형성 화학식 DNA Adducts 효소 활성화 된 발암 물질 및 생체 외에서 마약 및 ³²P postlabeling에 의해 그들의 결정에 의해

이 프로토콜의 전반적인 목표는 시토크롬 p450 및 추가 생물 변형 효소에 의해 촉매된 반응을 사용하여 공유 DNA 부가물을 형성하는 대사 산물에 대한 활성화를 위한 화학 물질 또는 약물의 효능을 조사하는 방법에 대한 설명입니다. 이 방법은 암의 발병과 그 치료 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 암 발병의 시작을 나타내는 공유 DNA 부가물을 형성하기 위해 환경 화학 물질 또는 약물의 효능을 평가하는 방법 유형을 보여준다는 것입니다.

화학 물질의 발암 효능을 결정하는 기술의 의미. 환경 잠재력, 독성 물질 및 약물 및 또한 이러한 화합물에 의해 형성된 공유 DNA 부가물의 형성에 대한 비교적 간단한 방법을 결정합니다. 이 방법은 암의 발병과 치료의 시작에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 과학 분야에도 적용할 수 있습니다.

분자 메커니즘, DNA 손상에 대한 연구, 효소 활성화 및 화학 물질의 독소에 대한 구강 연구와 같은. 이 방법에 대한 아이디어를 처음 들은 것은 화학적 발암의 시작 단계와 관련된 과정을 조사했을 때였습니다. 먼저 섭씨 4도에서 0.75ml의 최종 부피에 모든 화합물과 효소 시스템을 첨가하여 배양 혼합물을 준비합니다.

이것은 시토크롬 p450의 존재 하에서 DNA와 함께 발암 물질을 배양하는 것입니다. 그런 다음 혼합물에 마이크로솜 또는 순수 재조합 p450을 슈퍼솜으로 첨가합니다. 다음으로, DMSO에 용해된 0.1 밀리몰 엘립티신 약물 7.5 마이크로리터와 물 42.5 마이크로리터를 첨가하여 최종 부피를 0.75 밀리리터로 조정한다.

그런 다음 5초 동안 튜브를 볼텍싱하여 구성 요소를 혼합합니다. 그 직후, 뚜껑을 열고 30-60분 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다. 다음으로, 페놀 또는 페놀 클로로포름을 Eppendorf Tube에서 배양 혼합물과 일대일 비율로 혼합합니다.

이렇게 하면 배양 혼합물의 DNA에서 단백질 오염이 제거됩니다. 그런 다음 혼합물을 저어 에멀젼을 형성합니다. 그런 다음 주변 온도에서 3 분 동안 1600 회 g로 혼합물을 회전시킵니다.

원심분리가 끝나면 피펫을 사용하여 상부 수위를 새 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 유기상과 함께 단백질 계면을 버립니다. 다음으로, 물 상태를 동일한 부피의 페놀과 클로로포름과 일대일 비율로 혼합합니다.

그런 다음 원심분리를 반복합니다. 다음으로, 수집된 물 상태에 동일한 양의 클로로포름을 추가하고 다시 원심분리기를 합니다. 그런 다음 섭씨 영하 20도에서 유지되는 차가운 에탄올 2 부피를 첨가하여 수성상에서 DNA를 침전시킵니다.

그런 다음 용액을 잘 섞습니다. DNA 부가물 라벨링을 준비하기 위해 바이신 완충액을 방사성 표지된 ATP 용액과 혼합하여 DNA 부가물을 라벨링합니다. 라벨링 혼합물을 NP1 용액 또는 부탄올 농축 혼합물에 첨가합니다.

혼합물을 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 PEI-셀룰로오스 TLC 플레이트의 전체 샘플에 약 20마이크로리터를 적용합니다. PEI-셀룰로오스 TLC 플레이트에서 샘플을 발견한 후 플레이트가 D1 방향으로 진행되도록 두어 부가물을 청소합니다.

플레이트가 건조되면 플레이트가 D3 및 D4 방향으로 진행되도록 둡니다. D3에서 개발하려면 요소와 함께 pH 3.5에서 포름산리튬 완충액을 사용하십시오. D4 개발을 위해 염화리튬 및 요소와 함께 Tris-HCl 버퍼를 사용하십시오.

D4 방향으로 전개하는 데 문제가 발생하지 않도록 D5 방향으로도 플레이트를 전개하십시오. 첫째, P32-postlabeling 기법을 사용하여 DNA 부가물을 형성하는 데 있어 마이크로솜 p450 매개 생체 활성화 타원체의 효율성을 연구합니다. 결과는 쥐 또는 인간 간 마이크로솜의 존재 하에 송아지 흉선 DNA의 데옥시구아노신에서 공유 DNA 부가물의 형성을 보여줍니다. 그러나 대조군에는 부가물이 형성되지 않습니다.

다음으로, 과산화효소 의존성 활성화 타원효소의 잠재력을 연구합니다. 이 이미지는 horseradish peroxidase, bovine lactoperoxidase 및 human myeloperoxidase의 존재 하에서 송아지 흉선 DNA에서 공유 DNA 부가물의 형성을 보여줍니다. 실제로, DNA 부가물은 쥐가 생체 내에서 체중 1kg당 40mg의 엘립티신으로 처리될 때 간 DNA에서도 형성됩니다.

흥미롭게도, 인간 사이토크롬 p450 효소 CYP3A4는 또한 엘립티신을 12-하이드록시엘립티신 및 13-하이드록시엘립티신과 같은 대사 산물로 효율적으로 산화시킬 수 있는 강력한 잠재력을 보여줍니다. 이러한 대사 산물은 DNA에 쉽게 결합하여 부가물을 형성할 수 있습니다. 다음으로, 뉴클레아제 P1 및 n-부탄올 농축 방법을 사용하여 쥐 및 인간에서 NQ01과 같은 세포질 환원효소와 함께 3-니트로벤잔트론의 활성화 시 DNA 부가물의 형성을 연구합니다.

결과는 쥐, 인간 간 세포질 및 쥐 간에서 얻은 송아지 흉선 DNA에서 최대 5 개의 DNA 부가물이 형성되는 것을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도함으로써 사용 된 효소 시스템의 안정성을 기억하는 것이 중요합니다.

효소 활성은 얼음에 보관하지 않으면 감소할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생화학 분야의 연구자들, 즉 화학 발암의 생화학 분야의 연구자들이 유기체의 암 발생 시작 과정에서 현상의 본질을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 유전적 공유 DNA 부가물을 대사하기 위해 효소로 활성화되는 환경 화학 물질 또는 약물의 효능을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 과정은 암 기반 치료법 개발에 매우 중요합니다. 매우 위험할 수 있는 화학 물질로 작업하고 있다는 것을 잊지 마십시오. 잠재적인 발암 물질, 방사성 화학 물질(예: 인 ATP).

따라서 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험실 라텍스 장갑 및 플렉시 유리 시트와 같은 예방 조치를 취해야 합니다.