Name: 형성 화학식 DNA Adducts 효소 활성화 된 발암 물질 및 생체 외에서 마약 및 32P postlabeling에 의해 그들의 결정에 의해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 학습하세요 사이토크롬 P450 효소를 활용한 환경 화학물질 및 약물의 DNA 부가체 형성 능력 평가 방법을. 이 기술은 암 발생 기전 연구와 발암성 평가에 필수적인 도구입니다.

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이 연구는 체코 과학 재단 (GACR, 그랜트 17-12816S)에 의해 지원 되었다.

저자는 공개 상관이 있다.

이 논문에서는, 그것은 대사 중간체, 화학식 DNA의 세대에서 발생 하는 bioactivated 것 화학 물질의 효능 연구를 광범위 하 게 액세스할 수 있는 방법론 adducts 시연입니다. 이것은 중요 한 문제, 환경 화학 물질의 힘 이나 공유 DNA를 생성 하는 대사 산물을 그들의 효소 활성의 약물의 평가 adducts 때문에 암과 치료의 개발에 중요 한 필드입니다. 종양 개발의 원인으로 간주 하는 발암 물질에 의해 DNA의 수정입니다 지금은 발암 물질에 의해 발생 하는 발암의 중앙 교리로 판단 됩니다. 이 제안 결과, 현상 등의 다양 한에 의해 확인 되는: (i)은 발암 성 속성 다양 한 발암 물질의 대사 산물 DNA;에 및 센터와 반응에이 화합물의 bioactivation 의존 (ii) 수준의 DNA adducts 자주 많은 발암 반응을;에 해당 (iii) 그리고 특정 종양 억제기 유전자에 여러 proto-oncogenes의 활성화 돌연변이 발암 성 potencies와 화학 물질과 그들의 수정에 의해 발생할 수 있습니다....

