Name: 식물-미생물 상호작용 연구 위한 실험실 생태계의 건설에 대 한 생태계 제조 (EcoFAB) 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 학습하세요 EcoFAB 제작 프로토콜을 통해 식물-미생물 상호작용을 연구하는 방법을 배우세요. 3D 프린팅 기술로 제작된 이 생태계 모델은 정밀한 실험 환경에서 뿌리 형태학 및 대사체 분석을 가능하게 합니다.

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이 작품의 로렌스 버클리 국립 연구소 계약 번호에서 미국 에너지 부의 과학의 사무실에서 지 원하는 실험실 감독 연구 및 개발 (LDRD) 프로그램에 의해 지원 되었다 드-AC02-05CH11231 그리고 미국의 에너지 사무실의 과학 계열에서에서 UC 버클리를 상을 드 SC0014079. 분자 주조에서 작업 아래 미국 부의 에너지 계약 번호를 지원 했다 드-AC02-05CH11231입니다. 우리 또한 그들의 도움에 대 한 수잔 M. Kosina, 캐서린 루이, 벤자민 P. 보 웬과 로렌스 버클리 국립 연구소에서 벤자민 제이 콜을 감사합니다.

주의:이 프로토콜은 유해 화학 물질, 날카로운 물체, 전기 장치, 핫 객체, 및 상해에서 발생할 수 있는 다른 위험의 사용을 포함. 적절 한 개인 보호 장비 (PPE, 예., 화학적으로 저항 하는 장갑, 안전 안경, 연구실 코트, 긴 옷, 폐쇄 터진 신발, 등.) 착용 되어야 한다, 및 적절 한 안전 절차 (안전 교육, 연기 후드의 사용 등) 따라야 한다.
1. EcoFAB 장치 제작: PDMS 레이어 (그림 2 및 그림 3) 주조
<ol><li>EcoFAB 금형 (설계 파일에서 사용할 수 있습니다 3 차원 인쇄 기술을 사용 하 여 구성. 세 부분을 포함 하는 각 형: 캐스팅 프레임, 추천된 몰드 베이스 및 삽입, 그림 2와 같이. 몰드 베이스를 인쇄 하 고 플라스틱 3D 프린터를 사용 하 여 엄밀한 불투명 광에서 삽입. 100 µ m 해상도의 최소를 활용 하 고 아크릴로 니트 릴 부 타 디 엔 스 티 렌 (ABS)와 함께 캐스팅 프레임 인쇄.</li>
	<li>일회용 1 L 용기에 경화제와 실록 산 고무 베이스의 40 mL를 혼합. 원하는 실험 (2.1, 2.2 단계)에 따라 자료/경화제 (5:1, 15:1, 또는 30: 1) 탄성 중합체의 다른 비율 (v/v)을 사용 합니다. 1.3 1.8에 혼합물의 모든 종류에 대 한 단계를 진행 합니다. 주의: 화학적으로 저항 하는 장갑, 안전 안경, 및 다른 PPEs 착용.</li>
	<li>고무 혼합물에서 기포를 제거 하려면 적어도 30 분 동안 진공 챔버에 컨테이너를 놓습니다.</li>
	<li>조립된 3 차원 인쇄 된 플라스틱 금형 (그림 3A)에 혼합물을 부 어 하 고 4 h (그림 3B) 85 ° C에서 난방 블록에 금형을 유지. 주의: 화상을 피하기 위해 보호구를 착용 하십시오.</li>
	<li>금형을 하자 5 분에 대 한 진정. 다음 금형에서의 삽입을 부드럽게 꺼내 (그림 3C), 유틸리티 나이프 PDMS (응고 고무 혼합물) 그들 (그림 2D)을 분리 하 고 주조 프레임 사이 천천히 삽입.</li>
	<li>금형 주조 프레임 (그림 3E)에서 PDMS를 베이스를 누릅니다. 부드럽게 가장자리 (그림 3 층), 몰드 베이스에서 PDMS 레이어를 분리 하는 칼 또는 다른 도구를 사용 하 고 천천히 껍질 그것을 금형 표면 (그림 3)에서.</li>
	<li>입구를 만들고 ~1.6 m m 구멍 입구 및 출구 포트는 15 여 PDMS 레이어에 콘센트 채널 측정 무딘 바늘 (그림 3 H, I). 참고: 표준 몰드는 입구 및 출구 포트, 와이드 콘센트 형만 입구 포트 (그림 3 H, I) 필요.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 PDMS 레이어. 의 가장자리를 트림 참고: 트림된 PDMS 레이어 m m x 51mm 사각형 작은 EcoFAB 장치에 대 한 ≥76 및 큰 EcoFAB 장치에 대 한 직사각형 83 m m x ≥102 이어야 한다.</li>
</ol>2. EcoFAB 장치 제작: 현미경 슬라이드 (그림 3 및 그림 4)에 레이어 PDMS를 화학적으로 연결
<ol><li>영구적으로 현미경 슬라이드 PDMS 레이어를 결합<ol>
<li>린스 (게 15:1 고무의 기본 치료 에이전트 혼합물) PDMS 층과 7.6 × 5 cm 현미경 접합 측면 메탄올을 가진 슬라이드와 다음 날 려 건조 압축 공기 또는 초 순수 질소 총. 주의: 메탄올 독성이 있다. 증기 두건 및 보호 눈 덮개, 장갑 및 다른 PPEs 착용 합니다.</li>
		<li>현미경 슬라이드 및 PDMS 층에 자리는 플라즈마 청소기의 접합 면을 향하도록 (그림 3J)와 함께. 플라즈마 클리너를 사용할 수 없는 경우 2.2 단계로 건너뜁니다.</li>
		<li>챔버와 청소기, 플라즈마의 가스 배출 밸브를 닫고 진공 및 펌프 챔버 내려 1 분 동안.</li>
		<li>플라즈마 발생기의 전원 켜고 1 분에 대 한 무선 주파수 (RF) 수준 "안녕하세요"에 전환.</li>
		<li>진공 펌프와 플라즈마 전원 끄고 챔버 분위기를 환기.</li>
		<li>플라즈마 챔버에서 현미경 슬라이드 및 PDMS 층 밖으로 하 고 신속 하 게도 압력 (그림 3 L) 슬라이드에 PDMS 층의 모든 4 개의 가장자리를 누릅니다. PDMS 계층 (루트 챔버)의 센터 타원형 영역 슬라이드를 만지지 않는다 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>20 분 추가 보안 PDMS 레이어와 현미경 슬라이드 사이의 영구 결합 블록 난방 120 ° C에 봉인 된 EcoFAB 장치를 놓습니다.</li>
		<li>장치를 하자 칼으로 PDMS 층의 5 분 여분의 가장자리에서 트림에 대 한 진정.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경 슬라이드 PDMS 층의 가역 물리적 씰링<ol>
<li>씰링 기술 가역 사용자 지정 클램프 (3 차원 플라스틱 프린터 또는에서 가공된 금속, 그림으로 인쇄 하거나 그림 4에 나와 있다)의 집합을 사용 합니다.<ol>
<li>바닥판 클램프에 컷아웃으로 현미경 슬라이드를 놓고 슬라이드 위에 PDMS 레이어 (경화 에이전트 혼합물을 5:1 탄성 기지의 만든)를 정렬 합니다.</li>
			<li>톱 클램프 플레이트 PDMS 레이어를 놓습니다. 4 개의 16 진수 캡 나사, 나사는 너트에 클램프의 위쪽에서 스레드는 방향을 사용 하 여 위쪽 및 아래쪽 접시를 보호 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>현미경 슬라이드에 직접 붙는 PDMS<ol>
<li>현미경 슬라이드 위에 PDMS 레이어 (에이전트 혼합 치료에 30: 1 탄성 기지의 만든)를 배치 합니다.</li>
			<li>PDMS 레이어를 슬라이드를 누릅니다. 부드러운, 매우 접착제 PDMS 레이어 (30: 1) 클램프 (그림 3 L)에서 영구 화학 결합 또는 물리적 압박 없이 방수 물개를 창조 하는 슬라이드에 충실 해야한다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EcoFABs 살 균
<ol><li>EcoFAB 장치 초순 물으로 린스.</li>
	<li>EcoFAB 컨테이너에서 한 EcoFAB 장치를 놓고 장치 빠져들 때까지 70% 에탄올을 추가 합니다. 컨테이너 뚜껑 닫고 젖은 에탄올과 내 모든 서피스를 부드럽게 흔들어. EcoFAB 장치의 루트 성장 챔버 에탄올, 아주 몇몇으로 채워집니다 또는 공기 거품 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>실 온에서 30 분 부 화, 후 부 어 70% 에탄올, 고 5 분 동안 100% 에탄올과 외피를 반복 합니다.</li>
	<li>에탄올, 밖으로 배수 및 완전히 말리는 것을 층 류 두건에 16 h에 대 한 멸 균된 EcoFAB를 품 어. 가능한 경우, UV 빛 1 h 후드 내에서 설정 하 여 시스템을 소독. 주의: 작업 자외선 불빛을 할 때 적절 한 보호구를 착용 하십시오.</li>
	<li>살 균 후드 또는 차후 사용을 위해 압력가 가방에 멸 균된 EcoFABs를 저장 합니다.</li>
</ol>4. EcoFABs led 성장 조명 (그림 5)
<ol><li>EcoFAB 컨테이너에 스트립 LED 연결<ol>
<li>9 LED 클립의 EcoFAB 컨테이너에 위치를 표시 합니다. 첫 번째 클립 (그림 5A), 가장자리를 따라 컨테이너의 하단에서 최대 120 m m와 함께 시작 하 고 10 m m 떨어지고 각 다음 클립 클립 위치는 컨테이너 주위 소용돌이에 밖으로 표를 진행. 컨테이너 주위에 두 번 포장 1 m LED 스트립을 허용 하는 9 클립 나선형</li>
		<li>뜨거운 접착제 각 LED 클립 클립의 장착 구멍의 위치와 정렬 컨테이너에 뜨거운 접착제의 두 dabs 추가 하 여 위치를 표시. 접착제의이 두 dabs에 클립 구멍을 눌러 다음 구멍 위에 접착제의 또 다른 덩어리를 추가 합니다. 9 클립 나선형 (그림 5B) 형성 될 때까지 모든 클립에 대 한 절차를 반복 합니다. 화상을 피하기 위해 뜨거운 접착제로 작업 하는 경우 주의: 장갑, 기타 보호구를 착용 하십시오.</li>
		<li>컨테이너에 직면 하는 Led와 LED 스트립 나선형 모양에서 클립을 통해 스레드. 스트립 두 번 원형 한다 (그림 5C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>LED 연결 컨트롤러 (그림 5D 디스플레이 조명 조명, 컨트롤러의 프로그래밍 EcoFAB 챔버를 4.3 단계에서 설명)와 전원 공급 장치를 제거 합니다. 주의: 감전 위험: 전원 공급 전선을 연결할 때 연결 되지 않은 있는지 확인 하십시오.<ol>
<li>(회로도 컨트롤러 설치의 그림 표시 됩니다그림 5E ) 2 선 케이블을 사용 하 여 컨트롤러의 "입력:: V +" 및 "입력:: 브가-" 단자에 전원 공급의 긍정 및 부정적인 단자를 연결 합니다.</li>
		<li>컨트롤러에 대 한 "출력"로 맨 여성 케이블의 맨 끝에서 부정적인 리드를 연결 합니다. 참고: 그것은 최대 5 개의 1 m LED 스트립을 지원할 수 있다 그래서이 프로토콜에 이용 되는 컨트롤러에 5 채널 있습니다.</li>
		<li>모든 긍정적인 리드 케이블의 소형 커넥터 (해당 되는 경우 하나 이상의 채널이 필요), 접합을 연결 하 고 컨트롤러의 "출력 V +" 터미널에이 커넥터를 연결.</li>
