니다. 다음 날, 터널을 밝은 흰색 선으로 표시하기 위해 검은색 배경을 사용하여 플레이트의 tiff 파일 이미지를 준비합니다. 젤 문서화 시스템은 이 단계에서 잘 작동합니다.그런 다음 Oval 도구로 Image J를 사용하여 이미지의 터널링을 정량화하고 페트리 플레이트의 플라스틱 가장자리를 포함하되 포함하지 않는 한천 겔을 정의합니다. 그런 다음 자동 임계값을 적용하여 플레이트의 반전 이미지를 생성하여 터널이 검은색 선으로 표시되도록 합니다. 터널이 없는 어두운 영역을 수정하려면 색상 선택기와 페인트 브러시 도구를 사용하여 해당 영역을 흰색으로 만듭니다.그런 다음 Analyze(분석) 풀다운 메뉴에서 Set scale(스케일 설정)을 선택하고 클릭하여 scale을 제거합니다. 그런 다음 Analyze(분석) 아래의 Set measurements(측정 설정) 창으로 이동하여 Area(영역) 및 Limit to threshold(임계값 제한)를 확인합니다. 이제 M 키와 함께 Control 키를 눌러 이미지의 검은색 영역을 터널링된 영역을 나타내는 픽셀 단위로 측정합니다.중앙 구멍 주위의 한천 침식을 통해 손실된 터널링을 정량화하려면 Limit to threshold(임계값 제한)를 선택 취소합니다. 지팡이 도구를 사용하여 중앙 구멍을 정의하고 Control과 M을 눌러 구멍 값을 픽셀 단위로 측정합니다. 이 값에서 지름이 1.5cm인 구멍의 픽셀 값을 뺍니다.이전에 얻은 픽셀 값에 차이를 더하여 총 터널링 픽셀 값을 제공합니다. 누락된 한천이 터널링의 중앙 고리를 넘어 확장되는 플레이트의 경우, 정량화가 중앙 영역 외부의 영역을 포함하지 않도록 추가 단계가 필요합니다. 색상 선택기 및 페인트 브러시 도구를 사용하여 그림과 같이 검은색 막대를 추가하여 수량화된 영역을 제한합니다.설명된 분석은 기관에서 팽창할 수 없는 유전자의 기능이 손상된 유충의 잠재적인 저산소증을 조사하는 데 사용되었습니다. 유전자는 Gal4 UAS를 통해 RNAi를 억제하였다. 두 개의 Gal4 라인이 사용되었습니다.Breathless Gal4는 전체 기관 시스템의 모든 발달을 통해 표현됩니다. 또는 cut(ue)Gal4, 유충 생활 동안 작은 기관 섹션에서 강하게 발현됩니다. 대조군 유충에는 Gal4 계통 중 하나가 포함되어 있었지만 팽창되지 않은 RNAi는 없었습니다.팽창되지 않은 RNAi를 유도하는 cut(ue)Gal4를 가진 유충은 성장과 행동 측면에서 발달 전반에 걸쳐 대조군과 구별할 수 없었습니다. 그러나 blt-Gal4로 기관 전체에 걸쳐 팽창할 수 없는 RNAi를 강력하게 억제하면 섭식 단계에서 굴을 파지 못하고 높은 사망률을 초래했습니다. 이 유충은 또한 방황 단계에서 터널이 전혀 없음을 보여주었습니다.더욱이, 숨이 가쁜 Gal4 실험용 유충은 대조군보다 더 작고, 더 가늘고, 더 느렸으며, 다른 모든 그룹이 번데기를 한 후에도 오랫동안 유충으로 남아 있었다. 이 비디오를 시청한 후에는 초파리 유충이 먹이 더미에 굴을 파거나 부드러운 하층으로 터널을 뚫는 정도를 모니터링하여 조직 저산소증을 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 터널링이 전혀 없다는 것은 조직 저산소증의 강력한 지표입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

Drosophila melanogaster은 한 세기 이상에서 많은 중요한 생물 학적 과정의 분자 및 세포 기초를 이해하기 위해 사용되었습니다 유전자와 behaviorally 다루기 쉬운 모델 시스템이다. Drosophila 잘 플라이 행동의 유전적 기초에 대한 통찰력을 얻기 위해 악용되었습니다.