환경 화학 물질 (약물) xenobiotics의 물질 대사는 두 단계1에서 발생합니다. 단계 I 및 II 더 친수성 원래 소수 (하지 수용 성) 화합물을 렌더링 하는 것을 목표로 (수용 성), 따라서 소변, 배설물 또는 땀을 통해 쉽게 excretable 그들을 만들기. 단계 (기능화) 반응을 포함 산화, 감소, 및 hydroxylation peroxidases (P450s, CYPs), 시 토 크롬 P450s와 같은 효소에 의해 촉매 (즉,., cyclooxygenase, 콕스), aldo keto reductases (AKRs), 및 microsomal 플 라빈 함유 monooxygenases (FMOs)입니다. 또한 감소 반응, reductases 즉, microsomal NADPH: 시 토 크롬 P450 환 원 효소 (POR) 및 cytosolic NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO1), 세 산화 효소 (XO), 그리고 알데하이드 산화 효소 (AO)1 의 다양 한에 의해 중재를 포함 하는 단계 . 두 번째 단계 (활용), 단계에 연결 된 기능 그룹에서에서 켤레 극성을 더욱 높이기 위해 작은 극 지 분자를 데 사용 됩니다. 단계 II는 sulfotransferases (SULTs), N, O-acetyltransferases (Nat), methyltransferases catechol-O-methyltransferase (COMT), 티 S-등의 반응에 참여 하는 것으로 간주 하는 효소의 예 transferases (GSTs), 그리고 uridine diphosphate glucuronosyltransferases (UGTs)1. 그러나 단계에서 효소의 분류 I 또는 II는,, 하지 경직 된, 그리고 일부 효소 틀림 없이 어느 범주에 그룹화 할 수 있습니다.
P450 효소 (EC 1.14.14.1) 헤 많은 화학, 그들의 변환3,4catalyzing의 생물학적에 참여, 다양 한 유기 체에 있는 단백질을 포함 하는. P450 효소 촉매 반응 어디 dioxygen의 1 개의 원자에 도입 xenobiotics, 분자 산소의 두 번째 아톰은 2 개의 전자 [방정식 (1 필요로 하는 반응에 의해 양식 물 감소 하는 동안 많은 기판의 hydroxylation )]3,4:
RH + O2 + NADPH + H+ → 노 + H2O + NADP+ (1)
P450 효소 포유류 세포 (microsomal P450 시스템)의 바인딩과 그물 막에 더 NADPH: 시 토 크롬 P450 환 원 효소 (POR) 및 시 토 크롬 b5 를 포함 하는 multienzyme monooxygenase 시스템의 구성원 인 NADH: 시 토 크롬 b5 reductase 효소의 기질 되 나. 일반적으로 허용된 이론 hypothesizes P450에 필요한 2 개의 전자의 기증자 NADPH/POR 시스템입니다. 그럼에도 불구 하 고, 시 토 크롬 b5 수 또한 역할 전자의 기증자 P450, 즉의 반응 주기의 두 번째 감소 동안 P450 감소 전자의 기증자로 어디 NADH: 시 토 크롬 b5 와 함께 작동 reductase2,,34.
포유류 활용 다양 한 P450 효소 (예를 들어, 가족 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26, 및 27의 효소) 스테로이드, 같은 귀중 한 내 인 성 화합물의 합성에 놓을 자연 제품2,3 에 대 한 그들을 사용 하 여 . 다른 CYP 포유류 효소, 인간의 CYP1A2, 2C 9, 2C 19 등 2D 6, 및 3A4, 마약으로 사용 되는 외 인 화학 물질 대사. 5 , 6 가장 중요 한 효소 약물의 대사를 catalyzing 3A subfamily, 특히 CYP3A4 CYPs는. 프로-발암 물질 등 프로-유독 xenobiotics의 변환 인간의 CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 및 3A42,5에 의해 중재 됩니다. 이러한 CYPs의 대부분 (CYP1A1 1B1 제외) 간에 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, CYPs는 여러 extrahepatic 장기에도 표현 됩니다. 이러한 P450s 주로 큰 의미의 있을 때 이러한 장기7에서 반응 중간체에 그들은 화학 물질 (약물)의 bioactivation 대사에 참여. 다양 한 P450s는 이것이 반드시 경우 비록 그들의 기질, 여러 화합물에 의해 유도 됩니다.
많은 P450 효소 화학 (마약) 독성에 역할을 재생합니다. 그들은 뿐만 아니라 자신의 해독 대사 산물에는 xenobiotics를 변환할 수 있지만 또한 수정 하는 또한 다른 생물 학적 속성을 일반적으로 그들의 독성을 일으키는 내 생 고분자 반응 종에 그들을 활성화 합니다. DNA, 지질, 및 단백질 반응 electrophiles 및 활성화 된 화학 물질에서 생성 된 래 디 칼에 의해 그들의 수정에 대 한 목표 수 있습니다. DNA의 경우 몇 가지 중요 한 유전자 응답 및 그들의 메커니즘 해결2,3,,45이미 알려져 있습니다.