		<li>각 LED는 그것의 자신의 채널을 제어할 수 있도록 케이블의 여성 끝에 각 LED 스트립을 연결 합니다. 원하는 경우 여성-남성 케이블 사용 하 여 범위를 확장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 원하는 라이트 사이클에 대 한 컨트롤러 프로그램</li>
</ol>5. EcoFABs에 성장 하는 식물
<ol><li>종자 살 균 및 발 아 참고: 종자 살 균과 모와 모든 다음 단계는 무 균 조건에서 수행 되어야 합니다. 아래에 설명 하는 살 균 과정은 애기 thaliana, Avena barbata, Brachypodium distachyon, Panicum virgatum의 씨앗 적당 하다. Panicum virgatum 씨는 살 균 과정을 하기 전에 1 시간에 대 한 60% 황산에 중단 되어야 합니다. EcoFAB 장치 당 1-2 씨앗 발 아 율 및 발 아의 동질성을 고려 하 고 준비 하는 것이 좋습니다.<ol>
<li>2 분 동안 70% 에탄올에 씨앗을 담가.</li>
		<li>피 펫와 에탄올을 제거 하 고 세 번 살 균 물으로 종자를 헹 굴.</li>
		<li>5 분 동안 10% 표 백제 솔루션에서 씨앗을 둡니다.</li>
		<li>표 백제 솔루션을 제거 하 고 철저 하 게 세척 살 균 수를 사용 하 여 세 번 씨앗.</li>
		<li>씨앗에 메 마른 물을 추가 하 고 7 일 동안 4 ℃ 냉장고에 microcentrifuge 튜브를 품 어.</li>
		<li>균등 하 게 phytagel 0.6%와 0.5 重 & Skoog (MS) 매체에 씨앗을 확산 하 고 작은 세공 테이프와 접시를 봉인.</li>
		<li>루트 길이 약 5 m m EcoFABs (그림 6A)에의 하는 식물을 성장. 제시 하는 실험에 대 한 여기, 16 h 빛/8 h 어두운 조명 정권 22 ° C 성장 챔버에 적용 하 고 식물을 품 어 EcoFAB ( Avena barbata 와 Brachypodium distachyon, 애기에 대 한 한 일에 전에 2-7 d thaliana 및 Panicum virgatum).</li>
	</ol>
</li>
	<li>EcoFABs 액체 매체 (그림 6)와 묘 전송<ol>
<li>무 균 주사기 또는 micropipette 사용 하, 3 시간, 살 균 물 EcoFAB 장치의 루트 챔버를 플러시 하 고 관심, 예를 들어 0.5 MS 매체 (그림 6B, 단계 5.1.6)의 성장 매체와 루트 챔버를 입력.</li>
		<li>신중 하 게 EcoFAB 장치 (그림 6 c)의 공장 저수지에 하나의 경종을 삽입 합니다. 참고: 루트 해야 합니다 수 완전히 침수 루트 챔버 내부 저수지 튀어나와 촬영으로.</li>
		<li>EcoFAB 장치를 피하고 컨테이너에 살 균 물 3 mL를 추가 합니다. 이 습도 증가 하 고 루트 챔버에서 매체의 증발을 줄일 것 이다.</li>
		<li>컨테이너, 닫고 작은 세공 테이프 (그림 6D) 뚜껑을 밀봉 합니다.</li>
		<li>식물 배양 기에는 EcoFAB를 배치 하거나 사용 하는 각 공장 (4 단계)의 성장에 적합 한 제어 온도 환경에서 EcoFAB 조명 시스템. 이 연구를 위해 설정 챔버 24 ° c</li>
		<li>주기적으로 성장 미디어 루트 성장 챔버 내부를 리필 하 여 컨테이너에 물을 추가 EcoFAB를 확인 하십시오. 무 균 조건에서 모든 단계를 수행 합니다. 참고: 초기 식물 성장 단계에 대 한 루트 성장 챔버의 채우는 필요한 모든 5 ~ 7 일입니다. 나중의 성장 단계에 대 한를 채우는 필요한 모든 2 ~ 3 일입니다. 원하는 경우를 사용 하 여 주사기 또는 피 펫 microcentrifuge 튜브에 루트 성장 챔버 로부터 루트 exudate 솔루션을 수집 하 고;-80 ° C 냉장고에 저장 또한, 루트 형태학 젤 영상 또는 현미경 이미지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EcoFABs 고체 기판으로 묘 전송<ol>
<li>(그림 3 K, 그림 4); 현미경 슬라이드에 연결할 사용자 지정 클램프의 집합을 사용 하는 경우 5:1 혼합 고무 경화제를 기본 조작 루트 챔버를 사용 하 여 또는 PDMS 레이어 만든 30: 1의 기본 PDMS 레이어 직접 (에 설명 된 대로 단계 2.2) 슬라이드를 준수 하는 경우 에이전트 혼합 치료를 선택 합니다.</li>
		<li>3 단계에서 설명한 대로 EcoFAB 챔버를 소독.</li>
		<li>신중 하 게 루트 챔버로 멸 균된 토양/모래를 추가 하 고 거꾸로, PDMS 레이어를 설정 하 고, 기판 루트 챔버에 추가. 이후이 접착을 감소 시킬 것 이다 현미경 슬라이드 접촉 될 지역에 있는 미 립 자가 하지 마십시오.</li>
		<li>현미경 슬라이드 PDMS 레이어 위에 놓고 모든 가장자리를 단단히 누르십시오. 아무 토양/모래 여 저수지에서 폭포를 신중 하 게 EcoFAB 장치를 플립. 참고: EcoFAB 장치에 게 5: 1의 기본 에이전트 혼합 치료, 인감을 확보 하 여 사용자 지정 클램프를 사용 합니다.</li>
		<li>액체 매체 또는 EcoFAB 장치의 입구 또는 출구 채널을 통해 물 흐릅니다 그리고 단계 3.3에에서 설명 된 대로 그것의 식물 저수지에는 종묘를 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EcoFABs로 미생물을 추가<ol>
<li>미생물 식민지 파운드 국물의 8 mL와 인큐베이션 튜브 전송 OD 0.5 (약 12 h)를 성장 하 고.</li>
		<li>15 mL 원심 분리기 관으로 문화 솔루션을 전송 하 고 작은 미생물을 3000 x g에 5 분 동안 상 온에서 원심.</li>
		<li>상쾌한, 제거 하 고 대상 EcoFAB에에서 사용 되는 식물 성장 매체의 8 mL을 추가. 미생물의 펠 릿을 일시 중단 하 고 원심 3000 x g에 5 분 동안 실내 온도에 튜브.</li>
		<li>5.4.3 단계를 반복 합니다. 두 번 완전히 제거 하려면 파운드 영양소 추적 합니다.</li>
		<li>그것의 광학 조밀도 600에서 약 0.5까지 씻어 미생물 펠 릿 식물 성장 매체 추가 nm.</li>
		<li>EcoFAB 콘센트를 통해 루트 챔버에 미생물 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다. 이 발행물에 사용 되는 종자 식물 뿌리의 2-3 일, 그리고 시작된 식민지 루트 표면 내 여행.</li>
		<li>Chemiluminescent 설계, 대 한 유도 luciferase 식 식물 성장 매체에서 유도 (1 mM IPTG)를 포함 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 대사 산물 루트 Exudates EcoFABs에서의 프로 파일링
<ol><li>LC/MS에 대 한 샘플 준비 대사체학 분석을 기반으로<ol>
<li>루트 exudates는 lyophilizer에서 EcoFABs에서 수집 된 microcentrifuge 튜브를 넣고 튜브에서 모든 물을 제거를 lyophilizer 설정.</li>
		<li>각 관으로 LC MS 학년 메탄올의 300 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 sonicate. 주의: 메탄올 작업 시 보호구 착용.</li>
		<li>원심 분리기에 튜브를 배치 하 고 5 분 동안 3000 x g에서 원심.</li>
		<li>새로운 microcentrifuge 튜브 표면에 뜨는 솔루션을 전송 하 고 진공 집중 장치에서 메탄올을 증발.</li>
		<li>각 관에 1mm LC-MS 내부 기준으로 메탄올의 150 µ L을 추가 하 고 12 h 동안 4 ℃ 냉장고에 튜브를 품 어.</li>
		<li>5 분 동안 3000 x g에서 튜브 원심 고는 상쾌한 0.22 μ m 필터 튜브로 전송.</li>
		<li>원심 필터 튜브, 그리고 삽입의 200 µ L와 2.0 mL LC/MS 튜브에 필터링된 솔루션을 전송.</li>
		<li>LC/MS 랙 내부 튜브를 배치 하 고 LC/MS 자동 샘플러 내부 랙 로드.</li>
	</ol>
</li>
	<li>데이터 분석<ol>
<li>대사 산물 아틀라스와 사용자 지정 파이썬 스크립트26 의 접근 하거나 다른 데이터 분석 소프트웨어를 사용 합니다.</li>
		<li>대사 산물 m에 따라 식별 / 대사 산물 표준 라이브러리를 사용 하 여z 값, 보존 기간 및 복합 조각화 패턴. 27
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 대량 분 광 이미징 EcoFABs (그림 7)에서 식물 뿌리의
참고: 사용자 지정 클램프 (그림 7A) 에이전트 혼합 치료에 기본 5:1 고무의 만든 EcoFAB 장치 루트 nanostructure 초기자 질량 분석 (NIMS) 칩,,2829,30에 스탬프 사용 됩니다. 이후 PDMS 레이어를 반대로 NIMS 칩의 표면에 접착 될 수 있다.
<ol><li>1 시간에 대 한 자외선과 NIMS 칩 표면 소독.</li>
	<li>인큐베이터에서 성장 식물을 가진 EcoFAB를 선택 하 고 메 마른 후드에.</li>
	<li>EcoFAB 컨테이너를 열고 클램프의 상단 플레이트를 제거 합니다.</li>
	<li>공장 내부, 함께 PDMS 레이어를 들어올린 NIMS 칩 (그림 7BD, E)에 식물을 가진 PDMS 레이어를 신중 하 게 연결. 참고: 일단 루트 NIMS 칩 표면 접촉, 그것 하지 수 이동 해야 합니다. 이 루트 대사 산물의 "번짐"을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>부드럽게 눌러 PDMS 층을 통해 뿌리에 뿌리는 완전히 NIMS 표면 접촉 될 때까지. 20 분 NIMS 표면에 뿌리를 둡니다.</li>
	<li>PDMS 레이어 NIMS 칩, 다시 피하는 NIMS 표면에서 이동 하는 루트에서에서 식물을 포함 하 여 들어올립니다. 원하는 경우 클램프에 공장을 반환 합니다.</li>
	<li>사용자 지정 MALDI 격판덮개에 NIMS 칩을 부착 하 고 질량 (그림 ℃) 이미징 MALDI 분석기에 접시를 로드.</li>
	<li>OpenMSI 프로그램을 사용 하 여 루트 대사 (그림 7D-G)31의 NIMS 이미지 생성.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

