사이트별 단백질 Lysine Acetylation 및 Succinylation 산출할 데이터 독립적인 수집 질량 분석을 사용 하 여 정량화
2018년 4월 4일
여기, 우리가 특정 단백질 acetylation 또는 succinylation 인 (산출할) 생 수정 수정 후 도입의 비율 분석을 통해 전체 프로테옴의의 편견된 정량화 제시 양적 화학 acylation 안정 동위 원소 표시 된 anhydrides를 사용 하 여입니다. 함께 중요 한 독립적인 데이터 수집 질량 분석, 정확한 사이트 인 측정 얻을 수 있습니다.
이 새로운 워크플로우의 전반적인 목표는 특정 아세틸화 부위에서 단백질 번역 후 변형의 점유 또는 화학량론을 결정하는 것입니다. 이 새로운 질량 분석기 워크플로우는 더 높은 수준의 정량 정밀도를 제공합니다. 이 방법은 라이신 아세틸화 또는 숙시닐화 부위가 가장 많이 변형되어 단백질 기능을 변경할 수 있는 번역 후 변형에 의한 가역적 단백질 조절에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 라이신 아세틸화와 숙시닐화 및 숙시닐화의 현장 수준 화학량론이 정확하게 결정되고 이 방법이 여러 라이신 잔기를 가진 펩타이드에서 화학량론을 측정할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 무차원의 상대적 존재비 변화를 측정하는 대신 아세틸화 및 숙시닐화 화학량론 또는 변형된 비율과 수정되지 않은 비율을 보여주기 때문에 관련성이 매우 높습니다. 화학량론 분석을 위해 데이터 독립적 획득과 MS2 기반 정량화를 사용하면 측정 정확도가 크게 향상된다는 것을 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어가 처음 떠올랐습니다. 100에 대한 반복 실험 3회 준비
개요
본 연구는 단백질 번역 후 수식화, 특히 아세틸화와 숙시닐화를 정량화하기 위한 새로운 질량 분석 워크플로우를 제시합니다. 이 방법은 이러한 수식화의 부위 특이적 점유율 또는 화학량론을 결정함으로써 측정 정확도를 향상시킵니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 생화학
- 질량 분석법
- 단백질체학
배경
- 번역 후 수식(Post-translational modifications)은 단백질 기능에 중요한 역할을 합니다.
- 아세틸화(acetylation)와 숙신화(succinylation)를 이해하는 것은 가역적인 단백질 조절을 연구하는 데 필수적입니다.
- 전통적인 방법으로는 이러한 수식을 정량화하는 데 정밀도가 부족할 수 있습니다.
- 본 연구의 목적은 화학량론(stoichiometry) 측정의 정확도를 향상시키는 것입니다.
연구 목적
- 단백질 아세틸화 및 숙시닐화의 정확한 정량을 위한 워크플로를 개발한다.
- 어떤 라이신 부위가 가장 많이 변형되었는지와 그것이 단백질 기능에 미치는 영향을 확인한다.
- 다수의 라이신 잔기를 포함하는 펩타이드를 분석할 수 있는 방법을 제공한다.
사용된 방법
- 내인성 수식의 비율 분석.
- 안정 동위원소 표지 무수물을 이용한 정량적 화학적 아실화.
- 데이터 독립 분석 질량 분석법.
- 정확성을 위한 다중 반복 시료 준비.
주요 결과
- 이 방법은 부위별 화학량론을 정밀하게 결정할 수 있게 합니다.
- 수식된 라이신 잔기와 수식되지 않은 라이신 잔기의 비율을 밝혀냅니다.
- 전통적인 방법에 비해 측정 정확도가 더 높습니다.
- 단백질 기능에 영향을 미치는 주요 아세틸화 및 숙신화 부위를 식별합니다.
결론
- 이 워크플로우는 단백질 변형의 정량 분석 능력을 크게 향상시킵니다.
- 이는 아세틸화 및 숙시닐화를 통한 단백질 기능 조절에 대한 통찰을 제공합니다.
- 이 기술은 광범위한 프로테오믹스 연구에 적용 가능합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
부위 특이적 라이신 아세틸화 및 숙시닐화 화학양론의 정확한 정량화는 번역 후 수정의 점유율을 정밀하게 평가할 수 있게 하며, 이는 약물 표적 경로 내에서 단백질의 가역적 조절을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 방법은 단백질체 전반에 걸쳐 수정 수준을 편향 없이 측정함으로써, 생물학적으로 유의미한 아실화 부위를 배경 노이즈와 구별하여 표적 검증을 지원합니다. 상대적 함량 변화가 아닌 화학양론적 데이터를 제공함으로써, 초기 발견 단계에서 기전적 리스크 제거에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 특정 라이신 잔기의 아세틸화 및 숙신화 점유율을 정량화함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 수식 화학량론의 정밀한 측정을 통해 생물학적 리스크 감소를 지원하며, 단백질 활성에 미치는 기능적 영향을 명확히 합니다.