DNA에 변화 세포 성장 제어, 감소 될 수 있습니다 그리고이 현상이 발암 과정의 개발을 선도 하는 주된 요인이 될 간주 됩니다. 화학식 DNA의 세대 adducts 화학 물질과 발암의 개시 단계에서 가장 중요 한 단계 중 하나는8,9,,1011처리 판단 데 발암 성 힘. 시연 되었다 DNA의 형성 관계 adducts 및 tumorigenesis 발생, 반면 DNA 양을 감소 adducts 자성8,,910, 에 대 한 책임은 11 , 12 , 13 , 14. 발암 물질/의약품 파생의 형성 DNA adducts의 DNA, 개별 기초에 따라 달라 집니다 그리고 DNA에이 기지의 시퀀스에 의해 영향을 받습니다. 수리의 DNA adducts는 그들의 위치 (베낀 또는 비 복사할 DNA 가닥) 및 수정 된 뉴클레오티드 시퀀스8,,1112,15의 종류에 16.
이 문서에서는, 우리 DNA를 수정 하는 대사 산물으로 활성화 될 그들의 힘을 조사 하기 위해 화학 물질 (마약)의 효소 촉매 변환 활용 절차 설명 (생성 하는 DNA adducts). 화학식 DNA 바인딩, 테스트 화합물 일반적으로 해야 개별 약물에 따라 산화 또는 감소 반응에 의해 활성화. 시험 된 화학 물질의 산화 또는 감소 활성화 P450 의존 효소 시스템 microsomal subcellular 분수에 의해 중재 또는 reductases 감소 하 여 microsomes (POR, NADH: 시 토 크롬 b5 에서 모두 환 원 효소, P450 효소)와 셀룰러 cytosolic subcellular 분수 (NQO1, XO, AO, 과산화 효소). 반응 metabolites 그 후 DNA를 바인딩할 adducts DNA를 형성. 산화와 감소 반응 이러한 반응 종에 여러 약물을 활성화 하는 것이 중요 하기 때문에, 산화/환 원 효소 시스템을 채용 하는 실험적인 절차 설명 합니다. 또한, 적절 한 방법을 감지 하 고 측정 이러한 DNA adducts 자세히 설명 되어 있습니다.
테스트 화학 효소 시스템에 의해 활성화 여부를 확인 하기 위해 두 개의 독립적인 절차 DNA에 바인딩되어 권장: 32P postlabeling 기술과 활용 표시 된 방사성 화합물 (예., 3H 또는 14 C). 첫 번째 파일럿, 32P postlabeling 분석 결과 검사 것이 좋습니다. 정확 하 게 평가 하는 솔루션에서 DNA 콘텐츠의 결정 두 가지 방법 모두 붙여야 합니다.
32P postlabeling 기술을 활용 하 여 비 방사성 화학 물질 (발암 물질/의약품) 3´-phosphodeoxynucleosides, 5´-방사성 인 (32P)와 추가 인 산화에 의해 수정 하는 DNA의 효소 가수분해 오 위치, 그리고 화학 deoxynucleotide의 분리 adducts 정상 (수정된) deoxynucleotides에서 크로마토그래피17 (그림 1)에 의해. DNA는 화합물에 의해 수정 endonuclease, micrococcal nuclease 및 비장 포스로 알려진 exonuclease의 혼합물에 의해 분해 됩니다. (수정 되지 않은) 두 정상을 포함 하 고 deoxyribonucleoside 3´-monophosphates 양식 5´- 에 pH 9.5에서 캐리어 (비 방사성) ATP 및 T4 polynucleotide 키 존재 [γ-32P] ATP와 반응 수정 hydrolyzed DNA의 혼합물 32P 표시 된 3´, 5´ bisphosphates ("표준" 절차 그림1에서). 사용 된 알칼리 pH에서 위치 3´ deoxyribonucleoside 3´ monophosphates dephosphorylate를 T4 polynucleotide 키의 효소 활동을 최소화 가능 하다. 분리 및 32의 해상도에서 adducts P 라는 화학 물질에 의해 수정 되지 않은 레이블된 deoxynucleotides multidirectional 음이온 교환 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) polyethyleneimine (페이) 셀 루 로스 (그림 2에 의해 수행 됩니다 ). (D1 및 D2 방향)에서 첫 번째 및 두 번째 차입 단계에서 [32P] 인산 염으로 레이블이 지정 된 정상 (수정된) deoxynucleotides는 eluted의 짧은 조각에 전해질의 물 솔루션을 사용 하 여 TLC 페이 셀 룰 로스 판의 시작에서 컬럼에 종이 전시 (발암 물질/약물-adducts) 소수 성 속성 바인딩된 화학 물질을 포함 하는 deoxynucleotides 또한 해결 해야 페이 셀 룰 로스 판의 시작에 유지 하는 반면 TLC 판 상단에 적용 와 d 3와 d 4 방향 (그림 2)에서 여러 다른 용 매 시스템. 국산화 adducts 화면 향상 autoradiography;를 사용 하 여 수행 분리 adducts x 선 필름에 어두운 인식할 수 있는 반점으로 검색 됩니다. 관광 명소의 지역 접시에서 excised 있으며 액체 섬광 또는 계산 Cerenkov 방사능을 측정 하는 데 사용. 이미징 방법 지도 및 DNA 계량에 적응 된 스토리지 인 adducts chromatograms 감지에 의해 32P postlabeling 분석 결과 지금 또한 사용 됩니다. 18 는 즉시 영상 기계 같은 검색 이용 자주 하 고 DNA의 정량화 adducts. 스크린의 기술 향상 autoradiography19보다 32P를 탐지 하기 위한 보다 10 배 더 높은 감도를 제공 합니다.