프로토콜 보고 여기 생태계 제조를 사용 하 여 만드는 EcoFABs 매우 통제 된 실험실 조건에서 생물학 연구 체계적인 공장 커뮤니티 리소스 제공. 3D 인쇄에 발전 구성 하 고 EcoFAB 디자인을 반복적으로 정제에 대 한 광범위 하 게 액세스할 수 있는 기술을 제공 합니다. 여기에 제시 된 루트 챔버 현미경 이미징 및 불 임, 식물-미생물 상호작용을 조사 하기 위해 미생물의 제어 추가 사용을 유지 수 발견 된다. EcoFAB 플랫폼은 다양 한 식물 종에 호환 됩니다. 그것은 좁은 루트 챔버 내 식물을 성장 하는 추가 실험 자연 환경에서 성장 하는 식물에 연구 결과 일반화 하는 데 필요한 것입니다 그런의 생리 적 효과 인식 해야 합니다.
살 균 챔버와 LED 성장 빛의 사용 파장, 강도와 기간, 식물의 성장과 동시에 관련 된 생리 적 매개 변수를 포함 하 여 다양 한 조명 조건, 효과의 조사 수 있습니다. 가역 결합 루트 챔버 공간 생화학 및 유전 분석을 위한 고체 샘플을 수집으로 뿐만 아니라 고체 기판의 사용을 허용 합니다. 토양, 모래, 석 영 구슬 등 고체 기판의 응용 프로그램 EcoFABs를 사용 하 여 생태학적으로 관련 실험실 생태계 구축의 가능성을 제공 합니다. 그러나, 여기에 제시 된 사용 포화 액체 (수경 문화) 대부분 토양의 정확 하 게 반영 되지 않은 중요 한 것 더 모든 시스템 그들은 더 나은 대표는 토양 내의 공기 주머니를 유지 하기 위해 이러한 디자인 수정 자연 토양
간단한 카메라와 현미경을 사용 하 여 이미지 루트 시스템 형태 개발 모두 대량 세포 수준에서 설명 되어 있습니다. 이 적합성 모니터링 루트 형태학 이미징 및 정량화에 대 한 식물 생리 및 분자 신호 공장 genotypic adaptions 성장 조건에 의해 실행의 규제 메커니즘을 이해 하는 데 도움이 됩니다. 그러나, 생리 루트 개발 공부에 대 한 제한은 EcoFAB 장치의 현재 가로 배치입니다. 자연적인 환경에서 뿌리 gravitropic 응답 루트 시스템의 주로 수직 개발을 리드. 따라서, 및 자연 환경에서 몇 가지 요인에 다릅니다 가능성이 여기에 제시 된 수평 시스템 루트 챔버의 수직 위치와 EcoFAB 시스템의 제작은 미래 EcoFAB 버전에 대 한 바람직한 목표. 현재 EcoFAB 장치는 가로로 배치는, 비록 루트 형태학 매개 변수 다양 한 조건에서 또는, 미생물에 대 한 응답에서의 분석 가능 하다. 고해상도 이미지 캡처 단일 격리 또는 부품 다양 한 영양소 충분 하 고 부족 한 조건에서 식민지는 어떤 식물에 대 한 정보를 제공 하는 커뮤니티의 루트 식민 역학 적용할 수 있습니다. 그것은 이러한 연구 결과 식물 microbiomes 조립 방법, 그리고 이러한 역학 시간에 따라 변경 하는 방법에 중요 한 새로운 통찰력을 제공할 것입니다 예상, 뿌리로 예 개발.
미세 장치 사용 매우 어린 식물의 이미지 그리고 일반적으로 수집 하는 대사 산물의 양을 LCMS 분석에 대 한 충분 하지 않습니다. 토양 기반 시스템 rhizotrons, chemiluminescent 구문 (Glo-루트) 또는 NMR 기반 방법33,34중 식물 변형 때 루트 형태학의 이미지를 허용 한다. 이러한 시스템에서 대사 산물 기사는 대용량 샘플의 시간이 소요 됩니다. EcoFABs는 둘 다의 조합: 제조 미세 소자와 비슷합니다. EcoFABs는 간단 하 고 재현, 저렴 한 설계 되었습니다 하지만 작은 또는 큰 루트 시스템, 그들의 생식 단계와 식물을 성장 챔버의 크기를 조정할 수 있습니다. 루트 형태 변화와 루트 나옴의 동시 관측 가능 하다. 시스템은 살 균, 특정 미생물의 제어 추가 가능.
EcoFABs는 제어 소개 및 미생물 대사 산물의 샘플링 수 있도록 설계 되었습니다. 특히, 루트 성장 약 실에서 수집 된 샘플은 대량 분 광 대사 산물 프로 파일링에 대 한 충분 한 것 발견 된다. 질량 분석 이미징의 통합 (예., NIMS 기술은 여기에 제시 된) 루트 시스템의 대사 산물 공간 분포의 비 파괴적인 접근 방식을 제공 합니다. 이 기술은 도움이 미래에 안정 동위 원소 추적 실험 및 특정 대사 산물36매핑 미생물 지역화 됩니다. 이 프로토콜은 단일 격리를 중점적으로, 동일한 디자인은 더 복잡 한 사회에 대 한 확실히 사용할 수 있습니다. 샘플 볼륨 및 바이오 매스는 EcoFABs 내의 DNA 시퀀싱 기술의 더 통합에 대 한 충분 한 이상,이 중요 한 것 특성화 및 미생물 지역 사회 구조와 유전자 식 모니터링을 높습니다.
결론적으로,이 프로토콜 내용을 쉽게 구현 하 고 확장할 수 주위 연구자에 의해 간단 하 고 접근 방법에 중점을 두고 식물 세균 상호 작용의 수사를 위한 실험실 생태계의 제조는 세계입니다. 현재 노력 각 EcoFAB 것 이다는 독립적으로 제어 빛과 온도 실험실 및 온도 제어 시스템의 통합 간의 재현성을 보여주는 겨냥 된다. 자동된 샘플링의 통합과 관련 공장 microbiomes EcoFABs 내의 설정 재현 가능한 프로토콜의 개발과 EcoFAB 루트 챔버의 채우는 시스템의 더 발전 될 것입니다.