분석의 방법 Drosophila 행동

이 비디오는 초파리 유충의 굴 및 터널링 능력을 평가하여 저산소증을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 이 기술을 사용하여 연구자들은 산소 결핍을 경험하는 유충과 발달 결핍이 있는 유충을 구별할 수 있습니다. 예시 프로토콜은 이 분석에 대한 설정을 보여줍니다.

초파리 굴을 파고 터널을 파는 분석: 파리 유충의 조직 저산소증을 평가하는 방법

이 비디오는 비행 이동을 정량화하는 간단한 방법을 설명하고 수행된 등반 분석을 보여줍니다. 비행 등반 분석은 음성 지오택시 반응에 의존하는 운동 기능의 일반적인 테스트입니다.

플라이 클라이밍 분석: Drosophila melanogaster에서 일반 운동을 테스트하는 방법

Source:Siddarth Gunnala1, Nafisa M. Jadavji2,3,41Department of Biomedical Sciences, Midwestern University, Glendale, AZ, USA2Division of Integrative and Molecular Physiology, Department of Biomedical Sciences, Southern University of Illinois, Carbondale, IL, USA3Department of Child Health, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, Phoenix, AZ, USA4Department of Neuroscience, Carleton University, Ottawa, ON, CanadaThis video demonstrates hypoxia-induced climbing behavior in Drosophila...

Hypoxia-Induced Climbing Behavior of Drosophila melanogaster

아주 늦은 단계 Drosophila의 배아의 배아 표피 빠른 찔린 상처의 응답 분석을위한 생체 시스템을 제공하고, 포유 동물 모델로 번역 상처 치료에 대한 연구를 진행하기 위하여 유전자 조작 물질 또는 화학 물질 미세 주입 치료와 결합 될 수있다.

미세 주입 상처 분석 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 표피의 현지화는 응답 기자의 상처<em&gt; 초파리</em&gt; 태아.

여기, 우리는 연속 열 그라디언트를 사용 하 여 초파리 애벌레의 기본 환경 온도 결정 하는 프로토콜 제시.

초파리 애벌레의 열 환경 설정을 결정 하는 온도 분석 결과

선물이 산소 소비와 초파리 melanogaster 애벌레와 성인 두뇌에 있는 세포 외 산성화를 측정 하기 위한 프로토콜. 신진 대사 분석기는 적응 하 고 최적화 된 프로토콜 활용 됩니다. 마이크로 조직 억제는이 프로토콜의 중요 한 구성 요소 설계 하 고이 분석에 그들의 사용을 위해 특히 창조 되었다.

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

이 프로토콜은 배아에서 성인에 이르기까지 모든 발달 단계에서 Drosophila의 생존 가능성을 평가하기 위해 고안되었습니다. 이 방법은 상이한 유전자형 또는 성장 조건의 생존 가능성을 결정하고 비교하는 데 사용될 수 있다.

초적혈구 멜라노가스터의생존능력을 배아에서 성인으로 평가하는 직접적이고 간단한 방법

혈액-뇌 장벽 무결성은 신경계 기능에 매우 중요합니다. Drosophila melanogaster에서는,혈액 두뇌 방벽은 늦은 배아 발생 도중 신경교 세포에 의해 형성됩니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 태아 및 제 3 instar 애벌레에 있는 혈액 두뇌 방벽 대형 및 유지보수를 위한 분석하는 방법을 기술합니다.

초파리 멜라노가스터의 혈액-뇌 장벽 무결성에 대한 분석

이 프로토콜은 전통적인 포유류 모델에 대한 대안으로 운동 기능 장애의 정량화를 통해 초파리의 신경 독성을 평가하기 위한 고처리량, 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 민감하고 재현 가능하며 윤리적으로 유리한 모델을 사용하여 제약 화합물, 환경 제제 또는 유전자 변형의 신경독성 영향을 평가하는 것을 목표로 합니다.

신경독성에 대한 판독으로서의 Drosophila melanogaster 의 운동 기능 장애에 대한 행동 분석

학습하세요 Drosophila melanogaster 애벌레에서 저산소증을 검출하는 행동 분석법을. 터널링 및 굴착 행동을 모니터링하여 조직 산소 결핍을 식별하고 유전자 돌연변이 연구에 활용하는 방법입니다.

초파리 melanogaster 애벌레에서 Hypoxia의 검출에 대 한 분석 결과 내/터널링

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