양의 DNA adducts의 상대 값 adduct 라벨 (RAL), 방정식 (2)를 사용 하 여 다음과 같이 계산으로 결정 됩니다.
노출 당 비용입니다. 에 deoxynucleotides adduct RAL =---(2) 32P-ATP의 특정 활동 (cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides
총 [adducted 고 정상 (수정된) deoxynucleotides]의 수 속도 RALs의 값은 adducted deoxynucleotides의 수의 비율 deoxynucleotides20,21. 그러나,이 계산을 기반으로 동등한 adducts의 효율성 라벨 및 일반 deoxynucleotides22. 그러나 다양 한 DNA adducts 32P postlabeling 기술의 고전 ("표준") 절차는 적절 한 (부피 또는 부피 비 adducts),, 그것의 감도 만족 스러운 감지 하에서 낮은 금액 DNA adducts. 이 절차를 사용 하 여 DNA (0.3 fmol adduct / µ g DNA)에 107 수정 되지 않은 deoxynucleotides에 adduct의 양을 감지입니다.
수정이 클래식 32P postlabeling 절차의 다양 한 기법의 감도 상승 이용 되어 있다. 10-100 배 더 높은 감도의 결정의 최대 32여 adducts P 라벨 달성 되었습니다 [γ-32P] ATP (강화 절차)의 제한 레벨을 사용 하 여. 23 , 24 32P postlabeling 방법의 감도 증가 소화 DNA 포함의 부 화를 활용 하 여 제공 하는 추가 절차 adducts nuclease P1 ( 푸른 곰 팡이 citrinum)에서21 (그림 1)와 함께. 이 효소는 바인딩된 화학 (adducted 뉴클레오티드)와 deoxynucleotides는 기본적으로 하지는 기질이이 효소의 수정 되지 않은 deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, dephosphorylate을 좋아한다. 따라서, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (즉, deoxyribonucleosides)에서 γ-32P [32P] 인산 하 여 T4 polynucleotide 키 니 아 제에 의해 phosphorylated 하지은] ATP. 그러나, 일부 화학 물질은 뉴클레오티드의 (adducted deoxynucleotides), deoxyguanosine,이 효소에 의해 수 bedephosphorylated의 c 8에서와 같은 arylamine adducts 대체. 대조적으로, 대부분 다른 adducts (adducts예를 들어, deoxyguanosine의 N2 에서 대체) nuclease p 1에 의해 dephosphorylated 하지. 32P postlabeling이 수정 게이 방법 상당히 더 민감한, 이상 3 개의 크기 순서에 의해 그것의 감도 증가. 또한,이 버전의 32P postlabeling 메서드를 제공 합니다 어디에 더 높은 양의 DNA (5-10 µ g) 및 캐리어 무료 초과 [γ- 32P] ATP는 이용 될 수 있다.
풍부 하 게 하는 또 다른 방법은 adducts, 굽타25설명 된는 물리를 활용 하 여 부피가 큰 deoxynucleotide의 속성 adducts는 n으로 추출 될 수 있다-단계 전송 에이전트 tetrabutylammonium 존재 butanol [32P] 인산 라벨, 수정 되지 않은 deoxynucleotides는이 유기 용 매 추출 저조한 반면 이전 염화 (미정) (그림 1). 그러나, 적은 소수 adducts, 구성 된 deoxynucleotides의 예 비 향기로운 부피가 moieties 또는 작은 알 킬 잔류물, 수정에 대 한 추출 되지 않습니다 효과적으로 n-butanol. 따라서, 그들은 32P postlabeling 방법의이 수정에 의해 분석 하면 기본적으로 감지 되지 않습니다.