농업에 유익한 식물 미생물의 응용 프로그램 지속 가능한 식품 및 바이오 연료 생산 증가 인구1,2,,34에 대 한 제공을 증가를 큰 잠재력을 제공 합니다. 작업의 상당한 양의 식물 양분 통풍 관, 스트레스, 관용 그리고 질병5,6,,78저항에에서 식물 microbiomes의 중요성을 지원합니다. 그러나, 그것은 필드 생태계의 복잡성 및 관련 된 irreproducibility과 미생물 구성 및 유전학을 정확 하 게 제어 하는 무 능력 때문에 식물-미생물 상호작용의 이러한 메커니즘을 조사 어렵다 (예., 사용 미생물 돌연변이)4,,910.
한 전략 수 있도록 단순화 된 모델 생태계를 구성 하는 제어, 복제 된 실험실 실험 조사 식물-미생물 상호작용 추가 필드10,11, 테스트할 수 있는 통찰력을 생성 하 12. 이 개념은 토양 가득 냄비에 성장 하는 식물을 사용 하 여 전통적인 접근에 또는 온실 또는 incubators13내 한 석판에 빌드합니다. 이러한 가능성이 남아 있지만 가장 널리 사용 되는 방법, 그들은 정확 하 게 모니터링 하 고 식물 성장 환경 조작 능력 부족. 이 끝을 rhizoboxes와 rhizotrons 주요 개선 아래 지상 프로세스14,15, 공부 하는 능력에 나타내고, 토양16rhizosphere 대사 산물을 분석 하기 위한 첫 번째 프로토콜 출판 되었다. 더 최근에, 높은 처리량 분석을 사용 하려면 고급 미세 장치13,17 공장 칩18,19,20, RootArray 및 RootChip21, 같은 되었습니다. 액체 흐름 중간에 작은 모델 식물 애기 thaliana 의 초기 성장 단계를 모니터링할 마이크로미터 스케일 공간 분해능 식물 형질에 대 한 효율적인 도구 개발. 최근, 2 층 영상 플랫폼 미세 플랫폼22묘 종 단계에서 애기 thaliana 의 루트 머리 이미징 수 있도록 설명 했다.
여기, 제어 실험실 장치 (EcoFABs)을 건설 하기를 위한 상세한 프로토콜 제공, 식물 세균 상호 작용을 연구 하 고 공연에 대 한 애기 thaliana, Brachypodium 포함 하 여 식물을 그들이 사용할 수 있는 다양 한 공부 하는 distachyon23, 생태학적으로 중요 한 야생 귀리 Avena barbata 고 bioenergy 작물 Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB는 두 가지 기본 구성 요소를 포함 하는 메 마른 식물 성장 플랫폼: EcoFAB 장치 및 살 균 식물 크기의 투명 한 컨테이너. 장치 제조 캐스팅 PDMS를 포함 하는 프로세스입니다 (PDMS)에서 만든 EcoFAB 3D 인쇄 된 플라스틱 몰드에서 레이어 및24,25 보고 메서드를 사용 하 여 이전 하는 현미경 슬라이드 위에 PDMS 레이어를 결합 . 이 프로토콜 (그림 1)에서 EcoFAB 워크플로, 장치 제조, 살 균, 종자 발 아, 모 종 이식, 미생물 접종/cocultivation, 샘플 준비, 분석, 등의 세부 절차를 설명 합니다. 기본 워크플로 추가 수정 설명, LED 성장 조명 및 고체 기판의 활용 제어 컴퓨터의 설치를 포함 하 여. 이미징 루트 형태 조사 기법 활용, 미생물 식민 뿌리의 변화와 루트 exudates의 대량 분 광 이미징 설명 되어 있습니다. 우리 여기, 상세한 프로토콜 뿐만 아니라 쉽게 사용할 수 있는 재료에 따라 단순, 저렴 한 디자인 커뮤니티 리소스에 EcoFAB 플랫폼을 돌 것 이다 실험실 식물-미생물 연구 표준화 예상.

