식물-미생물 상호작용 연구 위한 실험실 생태계의 건설에 대 한 생태계 제조 (EcoFAB) 프로토콜

이 프로토콜의 전반적인 목표는 현장에서 추가로 테스트할 수 있는 식물 미생물 상호 작용을 조사하기 위해 통제되고 복제된 실험실 실험을 가능하게 하는 EcoFAB이라고 하는 단순화된 모델 식물 생태계 구축을 위한 표준화된 접근 방식을 정의하는 것입니다. 이 방법은 통제된 환경 내에서 식물 미생물의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 마이크로 바이옴의 기능에 대한 자세한 기계론적 통찰력을 얻어 지속 가능한 농업에 활용할 수 있습니다. 우리는 사용 가능한 다양한 3D 프린팅 기술을 사용하고 산만하지 않은 고해상도 이미지와 화학 분석을 모두 가능하게 하는 식물 성장 챔버를 살균하는 이 최초의 Eco-FAB을 설계하는 데 도움을 주었습니다.

여기에서 개발된 Eco-FAB 장치는 뿌리 형태 분석과 질량 분광 이미징 분석을 통합하기 때문에 식물 미생물 상호 작용 분석에 매우 적합합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 3D 프린팅을 사용하여 Eco-FAB 금형을 제작한 후 일회용 1리터 용기에 실험에 따라 40ml의 실록산 엘라스토머 베이스와 다양한 양의 경화제를 혼합합니다. 용기를 진공 챔버에 최소 30분 동안 넣어 엘라스토머 혼합물에서 기포를 제거합니다.

그런 다음 혼합물을 제거하고 조립된 3D 프린팅 플라스틱 금형에 붓습니다. 균일한 PDMS 층을 생성하려면 기포를 조심스럽게 제거해야 합니다. 혼합물을 금형으로 옮긴 후 압축 공기를 사용하여 공기 잔류물을 불어냅니다.

곰팡이를 섭씨 85도의 가열 블록에 4시간 동안 보관하십시오. 곰팡이를 5분 동안 식히십시오. 그런 다음 금형에서 인서트를 부드럽게 당겨 빼내고 다용도 나이프를 사용하여 주조 프레임에서 PDMS를 천천히 분리합니다.

PDMS가 있는 금형 베이스를 주조 프레임에서 위로 누릅니다. 그런 다음 칼이나 다른 도구를 사용하여 가장자리의 금형 베이스에서 PDMS 층을 부드럽게 분리하고 금형 표면에서 천천히 떼어냅니다. 15게이지의 뭉툭한 바늘을 사용하여 해당 부분에 1.6mm 구멍을 만들어 PDMS 레이어에 입구 채널을 만듭니다.

그런 다음 가위를 사용하여 PDMS 레이어의 가장자리를 자릅니다. PDMS 층을 현미경 슬라이드에 영구적으로 결합하려면 메탄올을 사용하여 7.6 x 5cm 현미경 슬라이드에서 PDMS 층의 접합면을 헹군 다음 압축 공기 또는 초순수 질소 건으로 불어 건조시킵니다. 현미경 슬라이드와 PDMS 층을 접착면이 위를 향하도록 플라즈마 클리너에 넣습니다.

챔버와 가스 배출 밸브를 닫습니다. 그런 다음 진공 청소기를 켜고 1분 동안 챔버를 펌핑합니다. 플라즈마 발생기의 전원을 켜고 무선 주파수 또는 RF 레벨을 1분 동안 높음으로 전환합니다.

그런 다음 진공 펌프와 플라즈마 전원을 모두 끄고 챔버를 대기로 배출합니다. 플라즈마 챔버에서 현미경 슬라이드와 PDMS 층을 꺼내고 PDMS 층의 네 모서리를 모두 균일한 압력으로 슬라이드에 빠르게 누릅니다. 치근 챔버인 중앙 타원형 영역이 슬라이드에 닿지 않도록 합니다.

초순수를 사용하여 Eco-FAB 장치를 헹굽니다. Eco-FAB 용기에 하나의 Eco-FAB 장치를 넣고 장치가 잠길 때까지 70% 에탄올을 추가합니다. 그런 다음 용기 뚜껑을 닫고 부드럽게 흔들어 내부의 모든 표면을 에탄올로 적시고 Eco-FAB 장치의 뿌리 성장 챔버가 기포가 거의 또는 전혀 없는 에탄올로 채워져 있는지 확인합니다.

실온에서 30분 동안 장치를 배양한 후 70% 에탄올을 붓고 100% 에탄올로 교체하십시오. 그런 다음 5분 동안 장치를 배양합니다. 배양 후 에탄올을 배출하고 멸균된 Eco-FAB을 Laminar Flow Hood에 16시간 동안 그대로 두어 완전히 건조시킵니다.