모두 32P postlabeling 증가 감도 DNA의 정량화 adducts 엄청난 (최대 3 개의 크기 순서)의 이전에 언급 한 버전, 109,10 정상 당 adduct 하나를 검색할 수 있게 되 고 뉴클레오티드 (0.3-3 박 / µ g의 DNA). 이러한 두 가지 방법 covalently DNA를 바인딩할 그들의 효율성에 대 한 화학 물질을 테스트 하기 위한 권장 하 고, 따라서, 그들은 세부 사항에서이 작품에 설명 되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>트리스</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마 - 알드리치</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>페놀</td><td>로스</td><td>0032.8</td><td></td></tr><tr><td>페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올</td><td>로스</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>펜타</td><td>70390-11000</td><td></td></tr><tr><td>종아리 흉선 DNA</td><td>시그마-알드리치</td><td>D4522</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>시그마-알드리치</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>NADP+</td><td>시그마-알드리치</td><td>N5755</td><td></td></tr><tr><td>NADPH</td><td>시그마-알드리치</td><td>N7505</td><td></td></tr><tr><td>D-포도당 6-인산</td><td>염 시그마-알드리치</td><td>7647001</td><td></td></tr><tr><td>D-포도당 6-인산염 탈수소효소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6378</td><td></td></tr><tr><td>Supersomes</td><td>Corning Gentest</td><td>456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202</td><td></td></tr><tr><td>인간 간 마이크로솜</td><td>Corning Gentest</td><td>452172</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77662</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxypyrimidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H56800</td><td></td></tr><tr><td>에틸 아세테이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437549</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179272</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>종아리 비장의 비장 포스포디에스테라아제, Type II</td><td>Calbiochem</td><td>524711</td><td></td></tr><tr><td>Penicillium citrinum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>의 뉴클레아제 P1</tr><tr><td>Bicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163791</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Tetrabutylammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86870</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437603</td><td></td></tr><tr><td>T4-폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>USB Corp</td><td>70031Y</td><td></td></tr><tr><td>[&gamma;-32P]ATP</td><td>Hartman Analytic GmbH</td><td>FP-201</td><td></td></tr><tr><td>PEI 함침 셀룰로오스 TLC 플레이트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>801053</td><td></td></tr><tr><td>Packard Instant Imager A202400</td><td>Packard</td><td>G120337</td><td></td></tr><tr><td>Ellipticine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>285730</td><td></td></tr><tr><td>3-Nitrobenzanthrone</td><td>은 ref. 40</td><td></td><td></td>에 나타난 바와 같이 제조(합성)</tr></tbody></table>