<table><tbody><tr>여기에서 사용할 수 있는 <td>3D 프린팅 맞춤형 금형</td><td>LBNL</td><td></td><td>STL 파일은 www.eco-fab.org 있습니다. 여기에 설명 된 EcoFAB 금형은 FATHOM에서 인쇄했습니다 : http://studiofathom.com</td></tr><tr><td>Dow sylgard 184 실리콘 엘라스토머 투명 키트</td><td>Ellsworth 접착제</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>에어 더스터 스프레이</td><td>VWR</td><td>75780-350</td><td>모든 압축 가스 살포기는 작동해야합니다</td></tr><tr><td>15 게이지 무딘 바늘</td><td>VWR</td><td>89166-240</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Tip이있는 5 mL 주사기</td><td>VWR</td><td>BD309646</td><td></td></tr><tr><td>3인치 x2" 현미경 유리 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB 상자</td><td>아마존</td><td>B005GAQ25Q</td><td></td></tr><tr><td>4" x 3 &frac14; &rdquo; 현미경 유리 슬라이드</td><td>Ted Pella</td><td>260231</td><td></td></tr><tr><td>4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB 상자</td><td>Amazon</td><td>B00P9QVOS2</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Trent Northen의 실험실에서 구할 수 있는</td><td>3D 인쇄 맞춤형 클램프</td><td>LBNL</td><td></td> STL 파일</tr><tr><td>멸균 후드</td><td>AirClean 시스템</td><td>AC600 시리즈 PCR 워크스테이션</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 주사기 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z117315-1EA</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige 및 Skoog (MS) 다량 영양소 염 기반</td><td>Phytotechnologies Laboratories</td><td>M502</td><td></td></tr><tr><td>Murashige 및 Skoog (MS) 미량 영양소 염 염기</td><td>Phytotechnologies Laboratories</td><td>M554</td><td></td></tr><tr><td>토양</td><td>Hummert International</td><td>Pro-Mix PGX</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71010-52-1</td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana</td><td>Lehle Seeds</td><td>WT-24 Col-4 Columbia 야생형</td><td></td></tr><tr><td>Brachypodium distachyon</td><td>LBNL</td><td>표준 Bd-21 라인</td><td>John Vogel의 실험실에서 구할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Panicum virgatum</td><td>The Samuel Roberts Noble Foundation</td><td>Alamo 스위치그래스</td><td></td></tr><tr><td>마이크로포어 테이프</td><td>VWR</td><td>56222-182</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS 등급 메탄올</td><td>VWR</td><td>JT9830-3</td><td></td></tr><tr><td>동결건조기</td><td>LABCONCO</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVAC 집중기</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant&trade; SPD111 SpeedVac</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC GV 원심 필터-0.22 &마이크로; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>액체 크로모토그래피 시스템</td><td>Agilent</td><td>Agilent 1290 LC 시스템</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive 질량 분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive&trade; 하이브리드 사중극자-Orbitrap MS</td><td></td></tr><tr><td>NIMS 칩 및 맞춤형 MALDI 플레이트</td><td>LBNL</td><td></td><td>자세한 프로토콜은 다음을 참조하십시오: doi:10.1038/nprot.2008.110</td></tr><tr><td>MALDI 질량 분석기</td><td>AB Sciex</td><td>TOF/TOF 5800 MALDI MS</td><td></td></tr><tr><td>나노 코팅 LED 그로우 라이트 스트립</td><td>LED 월드 라이팅</td><td>HH-SRB60F010-2835</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>LED 월드 라이팅</td><td>MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J</td><td></td></tr><tr><td>TC420 컨트롤러</td><td>Amazon</td><td>B0197U7R8Q</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 LED 클립</td><td>Amazon</td><td>B00N9X1GI0</td><td></td></tr><tr><td>핫 글루 건</td><td>Amazon</td><td>B006IY359K</td><td></td></tr><tr><td>암-벌거벗은 LED 커넥터 케이블</td><td>LED 세계 조명</td><td>HH-F05</td><td></td></tr><tr><td>암-수 LED 커넥터 연장 케이블</td><td>LED 세계 조명</td><td>HH-MF1</td><td></td></tr><tr><td>20AWG 2선 케이블</td><td>LED 월드 조명</td><td>6102051TFT4</td><td></td></tr><tr><td>WAGO 221-415 접합 커넥터</td><td>LED 월드 조명</td><td>221-415</td><td></td></tr></tbody></table>

식물-미생물 상호작용 연구 위한 실험실 생태계의 건설에 대 한 생태계 제조 (ecofab) 프로토콜

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

유용 식물-미생물 상호작용 가능성이 낮은 입력 음식과 bioenergy 생산 지속 가능한 생물 학적 솔루션을 제공 합니다. 이러한 복잡 한 식물 세균 상호 작용의 더 나은 기계적 이해 잘 수행 기본 생태 조사 식물-토양-미생물 상호작용으로 공장 생산 향상에 중요 한 될 것입니다. 여기, 생태계 제조에 대 한 상세한 설명을 제시, 특정 내 식물 세균 상호 작용의 기계 론 적인 연구에 대 한 환경 제어 실험실 서식 지 (EcoFABs)을 만드는 데 널리 3D 인쇄 기술를 사용 하 여 조건입니다. EcoFABs의 2 개 크기는 애기 thaliana, Panicum virgatum, Brachypodium distachyon, 등 다양 한 식물 종으로 미생물 상호 작용의 수사를 위해 적응 되는 설명 합니다. 이러한 흐름을 통해 장치 조작 제어 및 루트 microbiomes, 루트 화학의 샘플링으로 루트 형태학 및 미생물 지역화의 이미징에 대 한 허용. 이 프로토콜 EcoFABs 내부 살 균 상태를 유지 하 고 EcoFABs에 독립적인 LED 조명 시스템을 설치에 대 한 세부 정보를 포함 합니다. 토양을 포함 한 미디어의 다른 형태의 추가 대 한 자세한 방법 모래, 액체 성장 매체 이미지를 사용 하 여 이러한 시스템의 특성을 결합 하 고 대사체학 설명. 함께, 이러한 시스템 활성화 식물과 미생물 구성 (포함 돌연변이), 식물 성장, 루트 형태학, exudate 구성, 모니터링의 조작을 포함 한 식물 미생물 컨소시엄의 역동적이 고 상세한 조사 및 제어 환경 조건 하에서 미생물 지역화입니다. 우리는 이러한 상세한 프로토콜 이상적으로 식물-미생물 상호작용 조사를 위한 표준화 된 실험적인 시스템을 돕는 다른 연구원을 위한 중요 한 출발점으로 될 것입니다 예상.