가능한 경우 후드의 자외선을 1시간 동안 켜서 시스템을 살균합니다. 종자 살균 및 발아를 수행하려면 씨앗을 70% 에탄올에 2분 동안 담그십시오. 그런 다음 피펫으로 에탄올을 제거하고 멸균수를 사용하여 씨앗을 세 번 헹굽니다.

다음으로, 씨앗을 10% 표백제 용액에 5분 동안 담가둡니다. 그런 다음 표백제 용액을 제거하고 멸균 물을 사용하여 씨앗을 세 번 철저히 씻습니다. 세척 후 씨앗에 멸균수를 넣고 튜브를 섭씨 4도에서 7일 동안 배양합니다.

0.5 Murashige와 Skoog 또는 MS 매체에 0.6% vitagel과 함께 씨앗을 고르게 펴 바릅니다. 그리고 미세 기공 테이프로 플레이트를 밀봉하십시오. 그런 다음 식물을 약 5ml의 뿌리 길이로 자랍니다.

멸균 주사기 또는 마이크로파이펫과 멸균수를 사용하여 묘목을 Eco-FAB으로 옮기려면 Eco-FAB 장치의 루트 챔버를 세 번 세척한 다음 루트 챔버를 0.5MS 배지와 같은 관심 성장 배지로 채웁니다. 이제 Eco-FAB 장치의 식물 저장소에 단일 묘목을 조심스럽게 삽입하십시오. 뿌리가 부러지지 않도록 묘목을 플레이트에서 Eco-FAB으로 조심스럽게 옮기는 것이 중요합니다.

Eco-FAB 장치를 피하고 용기에 3ml의 멸균수를 추가합니다. 이것은 습도를 증가시키고 뿌리 챔버에서 매체의 증발을 줄입니다. 그런 다음 용기를 닫고 미세 기공 테이프를 사용하여 뚜껑을 밀봉합니다.

Eco-FAB을 식물 인큐베이터에 넣거나 각 식물의 성장에 적합한 제어된 온도 환경에서 Eco-FAB 조명 시스템을 활용하십시오. 그런 다음 챔버를 섭씨 24도로 설정합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 대사 산물 프로파일링 및 질량 분석법을 수행합니다.

이 수치는 생후 7일 된 Aaabidopsis thaliana, brachypodium distachyon 및 panicum virgatum이 Eco-FAB에서 자라는 것을 보여줍니다. 쌍떡잎식물과 외떡잎식물은 모두 Eco-FAB에서 번식 단계에 부합하는 것으로 밝혀졌습니다. 이 묘목은 수경 재배 배지에서 자라는 14 일 된 brachypodium distachyon 그룹과 수경 재배 배지와 물이 각각 보충 된 모래와 토양을 나타냅니다.

얇고 단단한 기질층과 뿌리 성장 챔버는 뿌리 시스템의 현미경 이미징을 위해 빛이 투과할 수 있도록 합니다. 여기서, brachypodium distachyon 묘목을 Eco-FAB 장치로 옮기고, 그 뿌리 구조를 biorad 겔 이미저 내부의 카메라로 기록했습니다. 3주 동안의 전체 뿌리 면적을 정량화한 결과, 초기 단계에서 점진적인 증가를 보였고, 그 후 마지막까지 선형 성장 추세를 보였습니다.

이 그림에서는 식물 성장 촉진 리조박테리아인 슈도모나스 시미애(pseudomonas simiae, WCS417)를 함유한 Eco-FAB을 식물당 10개에서 6번째 세포로 식물 뿌리 시스템에 첨가하였다. WCS147 미생물은 뿌리 끝 영역 주변에 집중된 미생물로 전체 뿌리 시스템의 표면에 군집했습니다. 리프레시 배지 성장 및 Eco-FAB에서 뿌리 삼출물을 수집할 때 오염을 방지하기 위해 모든 작업을 멸균 후드에서 처리해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

Eco-FAB 장치는 3D 프린팅 클램프를 사용하거나 PDMS의 점도를 변경하여 가역적인 물리적 밀봉을 사용하여 제작할 수도 있습니다. 이를 통해 고체 성장 매체와 직접 질량 분광 이미징을 사용할 수 있습니다. Eco-FAB 개발 후 이 시스템을 통해 전 세계 연구원들은 이러한 실험실 모델 에코시스템을 사용하여 시스템 생물학 및 이미징 기술을 사용하여 식물 미생물 상호 작용을 연구할

이 비디오를 시청한 후에는 Eco-FAB 시스템을 제작하는 방법과 생태계 연구에서의 광범위한 응용 분야에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 우리는 이 Eco-FAB 설계를 통해 다른 과학자들이 특정 과학적 목표를 달성할 수 있기를 바랍니다. 더 중요한 것은 다른 과학자들이 이 Eco-FAB 설계를 기반으로 하여 더 나은 것을 만들고 다른 과학자들과 공유하여 커뮤니티로서 이러한 실험실 생태계를 구축하여 식물 미생물의 상호 작용을 더 잘 이해할 수 있기를 바랍니다.

미생물 및 날카로운 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.