형성 화학식 dna adducts 효소 활성화 된 발암 물질 및 생체 외에서 마약 및 32p postlabeling에 의해 그들의 결정에 의해

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

화학식 DNA adducts 화학 물질에 의해 형성 또는 발암 성 힘으로 약물 발암 과정의 개시 단계에서 가장 중요 한 요인의 하나로 판단 됩니다. 이 공유 바인딩 tumorigenesis의 원인으로 간주 됩니다, 이제 화학 발암의 중앙 교리로 평가 됩니다. 여기, 방법을 채용 시 토 크롬 P450 하 여 촉매 반응을 설명 하 고 화학 제품 또는 이러한 DNA를 형성 하는 대사 산물을 그들의 정품 인증에 대 한 약물의 효능을 조사 하기 위해 추가적인 생물학적 효소 adducts. 절차는 생물학적 효소 (microsomal와 cytosolic 샘플 한다 P450 또는 다른 생물학적 효소, 즉, peroxidases, NADPH: 시 토 크롬 P450 보유 세포 분수의 격리를 설명 하 되 게 됩니다. oxidoreductase, NAD (P) H:quinone oxidoreductase, 또는 세 산화 효소). 방법 설명 또한, 이러한 효소 뿐만 아니라 DNA의 분리에 대 한 분석된 화학 물질의 대사 활성화를 위해 사용할 수 있는. 또한, 적절 한 방법을 감지 하 고 측정 화학/약물 파생 된 DNA adducts, 즉, 32P postlabeling 기술의 다른 수정 및 방사성 분류의 고용, 화학 분석 자세히 표시.

그들의 공유의 결과로 중간체를 대사에 화학 물질 (발암 물질/약)의 효능을 조사 하 효소 촉매 활성화 (즉, P450, 과산화 효소, reductase)의 활용에 대 한 여기에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 DNA에 바인딩 (세대의 DNA adducts), 우리 (대 한 검토 보고,29,,3031), 항 암 에이전트 ellipticine의 약리 작용의 (i)는 소설 메커니즘을 확인할 수 있었다 (ii) 두의 병 인 nephropathies 식물 알칼로이드 aristolochic 산 (Aristolochic acid 신 장병 그리고 발칸 반도 풍토 성 신 장병) (대 한 검토 보고,32,,<sup class=...

환경 약품 및 중간체 공유 DNA를 생성 하는 bioactivated adducts 효소 수 약물의 효능을 평가 암과 치료의 개발에 중요 한 필드입니다. 메서드는 양식에 그들의 탐지 및 정량화에 대 한 기술 뿐만 아니라 DNA adducts 복합 활성화에 대 한 설명 합니다.