각 EcoFAB 시스템 EcoFAB 장치를 포함 하 고 식물 크기의 투명 한 플라스틱 용기. 한 EcoFAB 장치는 식물 저수지, 루트 성장 챔버, 1.6 m m 흐름 입구 및 표준 EcoFAB 장치 (그림 2D &amp; 그림 3 H) 1.6 m m 콘센트 또는 와이드 콘센트 EcoFAB 장치 (그림 2F &amp; 그림 3I 10 m m 콘센트 ). 공장 저수지 6 m m 최고 오프닝 및 3mm 하단 개방, 사다리꼴 형태로 설계이 디자인 액체 주입 하는 동안 흐름 누설의 기회를 감소 하 고 또한 식물의 성장 위한 충분 한 공간을 보장. 루트 성장 챔버는 그림 2C 와 E에서 같이 많은 모델 식물의 루트 시스템에 맞게 2 m m 깊이 가진 타원형 모양을 채택 한다. 영양소 솔루션 EcoFAB 컨테이너를 열지 않고 루트 성장 챔버에 흐름 수 있도록 표준 EcoFAB 장치의 입구 및 출구 채널 PTFE 배관 연결할 수 있습니다. 넓은 콘센트 EcoFAB 장치는 크게는 콘센트의 흐름 저항을 감소 하 고 복잡 한 루트 시스템은 식물에서 파생 된 후 두꺼운 루트 시스템 또는 주기적으로 수집 루트 exudates 식물을 성장 하는 때 사용 선호 됩니다.
PDMS 레이어 EcoFAB 장치의 조작에 대 한 주조 금형 설계 소프트웨어에서 생성 되 고 3D 그림 2 및 그림 3에서 같이 딱딱한 불투명 광에 인쇄 하는 다음. EcoFABs 내부 식물 긴 작업 거리를 보장은 살 균 성장 환경 (그림 8A, 보충 파일 1)를 사용 하 여 현미경으로 직접 관찰할 수 있습니다. 식물을 가진 EcoFAB 장치 또한 식물-미생물 상호작용 (그림 8B, 보충 파일 2)의 높은 해상도 이미지를 가능 하 게 고해상도 현미경 단계에 들어갈 수 있습니다. 불 임은이 환경에서 유지 되지 않습니다 그리고 고해상도 영상 이므로 끝점 측정에 적합.
EcoFABs는 그들의 라이프 사이클에 걸쳐 그들의 다른 성장 단계에서 식물, 그들의 형태학, 신진 대사, 미생물 커뮤니티 등의 체계적인 연구를 활성화 하도록 설계 되었습니다. 여기, EcoFABs는 다양 한 종의 식물을 공부 하는 일반적인 플랫폼으로 시험 되었다. 그림 8C -E 쇼 7 일 오래 된 애기 thaliana, Brachypodium distachyon, Panicum virgatum EcoFABs에서 성장. 모든 3 개의 식물은 한 달 이상 동안에 EcoFAB에서 잘 성장을 발견 했다. 모두는 dicot, 애기 thaliana 및는 monocot, Brachypodium distachyon 는 EcoFABs에 그들의 재생산 단계에 살고 발견 됐다.
시스템 씰링 가역 고체 기판의 사용을 허용 한다 (예., 토양) EcoFABs (2.2 단계) 내. 접근을 씰링이 가역 루트 성장 챔버로 고체 기판의 로드를 가능 하 게 하 고 또한 루트 rhizospheres의 특정 지역에서 샘플 컬렉션을 수 있습니다. 그림 8 층 -H 14 일 오래 된 Brachypodium distachyon 성장 수경 매체 뿐 아니라 모래 토양 수경 매체 (모래)와 물 (토양) 보충에 그룹을 표시 합니다. 루트 성장 챔버에 얇은 고체 기판 레이어 루트 시스템의 현미경 영상에 대 한 관통을 빛을 수 있습니다.
루트 형태 공간 구성 및 식물 뿌리 시스템의 배포 정의 및 영양소 또는 물 가용성32,33, 등의 다양 한 성장 환경에 필수적인 생리 반응으로 승인 되었습니다. 34. EcoFABs는 시간이 지남에 또는 다른 영양 조건 하에서 식물 형태학의 편리한 접근을 제공 합니다. 그림 9A-F EcoFABs를 사용 하 여 첫 3 주 동안에 Brachypodium distachyon 의 루트 형태학을 추적 하는 예제를 보여줍니다. Brachypodium distachyon 경종 EcoFAB 장치에 전송 했다 그리고 그것의 루트 구조 생물 라 드 젤 영상 안에 카메라에 의해 기록 되었다. 이미지 처리 프로그램, 이미지 J, 파이썬 등 matlab, 시간이 지남에 또는 다른 매체 환경에서 루트 형태학의 변화를 계량에 추가 적용할 수 있습니다. 3 주에 걸쳐 총 루트 영역의 정량화 초기 단계에서 점진적 증가 보였다 (&lt; 1 주) 그림 9G과 같이 선형 성장 추세 3 주의 끝에 다음.
식물-미생물 상호작용을 조사 하는 EcoFAB를 생성 하는 데 기본 동기가입니다. 5.4 단계에 설명 된 대로 미생물 유입 채널을 통해 EcoFAB 장치의 루트 성장 챔버로 전송 됩니다. 그림 10 쇼, 슈 도모 나 스 simea (이전fluorescens) WCS417를 포함 하는 EcoFAB (WCS417), 식물의 성장을 추진 chemiluminescent 레이블 rhizobacteria의 농도와 식물 루트 시스템에 추가 되었습니다 식물 당 106 셀입니다. WCS417 신호 루트 성장 챔버에 WCS417 미생물의 고유한 공간 분포를 표시 하는 젤 영상으로 감지 되었습니다. 둘 다 MS 액체 매체와 모래 고체 기판 없이, WCS417 미생물 미생물 루트 팁 영역 루트 팁 (그림 10G의 활성 영양소 생산으로 인해 주위에 집중 전체 루트 시스템의 표면 식민지 &amp; H)35. 다른 한편으로, WCS417 미생물 토양 기판에 루트 팁 (그림 10나) 대신 식물 저수지 지역 축적. 미생물은 콘센트 채널을 통해 추가 된, 미생물 토양 기판에 이동할 수 있었다 하지만 모래 없이 액체 매체에서 관찰 뿌리에 축적 하지 않았다. 이 토양은 충분 한 영양 소스, 그리고 미생물 마이그레이션 최적의 호흡 조건에 대 한 공장 저수지에 나타낼 수 있습니다.
대사 산물 식물 루트 exudates 대사 산물 통풍 관의 프로 파일링 연구 및 식물 세균 상호 작용에서 릴리스, exudate 솔루션 루트 성장 챔버에서 EcoFABs에 있는 식물의 다양 한 성장 단계에 걸쳐 수집 되었다. 6 단계에서 설명한 대로 exudate 샘플 다음 LC MS 분석을 위한 추출 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여 식물에 의해 exuded 고 미생물 대사 산물의 범위 검색 되었습니다, 그리고 조사를 받고 현재는 미생물 식민지 없이 루트 exudates의 프로 파일링 관련된 대사 산물.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig1.jpg"> 그림 1:이 EcoFAB 워크플로. 식물 접시에 출 아 했다 고로 멸 균된 EcoFAB 미생물을 추가할 수 있습니다. 비파괴 샘플링: 루트 exudates 샘플링 될 수 있으며 몇 군데, 그리고 루트 형태 구상 될 수 있다. 파괴적인 샘플링 자세히 미생물, 루트 및 촬영 매개 변수의 분석을 수 있습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig2.jpg"> 그림 2: 3d 구성 요소 인쇄 EcoFAB 장치 제작을 위한 금형. (A) 최고와 기울이면 보기 주조 프레임. (B) 상단과 기울이면 전망 삽입의. (C) 위쪽 고 표준 몰드 베이스의 기울어진된 조회 합니다. (E) 최고와 기울이면 와이드 콘센트 형 기초의 전망. (D, F) 표준과 와이드 콘센트 EcoFAB 장치를 각각 날조를 위한 조립된 금형. 타원형 차원은 51 x 34mm 작은 EcoFAB 몰드 및 76 x 62 mm 큰 EcoFAB 형에 대 한입니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig3.jpg"> 그림 3: EcoFAB 장치 제작. (A) 금형에 탄성 중합체 기반과 경화 에이전트의 혼합물을 붓는. (B) 4 헤 (C) 금형에서 삽입을 제거에 대 한 85 ° C에서 혼합물으로 금형을가 열. (D)는 PDMS 주조 프레임에서 분리. (E) 금형 주조 프레임의 기본 추진. (F)는 PDMS 가장자리를 따라 몰드에서 분리 하는 칼을 사용 합니다. (G) 형 기초에서 천천히 PDMS 레이어 필 링. (H) 표준 PDMS 층의 입구와 출구 채널 Poking 구멍. (I) 넓은 콘센트 PDMS 층의 입구 채널에 대 한 구멍을 파고. (J)는 PDMS 레이어 (게 15:1 고무의 기본 치료 에이전트 혼합물) 현미경 슬라이드는 씻어 서, 그리고 접합을 위한 청소기는 플라즈마로 전송. (K) 사용 하 여 클램프를 현미경 슬라이드 (경화 에이전트 혼합물을 5:1 탄성 기지의 만든) PDMS 층을 지키고. (L) 현미경 슬라이드에 직접 PDMS 레이어 (에이전트 혼합 치료에 30: 1 탄성 기지의 만든)를 누르면. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig4.jpg"> 그림 4: 사용자 지정 클램프의 디자인. (최고의 A) 상위 뷰와 기울이면된 클램프 플레이트. (바닥의 B) 상단과 기울이면 조회 클램프 플레이트. (C) 위쪽 고 육각 캡 나사 4 세트와 함께 조립된 클램프의 기울어진된 조회 합니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig5.jpg"> 그림 5: 설치 하는 LED 빛을 성장 하십시오. (A) EcoFAB 컨테이너 주위 소용돌이에 9 LED 클립의 위치를 표시. (B) LED 클립 EcoFAB 컨테이너에 연결 된. (C)이이 클립 통해 LED 스트립 스레딩. (D) 24V 전원 공급 장치 유선 컨트롤러 LED 스트립을 연결 합니다. (전자) 컨트롤러에 와이어 연결 회로도 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig6.jpg"> 그림 6: 묘 EcoFABs 전송. (A) Brachypodium distachyon 0.5 MS 접시에 2 일 동안 재배 식물. (B) 식물 성장 매체와 루트 챔버를 채우고 있습니다. (C) 신중 하 게 식물 저수지에 루트를 삽입 하는 트위터를 사용 합니다. (D) 컨테이너의 하단에 물 3 mL를 추가 후 작은 세공 테이프와 EcoFAB 컨테이너 바다 표범 어업. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig7.jpg"> 그림 7: NIMS 이미징 식물의 뿌리에 EcoFABs. (메 마른 EcoFAB에 성장 A) Brachypodium distachyon (B) 사용자 지정 MALDI 격판덮개에 NIMS 칩 연결을 20 분 (C) 사용 하 여 구리 테이프 NIMS 칩에 식물을 가진 PDMS 층을 연결 하 고 MALDI 질량 분 서 계에 그것을 로드. (D-G) 하나 7 일 오래 된 한 일 오래 된 Brachypodium distachyon 공장 NIMS 이미징에 사용 (D, E) 및 해당 NIMS 이미지 (F, G). 주된 이온 빨강, 녹색 및 파랑에서 강조 했다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig8.jpg"> 그림 8: EcoFABs의 일반 응용 프로그램. (A) 직접 루트 성장 긴 작업 거리 현미경 설치는 EcoFAB에서 Brachypodium distachyon 의 캡처. (B) 직접 고해상도 현미경 설치 루트-미생물 상호작용 관찰. (C-E) 7 일 오래 된 애기 thaliana (C), Brachypodium distachyon (D), 및 Panicum virgatum (E) 0.5 MS 수경 매체, (F-H) 14 일 오래 된 Brachypodium distachyon 0.5 MS 수경 법 (F), 모래 (G) 및 토양 (H)에서 성장 각각 0.5 MS 매체와 물, 제공 하는 기판. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig9.jpg"> 그림 9: EcoFABs를 사용 하 여 루트 형태학 연구. (A-F) 루트 개발 EcoFABs에 성장 하는 Brachypodium distachyon 의 처음 3 주 동안 0.5 MS 매체 가득: (A) 2 일, (B) 4 일, (C) 7 일, (D) 11 일, (E) 14 일의 성장 (F) 21 일. (G) 평균된 루트 표면 영역 ImageJ 소프트웨어에 의해 견적 되었다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig10.jpg"> 그림 10: EcoFABs를 사용 하 여 루트-미생물 상호작용 연구. (A, B, C) 15 일 오래 된 Brachypodium distachyon 다른 형태의 미디어 MS 액체 솔루션, 모래 및 토양 기판에 슈 도모 나 스 fluorescens WCS417와 식민지의 그룹. (D, E, F) 루트 시스템의 밝은 필드 사진입니다. (G, H, I) 14 일 공동 경작 후이 루트 시스템의 해당 chemiluminescent 이미지. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 1입니다. EcoFAB를 사용 하 여 루트 성장 캡처. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video1_capture_growing_roots_(2).mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 2입니다. EcoFAB를 사용 하 여 루트 미생물 상호 작용 캡처. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video2_capture_root_microbes_interaction.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 문서는 생태계 식물 및 높게 통제 된 실험실 조건에서 식물-미생물 상호작용 연구를 활성화 하는 장치 (EcoFABs)의 제조에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

