使用斑马鱼进行DNA复制时间分析 在体 内 模型系统

本实验的总体目标是从不同发育阶段的斑马鱼胚胎中生成全基因组DNA复制时间图谱。该方法有助于回答细胞周期和染色质生物学领域中的关键问题，例如胚胎发育过程中发生的染色质变化如何影响DNA复制叉的起始。该技术的主要优势在于，它能够绘制出在胚胎发育特定阶段体内发生的DNA复制动态变化图谱。

尽管该方法可揭示斑马鱼发育过程中DNA复制的变化，也可应用于其他系统或模式生物，例如尾索动物、青蛙和果蝇。通常，初学者可能在该方法的操作上遇到困难，因为从斑马鱼胚胎制备单细胞悬液需要一定的练习。在收集胚胎的前一晚，将数十条用于繁殖的成鱼以大致相等的雌雄比例放入繁殖缸中。

根据实验需求，采用以下繁殖策略之一。第一种繁殖策略：将数条雄性和雌性斑马鱼分别放入独立的繁殖缸中，并使用隔板将雄鱼与雌鱼隔开。若采用此方法，需设置多个不同的繁殖缸，并将每缸的胚胎混合收集，以确保生物学变异性能够代表整个种群。

对于第二种繁殖策略，将数十条雄性和雌性斑马鱼放入一个大型繁殖缸中进行交配。只要胚胎数量足够多，即可采用此策略。可以合理地认为这些胚胎来源于多种不同的亲鱼，因此在遗传上具有种群代表性。

为了进行定时交配，应在早晨光照周期开始后立即进行。让鱼在浅水中交配10分钟，底部放置假底，以便胚胎能够穿过。10分钟后，通过将水和胚胎倒入滤网中，并用洗瓶冲洗至一个10厘米的培养皿中来收集胚胎。

将同一时间点收集的所有胚胎合并，标记收集时间，并立即置于28.5摄氏度的培养箱中。为确保收集到同步发育的胚胎，必须每隔10分钟收集一批胚胎，这一点在胚胎发育的最早阶段尤为重要。

单对交配的成虫一天内可获得数百个胚胎。让成虫以10分钟为周期进行交配，直至每次获得的胚胎数量少于20个为止。收集胚胎后约1至1.5小时，将胚胎从培养箱中取出，在体视显微镜下观察，筛选并去除死亡和未受精的卵。

计数胚胎，并以每10厘米培养皿100个胚胎的密度进行放置。加入新鲜的E3培养基，将胚胎放回28.5°C的培养箱中。当胚胎发育至目标阶段时，根据《斑马鱼胚胎发育各阶段》在光学显微镜下通过形态学特征确认发育阶段。

如果胚胎处于48小时或更早的发育阶段，将最多1500个处于相同发育阶段的胚胎转移至一个15毫升的锥形管中，并使用E3培养基洗涤数次。每100个胚胎加入1毫升E3培养基和20微升Pronase溶液，轻轻摇动。单个管中最多可使用15毫升E3培养基对1500个胚胎进行去绒毛膜处理。将管子侧放，使胚胎均匀铺成一层，以确保最大的表面积与体积比。

每两到三分钟轻轻振荡试管一次，直至所有胚胎的绒毛膜完全脱落。总脱膜时间将根据蛋白酶的活性而有所不同。移除上清液后，用 10 毫升 E3 培养基轻轻冲洗胚胎三次。

将胚胎置于冰上并除去残留的 E3 后，每 500 个胚胎使用 1 毫升 freshly prepared、冰冻的去卵黄缓冲液洗涤样品。接着，用 P1000 轻柔地将胚胎上下吹打 5 至 10 次，以破坏卵黄囊。然后，将 1 毫升样品转移至 1.5 毫升微量离心管中，在 4 °C、500 × g 条件下离心 5 分钟。

样品的吹打力度应足够充分，以形成单细胞悬液，但不可过度导致细胞裂解。此步骤需要一定练习。移除上清液后，用一毫升预冷的1×PBS洗涤沉淀，以去除林格氏液。

然后，再次离心样品。小心吸除上清液，并将细胞重悬于 1 毫升 1× PBS 中。接着，将离心管置于冰上。

向一个15毫升的锥形管中加入3毫升预冷的乙醇，并在低速下轻轻涡旋振荡该乙醇管。使用P1000移液器，将斑马鱼胚胎细胞悬液缓慢滴加到乙醇中，同时持续涡旋振荡。总共加入1毫升胚胎细胞悬液，最终得到75% EtOH的固定溶液。

加入一毫升细胞悬液后，轻轻摇动试管混匀，并将试管平放在零下20摄氏度环境中至少一小时，或在冷冻条件下保存两到三周。为对胚胎DNA进行染色，在从零下20摄氏度取出经乙醇固定的胚胎细胞后，以1500 × g离心力在4摄氏度下离心5分钟。将试管置于冰上，小心移除上清液。

然后，使用 P1000 移液器将细胞轻轻重悬于 1 毫升新配制的预冷 PBS-BSA 中。在 4 摄氏度、1500 × g 条件下离心 5 分钟，随后将样品置于冰上。接着吸除上清液，每 1,000 个胚胎加入 200 微升碘化丙啶染色液，并将细胞重悬。

将细胞置于冰上，在PI溶液中孵育30分钟，每5分钟轻轻混匀一次。在冰上将一个40微米的尼龙细胞筛网置于50毫升锥形管上。然后轻轻吹打细胞，混匀并使细胞溶液通过筛网过滤。

使用注射器推杆平坦的内端，轻轻打散滤网上残留的任何细胞团块。每 1,000 个胚胎使用 500 µL 冷的 PBS-BSA 将细胞冲洗过筛。将一个 40 µm 滤网置于冰上盛装的 15 mL 离心管口，将来自 50 mL 离心管的细胞悬液再次过滤至该 15 mL 离心管中。

最后，使用适当的细胞分选仪器，将激光激发波长设为 561 纳米，发射光检测设为 610 ± 20 以检测碘化丙啶。分选细胞后，按照文本方案进行进一步分析。为确定读段比对质量，必须首先使用 mapQ 值的统计信息将测序数据比对至基因组。

此外，计算得到的读段长度统计结果以直方图形式展示，呈现所有测序读段的插入片段大小分布。本实验的中位插入片段长度为 170 bp。该柱状图展示了总比对读段、带有低质量标记的读段、成对读段比对到不同染色体的读段、成对读段间距超过距离阈值的读段以及 PCR 重复序列的读段统计信息。

此处列出了斑马鱼样本典型测序运行中总比对读段数、未比对读段数和未配对读段数、覆盖度以及读段分辨率的代表性数值。经过滤后，在不同大小的窗口中确定读段数，并对数据进行平滑化和标准化处理。此处展示了生物学重复样本中代表性斑马鱼染色体典型的平滑化和标准化的复制时序谱图。

生物学重复与实验重复的曲线图谱应高度相似，并在染色体全长范围内表现出高相关性。图谱还应在全基因组范围内表现出复制时间值的高相关性。颜色图谱表示皮尔逊相关系数。

在进行该操作时，最重要的是确保收集到处于同步发育阶段的胚胎。完成该操作后，还可采用其他方法，如吗啉寡核苷酸注射或CRISPR-Cas9诱变技术，以回答更多科学问题，例如：DNA复制与其他发育过程之间协调作用的机制是什么？观看本视频后，您应能够充分掌握如何从同步发育的斑马鱼胚胎中收集细胞周期特定阶段的细胞。

这些样本的收集对于生成全基因组DNA复制时间图谱至关重要。