형성 화학식 DNA Adducts 효소 활성화 된 발암 물질 및 생체 외에서 마약 및 32P postlabeling에 의해 그들의 결정에 의해

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 시토크롬 p450 및 추가 생물 변형 효소에 의해 촉매된 반응을 사용하여 공유 DNA 부가물을 형성하는 대사 산물에 대한 활성화를 위한 화학 물질 또는 약물의 효능을 조사하는 방법에 대한 설명입니다. 이 방법은 암의 발병과 그 치료 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 암 발병의 시작을 나타내는 공유 DNA 부가물을 형성하기 위해 환경 화학 물질 또는 약물의 효능을 평가하는 방법 유형을 보여준다는 것입니다.화학 물질의 발암 효능을 결정하는 기술의 의미. 환경 잠재력, 독성 물질 및 약물 및 또한 이러한 화합물에 의해 형성된 공유 DNA 부가물의 형성에 대한 비교적 간단한 방법을 결정합니다. 이 방법은 암의 발병과 치료의 시작에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 과학 분야에도 적용할 수 있습니다.분자 메커니즘, DNA 손상에 대한 연구, 효소 활성화 및 화학 물질의 독소에 대한 구강 연구와 같은. 이 방법에 대한 아이디어를 처음 들은 것은 화학적 발암의 시작 단계와 관련된 과정을 조사했을 때였습니다. 먼저 섭씨 4도에서 0.75ml의 최종 부피에 모든 화합물과 효소 시스템을 첨가하여 배양 혼합물을 준비합니다.이것은 시토크롬 p450의 존재 하에서 DNA와 함께 발암 물질을 배양하는 것입니다. 그런 다음 혼합물에 마이크로솜 또는 순수 재조합 p450을 슈퍼솜으로 첨가합니다. 다음으로, DMSO에 용해된 0.1 밀리몰 엘립티신 약물 7.5 마이크로리터와 물 42.5 마이크로리터를 첨가하여 최종 부피를 0.75 밀리리터로 조정한다.그런 다음 5초 동안 튜브를 볼텍싱하여 구성 요소를 혼합합니다. 그 직후, 뚜껑을 열고 30-60분 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다. 다음으로, 페놀 또는 페놀 클로로포름을 Eppendorf Tube에서 배양 혼합물과 일대일 비율로 혼합합니다.이렇게 하면 배양 혼합물의 DNA에서 단백질 오염이 제거됩니다. 그런 다음 혼합물을 저어 에멀젼을 형성합니다. 그런 다음 주변 온도에서 3 분 동안 1600 회 g로 혼합물을 회전시킵니다.원심분리가 끝나면 피펫을 사용하여 상부 수위를 새 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 유기상과 함께 단백질 계면을 버립니다. 다음으로, 물 상태를 동일한 부피의 페놀과 클로로포름과 일대일 비율로 혼합합니다.그런 다음 원심분리를 반복합니다. 다음으로, 수집된 물 상태에 동일한 양의 클로로포름을 추가하고 다시 원심분리기를 합니다. 그런 다음 섭씨 영하 20도에서 유지되는 차가운 에탄올 2 부피를 첨가하여 수성상에서 DNA를 침전시킵니다.그런 다음 용액을 잘 섞습니다. DNA 부가물 라벨링을 준비하기 위해 바이신 완충액을 방사성 표지된 ATP 용액과 혼합하여 DNA 부가물을 라벨링합니다. 라벨링 혼합물을 NP1 용액 또는 부탄올 농축 혼합물에 첨가합니다.혼합물을 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 PEI-셀룰로오스 TLC 플레이트의 전체 샘플에 약 20마이크로리터를 적용합니다. PEI-셀룰로오스 TLC 플레이트에서 샘플을 발견한 후 플레이트가 D1 방향으로 진행되도록 두어 부가물을 청소합니다.플레이트가 건조되면 플레이트가 D3 및 D4 방향으로 진행되도록 둡니다. D3에서 개발하려면 요소와 함께 pH 3.5에서 포름산리튬 완충액을 사용하십시오. D4 개발을 위해 염화리튬 및 요소와 함께 Tris-HCl 버퍼를 사용하십시오.D4 방향으로 전개하는 데 문제가 발생하지 않도록 D5 방향으로도 플레이트를 전개하십시오. 첫째, P32-postlabeling 기법을 사용하여 DNA 부가물을 형성하는 데 있어 마이크로솜 p450 매개 생체 활성화 타원체의 효율성을 연구합니다. 결과는 쥐 또는 인간 간 마이크로솜의 존재 하에 송아지 흉선 DNA의 데옥시구아노신에서 공유 DNA 부가물의 형성을 보여줍니다. 그러나 대조군에는 부가물이 형성되지 않습니다.다음으로, 과산화효소 의존성 활성화 타원효소의 잠재력을 연구합니다. 이 이미지는 horseradish peroxidase, bovine lactoperoxidase 및 human myeloperoxidase의 존재 하에서 송아지 흉선 DNA에서 공유 DNA 부가물의 형성을 보여줍니다. 실제로, DNA 부가물은 쥐가 생체 내에서 체중 1kg당 40mg의 엘립티신으로 처리될 때 간 DNA에서도 형성됩니다.흥미롭게도, 인간 사이토크롬 p450 효소 CYP3A4는 또한 엘립티신을 12-하이드록시엘립티신 및 13-하이드록시엘립티신과 같은 대사 산물로 효율적으로 산화시킬 수 있는 강력한 잠재력을 보여줍니다. 이러한 대사 산물은 DNA에 쉽게 결합하여 부가물을 형성할 수 있습니다. 다음으로, 뉴클레아제 P1 및 n-부탄올 농축 방법을 사용하여 쥐 및 인간에서 NQ01과 같은 세포질 환원효소와 함께 3-니트로벤잔트론의 활성화 시 DNA 부가물의 형성을 연구합니다.결과는 쥐, 인간 간 세포질 및 쥐 간에서 얻은 송아지 흉선 DNA에서 최대 5 개의 DNA 부가물이 형성되는 것을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도함으로써 사용 된 효소 시스템의 안정성을 기억하는 것이 중요합니다.효소 활성은 얼음에 보관하지 않으면 감소할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생화학 분야의 연구자들, 즉 화학 발암의 생화학 분야의 연구자들이 유기체의 암 발생 시작 과정에서 현상의 본질을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 유전적 공유 DNA 부가물을 대사하기 위해 효소로 활성화되는 환경 화학 물질 또는 약물의 효능을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 과정은 암 기반 치료법 개발에 매우 중요합니다. 매우 위험할 수 있는 화학 물질로 작업하고 있다는 것을 잊지 마십시오. 잠재적인 발암 물질, 방사성 화학 물질(예: 인 ATP).따라서 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험실 라텍스 장갑 및 플렉시 유리 시트와 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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Biochemistry