식물-미생물 상호작용 연구 위한 실험실 생태계의 건설에 대 한 생태계 제조 (EcoFAB) 프로토콜

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 현장에서 추가로 테스트할 수 있는 식물 미생물 상호 작용을 조사하기 위해 통제되고 복제된 실험실 실험을 가능하게 하는 EcoFAB이라고 하는 단순화된 모델 식물 생태계 구축을 위한 표준화된 접근 방식을 정의하는 것입니다. 이 방법은 통제된 환경 내에서 식물 미생물의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 마이크로 바이옴의 기능에 대한 자세한 기계론적 통찰력을 얻어 지속 가능한 농업에 활용할 수 있습니다. 우리는 사용 가능한 다양한 3D 프린팅 기술을 사용하고 산만하지 않은 고해상도 이미지와 화학 분석을 모두 가능하게 하는 식물 성장 챔버를 살균하는 이 최초의 Eco-FAB을 설계하는 데 도움을 주었습니다.여기에서 개발된 Eco-FAB 장치는 뿌리 형태 분석과 질량 분광 이미징 분석을 통합하기 때문에 식물 미생물 상호 작용 분석에 매우 적합합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 3D 프린팅을 사용하여 Eco-FAB 금형을 제작한 후 일회용 1리터 용기에 실험에 따라 40ml의 실록산 엘라스토머 베이스와 다양한 양의 경화제를 혼합합니다. 용기를 진공 챔버에 최소 30분 동안 넣어 엘라스토머 혼합물에서 기포를 제거합니다.그런 다음 혼합물을 제거하고 조립된 3D 프린팅 플라스틱 금형에 붓습니다. 균일한 PDMS 층을 생성하려면 기포를 조심스럽게 제거해야 합니다. 혼합물을 금형으로 옮긴 후 압축 공기를 사용하여 공기 잔류물을 불어냅니다.곰팡이를 섭씨 85도의 가열 블록에 4시간 동안 보관하십시오. 곰팡이를 5분 동안 식히십시오. 그런 다음 금형에서 인서트를 부드럽게 당겨 빼내고 다용도 나이프를 사용하여 주조 프레임에서 PDMS를 천천히 분리합니다.PDMS가 있는 금형 베이스를 주조 프레임에서 위로 누릅니다. 그런 다음 칼이나 다른 도구를 사용하여 가장자리의 금형 베이스에서 PDMS 층을 부드럽게 분리하고 금형 표면에서 천천히 떼어냅니다. 15게이지의 뭉툭한 바늘을 사용하여 해당 부분에 1.6mm 구멍을 만들어 PDMS 레이어에 입구 채널을 만듭니다.그런 다음 가위를 사용하여 PDMS 레이어의 가장자리를 자릅니다. PDMS 층을 현미경 슬라이드에 영구적으로 결합하려면 메탄올을 사용하여 7.6 x 5cm 현미경 슬라이드에서 PDMS 층의 접합면을 헹군 다음 압축 공기 또는 초순수 질소 건으로 불어 건조시킵니다. 현미경 슬라이드와 PDMS 층을 접착면이 위를 향하도록 플라즈마 클리너에 넣습니다.챔버와 가스 배출 밸브를 닫습니다. 그런 다음 진공 청소기를 켜고 1분 동안 챔버를 펌핑합니다. 플라즈마 발생기의 전원을 켜고 무선 주파수 또는 RF 레벨을 1분 동안 높음으로 전환합니다.그런 다음 진공 펌프와 플라즈마 전원을 모두 끄고 챔버를 대기로 배출합니다. 플라즈마 챔버에서 현미경 슬라이드와 PDMS 층을 꺼내고 PDMS 층의 네 모서리를 모두 균일한 압력으로 슬라이드에 빠르게 누릅니다. 치근 챔버인 중앙 타원형 영역이 슬라이드에 닿지 않도록 합니다.초순수를 사용하여 Eco-FAB 장치를 헹굽니다. Eco-FAB 용기에 하나의 Eco-FAB 장치를 넣고 장치가 잠길 때까지 70% 에탄올을 추가합니다. 그런 다음 용기 뚜껑을 닫고 부드럽게 흔들어 내부의 모든 표면을 에탄올로 적시고 Eco-FAB 장치의 뿌리 성장 챔버가 기포가 거의 또는 전혀 없는 에탄올로 채워져 있는지 확인합니다.실온에서 30분 동안 장치를 배양한 후 70% 에탄올을 붓고 100% 에탄올로 교체하십시오. 그런 다음 5분 동안 장치를 배양합니다. 배양 후 에탄올을 배출하고 멸균된 Eco-FAB을 Laminar Flow Hood에 16시간 동안 그대로 두어 완전히 건조시킵니다.가능한 경우 후드의 자외선을 1시간 동안 켜서 시스템을 살균합니다. 종자 살균 및 발아를 수행하려면 씨앗을 70% 에탄올에 2분 동안 담그십시오. 그런 다음 피펫으로 에탄올을 제거하고 멸균수를 사용하여 씨앗을 세 번 헹굽니다.다음으로, 씨앗을 10% 표백제 용액에 5분 동안 담가둡니다. 그런 다음 표백제 용액을 제거하고 멸균 물을 사용하여 씨앗을 세 번 철저히 씻습니다. 세척 후 씨앗에 멸균수를 넣고 튜브를 섭씨 4도에서 7일 동안 배양합니다.0.5 Murashige와 Skoog 또는 MS 매체에 0.6% vitagel과 함께 씨앗을 고르게 펴 바릅니다. 그리고 미세 기공 테이프로 플레이트를 밀봉하십시오. 그런 다음 식물을 약 5ml의 뿌리 길이로 자랍니다.멸균 주사기 또는 마이크로파이펫과 멸균수를 사용하여 묘목을 Eco-FAB으로 옮기려면 Eco-FAB 장치의 루트 챔버를 세 번 세척한 다음 루트 챔버를 0.5MS 배지와 같은 관심 성장 배지로 채웁니다. 이제 Eco-FAB 장치의 식물 저장소에 단일 묘목을 조심스럽게 삽입하십시오. 뿌리가 부러지지 않도록 묘목을 플레이트에서 Eco-FAB으로 조심스럽게 옮기는 것이 중요합니다.Eco-FAB 장치를 피하고 용기에 3ml의 멸균수를 추가합니다. 이것은 습도를 증가시키고 뿌리 챔버에서 매체의 증발을 줄입니다. 그런 다음 용기를 닫고 미세 기공 테이프를 사용하여 뚜껑을 밀봉합니다.Eco-FAB을 식물 인큐베이터에 넣거나 각 식물의 성장에 적합한 제어된 온도 환경에서 Eco-FAB 조명 시스템을 활용하십시오. 그런 다음 챔버를 섭씨 24도로 설정합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 대사 산물 프로파일링 및 질량 분석법을 수행합니다.이 수치는 생후 7일 된 Aaabidopsis thaliana, brachypodium distachyon 및 panicum virgatum이 Eco-FAB에서 자라는 것을 보여줍니다. 쌍떡잎식물과 외떡잎식물은 모두 Eco-FAB에서 번식 단계에 부합하는 것으로 밝혀졌습니다. 이 묘목은 수경 재배 배지에서 자라는 14 일 된 brachypodium distachyon 그룹과 수경 재배 배지와 물이 각각 보충 된 모래와 토양을 나타냅니다.얇고 단단한 기질층과 뿌리 성장 챔버는 뿌리 시스템의 현미경 이미징을 위해 빛이 투과할 수 있도록 합니다. 여기서, brachypodium distachyon 묘목을 Eco-FAB 장치로 옮기고, 그 뿌리 구조를 biorad 겔 이미저 내부의 카메라로 기록했습니다. 3주 동안의 전체 뿌리 면적을 정량화한 결과, 초기 단계에서 점진적인 증가를 보였고, 그 후 마지막까지 선형 성장 추세를 보였습니다.이 그림에서는 식물 성장 촉진 리조박테리아인 슈도모나스 시미애(pseudomonas simiae, WCS417)를 함유한 Eco-FAB을 식물당 10개에서 6번째 세포로 식물 뿌리 시스템에 첨가하였다. WCS147 미생물은 뿌리 끝 영역 주변에 집중된 미생물로 전체 뿌리 시스템의 표면에 군집했습니다. 리프레시 배지 성장 및 Eco-FAB에서 뿌리 삼출물을 수집할 때 오염을 방지하기 위해 모든 작업을 멸균 후드에서 처리해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.Eco-FAB 장치는 3D 프린팅 클램프를 사용하거나 PDMS의 점도를 변경하여 가역적인 물리적 밀봉을 사용하여 제작할 수도 있습니다. 이를 통해 고체 성장 매체와 직접 질량 분광 이미징을 사용할 수 있습니다. Eco-FAB 개발 후 이 시스템을 통해 전 세계 연구원들은 이러한 실험실 모델 에코시스템을 사용하여 시스템 생물학 및 이미징 기술을 사용하여 식물 미생물 상호 작용을 연구할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 Eco-FAB 시스템을 제작하는 방법과 생태계 연구에서의 광범위한 응용 분야에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 우리는 이 Eco-FAB 설계를 통해 다른 과학자들이 특정 과학적 목표를 달성할 수 있기를 바랍니다. 더 중요한 것은 다른 과학자들이 이 Eco-FAB 설계를 기반으로 하여 더 나은 것을 만들고 다른 과학자들과 공유하여 커뮤니티로서 이러한 실험실 생태계를 구축하여 식물 미생물의 상호 작용을 더 잘 이해할 수 있기를 바랍니다.미생물 및 날카로운 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