- 예측적 가치: 기능 변화를 일으킬 가능성이 가장 높은 수식 부위를 식별하여 타겟에 대한 신뢰도를 높이며, 포트폴리오 선별을 돕습니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 부위별 아실화 점유 데이터(acylation occupancy data)를 제공하여 하위 워크플로우를 위한 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 정량적 결과: DIA-MS의 단편 이온 피크 면적을 사용하여 분석 표준화에 적합한, 간섭이 감소된 정확한 정량을 가능하게 합니다.
- 확장성: 아세틸화 및 숙시닐화의 재현 가능하고 다중 분석(multiplex-capable)이 가능한 프로테오믹 분석을 통해 스크리닝 준비를 용이하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 질병 관련 아실화 부위를 식별함으로써 발견 단계의 변형 프로파일링을 전임상 검증으로 연결합니다.
- 기전적 리스크 감소: 다중 라이신 잔기를 가진 펩타이드로부터 화학양론을 결정하여 예측 가치에 집중하며, 이를 통해 부위 특이적 분해능을 확보합니다.
- 리스크 조정 추진: 어떤 라이신 변형이 기능적으로 중요한지 또는 확률적인지를 밝혀 go/no-go 결정 수행을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 초기 타겟 검증부터 리드 화합물 발굴에 이르는 발견 연속체에 통합되어, 메커니즘적 이해와 화합물이 단백질 기능에 미치는 영향에 대한 정보를 제공하는 화학량론적 아세틸화 및 숙시닐화 데이터를 제공합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 섭동에 따른 부위 특이적 수식 점유율을 정량화함으로써 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 프로테오믹 샘플 전반의 수식 수준을 표준화된 정량적 측정으로 분석하여 분석 준비 상태를 가능하게 합니다.
- 분석(Analytics): DIA-MS 단편 이온 정량을 통해 정밀한 화학량론적 측정을 제공하여, 수식 상태의 정확한 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 바이오마커 또는 기전적 판독값으로 활용될 수 있는 높은 점유율의 아실화 부위를 식별함으로써 전임상 연속성을 연결합니다.
- 기업 내 재사용(Enterprise Reuse): 여러 프로젝트 및 타겟 클래스에 걸쳐 일관된 PTM 프로파일링을 수행할 수 있는 재사용 가능한 프로테오믹 역량으로 기능합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 아세틸화 및 숙신화의 정확한 부위별 화학량론을 통해 예측 신뢰도를 제공하며, 표적 검증 과정에서의 기전적 모호성을 줄여줍니다.
- 운영적 가치: DIA-MS 및 Skyline 기반 정량을 통해 표준화와 재현성을 보장하여 기술적 변동성을 최소화합니다.
- 전략적 가치: 점유율이 높고 기능적으로 유의미한 수식 부위를 식별함으로써 go/no-go 결정 효율을 높이고 후기 단계의 생물학적 리스크를 감소시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 수식 기반의 기능적 근거를 바탕으로 리스크가 조정된 표적 우선순위 설정이 가능해집니다.
실행 시 고려 사항
- 질량 분석 기반의 프로테오믹스 및 PTM 농축 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 정확한 파편 이온 정량을 위해 DIA 가능 장비 및 스펙트럼 라이브러리 생성에 의존합니다.
- 재현성을 위해 샘플 준비 및 화학적 아실화 프로토콜의 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 해당 워크플로를 다양한 모델 시스템이나 조직 유형에 적용할 때 적응을 위한 고려 사항이 포함됩니다.
- 복잡한 혼합물 내에서 펩타이드 검출 가능성 및 라이신 잔기 접근성과 관련된 실질적인 제약이 따릅니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
1:18
Quantitatively Acetylate and/or Succinylate Proteins Using Isotope-labeled Acetic or Succinic Anhydride
3:48
Digest Reacted Protein Samples Using Glu-C Endoproteinase
6:27
Fractionate Peptides Using Offline Basic-pH Reversed Phase HPLC
8:15
Example Data Analysis Tutorial
10:28
Results: Succinylation Stoichiometry Ratio Calculation of Pre-succinylated BSA
11:13
Conclusion