생화학

우리는 topoisomerase 단백질에 의해 구동되는 분자 규모의 장치의 조립 및 응용 프로그램을 보여줍니다. 구조는 끝이 두 가지 다른 fluorophores을 첨부하여 조직 섹션에서 DNA 나누기의 두 가지 주요 유형의 레이블 생체 분자 센서이다.

DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

급진적 기반 biomimetic 화학은 biomarker 개발에 필요한 건물 업 라이브러리에 적용되었습니다.

화학 생물학에서의 자유 부수 : 화학 행동의 Biomarker 개발에

레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

시 토 크롬 P450s에 의해 발암 성 니트로의 α-hydroxylation는 돌연변이 일으키는 원인이 되는 DNA 손상 중간체 생산 허용된 신진 대사 통로. 그러나, 새 데이터 나타냅니다 nitrosamides 산화 추가 발생할 수 있습니다. 우리는 일반 설명 nitrosamides을 탐지 하기 위한 방법 체 외에서 시 토 크롬 P450 촉매의 물질 대사 니트로에서 생산.

체 외에 대사 시 토 크롬 P450s에 의해 니트로의 Nitrosamide 형성을 탐지 하기 위한 일반적인 방법

이 프로토콜의 목표는 플라스 미드 DNA에 정의 된 DNA-단백질 crosslinks의 수리 계량. Lesioned 플라스 미드는 받는 사람 포유류 세포 선 및 여러 시간 포인트 후 transfection에 수확 하는 저 분자 무게에 페. DNA 복구 속도 스트랜드 특정 뇌관 연장 정량 뒤를 사용 하 여 정량.

간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

우리는 병 변의 민감하고 정확한 정량화를 위한 방법을 여기에 설명 합니다. 8-옥 소-7, 8 디 하이드로 deoxyguanosine),1n6조-2-deoxyadenosine 및1, n6조-2dado deoxyguanosine (1,n2-dguo) DNA에. 이 방법은 노출 된 A/J 마우스의 조직 (폐, 간 및 신장)에서 주변 미세 미 립 자 물질 (PM2.5)의 영향에 대 한 평가에 적용 되었다.

질량 분 광 법에 의해 3 개의 DNA 병 변의 정량화 및 주변 미세 입자 상 물질에 노출 된 마우스의 조직에서 그들의 수준에 대 한 평가

이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

여기에서는 DNA 손상 부위에서 단백질 상호 작용을 검출하기 위한 간단하고 신속한 프로토콜을 제시합니다.

DNA 손상 부위의 단백질을 국소화하기 위한 Proximity Ligand Assay

학습하세요 사이토크롬 P450 효소를 활용한 환경 화학물질 및 약물의 DNA 부가체 형성 능력 평가 방법을. 이 기술은 암 발생 기전 연구와 발암성 평가에 필수적인 도구입니다.

형성 화학식 DNA Adducts 효소 활성화 된 발암 물질 및 생체 외에서 마약 및 ³²P postlabeling에 의해 그들의 결정에 의해

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