Microfluidic 장치는 실시간으로 적절한 물리적인 비늘에서 복잡한 자연의 프로세스를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 표면 하의에 박테리아의 성장과 교통 수단을 공부하고 자연 다공성 매체의 주요 기능을 모방한 것이었 간단한 microfluidic 장치를 개발했습니다.

다공성 매체에서 미생물 교통 유학에 대한 간단한 Microfluidic 시스템 : 미생물의 창

출처: Nathoo, N., et al. 식물/미생물 분자 상호 작용 및 신호 전달의 동시 및 체계적 분석을 위한 수경 공동 재배 시스템. J. Vis. 경험. (2017).이 비디오는 멸균 조건에서 식물-박테리아 상호 작용을 연구하기 위한 수경 공동 재배 시스템을 보여줍니다. 식물 묘목은 멸균된 산성 성장 배지로 옮겨져 배양되고 Agrobacterium을 접종하기 전에 오염 여부를 검사합니다. 활성화된 박테리아는 식물 뿌리에 부착되어 T-DNA를 식물 세포로 전달하며 박테리아 집락화를 강화하는 분자 변화를 촉진합니다.

식물 숙주와 상호 작용하는 박테리아의 분자 반응을 연구하기 위한 공동 배양 시스템

미생물 군집의 개발은 환경 구조, 구성원의 풍부 성, 형질 및 상호 작용을 포함하는 여러 요소의 조합에 달려있다. 이 프로토콜은 틈새 크기 및 감금과 같은 핵심 요소가 근사 될 수있는 femtoliter 우물에 포함 된 수천 개의 공동체를 동시에 추적하기위한 합성, 미세 제작 환경을 설명합니다.

마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적

기술 된 수경 공동 배양 시스템은 금속 메쉬 스크린이있는 온전한 식물을지지하고 박테리아와 함께 배양한다. 식물 조직, 박테리아 및 분비 된 분자는 하류 분석을 위해 따로 따로 수확 할 수 있으며 동시에 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물 또는 미생물의 분자 반응을 조사 할 수 있습니다.

식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템

이 문서에서는 물리와 화학의 높은 처리량 조작 신호 세포 microenvironments vivo에서 흉내 낸 고을 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열 준비 하 상세한 방법론 단일 셀 프로 파일링 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 위한 최적의 휴대폰 환경을 식별 합니다.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

토양의 불투명도로 인해 구성 미생물 간의 상호 작용은 세포 분해능으로 쉽게 시각화 될 수 없습니다. 여기에서는 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 새로운 기회를 제공하는 두 가지 미세 유체 도구가 제시됩니다. 이 장치는 다재다능하고 사용하기 쉬우므로 세포 수준에서 높은 시공간 제어 및 고해상도 이미징이 가능합니다.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

다양한 rhizosphere 토양에서 시너지 효과가 있는 다종 생물막 군집을 구축하기 위한 빠르고 표준화된 절차가 여기에 제시되어 있습니다. 이는 복잡한 rhizosphere 토양 미생물군을 조사하고 시뮬레이션하도록 설계된 고유한 프로토콜입니다.

Rhizosphere 토양에서 Multispecies Biofilm Communities를 구축하는 접근 방식

여기에서 우리는 식물 다양성 구배를 따라 초원 군집의 생태계 기능에 대한 식물 역사와 토양 역사의 독립적이고 상호 작용적인 영향을 연구하기 위해 지상 및 지하의 환경 조건이 통제된 지상 반폐쇄 우주 챔버인 iDiv Ecotron에 설립된 연구를 제시합니다.

JenaTron - 식물의 역사와 토양의 역사가 초원 생태계 기능에 미치는 영향을 연구하는 실험적 접근 방식

이 프로토콜은 혐기성 조건에서 복잡한 배설물 군집의 연속 유동 배양에 활용되는 미니 생물반응기 어레이의 조립에 대해 자세히 설명합니다. 또한 추가 분석을 위해 반응기의 조립, 접종 및 샘플링 방법에 대해서도 논의합니다.

복잡한 분변 군집의 지속적인 배양을 위한 Bioreactor Assembly

MBRA(Minibioreactor Array)는 복잡한 미생물 군집의 배양을 가능하게 하는 고처리량, 맞춤형 연속 흐름 배양 시스템으로, 마이크로바이옴 역학, 치료 상호 작용 및 환경 요인에 대한 미생물 반응을 연구하기 위한 병렬 실험을 지원합니다.

Minibioreactor Array(MBRA)의 조립 및 사용을 위한 업데이트된 프로토콜

학습하세요 EcoFAB 제작 프로토콜을 통해 식물-미생물 상호작용을 연구하는 방법을 배우세요. 3D 프린팅 기술로 제작된 이 생태계 모델은 정밀한 실험 환경에서 뿌리 형태학 및 대사체 분석을 가능하게 합니다.

식물-미생물 상호작용 연구 위한 실험실 생태계의 건설에 대 한 생태계 제조 (EcoFAB) 프로토콜

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