Name: Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 학습하세요 면역형광법을 이용한 성체 골격근 위성세포 식별 방법을. 생리적 환경에서 근육 줄기세포를 최소한의 조작으로 관찰할 수 있는 이 기술은 근육 재생 및 질병 연구에 필수적입니다.

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우리 감사 NIAMS 빛 이미징 섹션 현미경 및 기술 지원을 제공 합니다. MF20 및 Pax7 항 체 개발 연구 Hybridoma 은행은 NICHD의 후원 하에 개발 하 고 유지 관리 학과 생물 과학, 아이오의 대학, 아이오와 시티에서 얻은 했다. 이 작품은 국립 보건원의 NIAMS의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜에서 성인 쥐 (2-6 개월), tibialis 앞쪽 (TA) 및 신 근 digitorum longus (EDL)의 앞쪽 뒷 다리 근육 그들의 SCs에 얼룩 면역 형광 검사를 수행 하려면 예제로 채택 되었다. 모든 단계 마우스 및 근육 조직 해 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIAMS/NIH에 의해 승인 되었습니다.
1. 마우스 뒷 다리에서 따/EDL 근육 해 부
<ol><li>NIH의 ACUC의 지침에 따라 CO2 채워진된 안락사 챔버에 마우스 안락사 필요한 경우 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.</li>
	<li>위에 마우스 얼굴 업 해 부 패드 (부정사). 복 부 피부에 70% 에탄올 스프레이. 마우스 배 스킨의 중앙에 가로로 여 1-2 cm를 잘라 다음 마우스 피트를 향해 개방을 당겨서 마우스를 deskin. 마우스 뒷 다리 사지의 한쪽을 노출 합니다.</li>
	<li>두 개의 날카로운 집게를 사용 하 여: 발목, TA/EDL을 연결 하는 힘 줄을 하나를 사용 하 고 다른 하나를 사용 하 여 휴식을 전단 TA/EDL을 취재 하는 근 막. 일단 근 막 벗는 집게의 날카로운 팁을 사용 하 여 TA/EDL 근육 아래 팁을 실행 하 여 TA/EDL 경골 뼈에서 분리.</li>
	<li>여전히는 집게로 잡고가 위로 발목 힘 줄을 잘라. 집게와 발목 쪽에서 TA/EDL을 해제 하는 동안 근육은 TA/EDL 발목에서 무릎에의 경도 선 따라가 위로 잘라. 전체 TA/EDL 경골에서 분리를 무릎 쪽 힘 줄을 잘라.</li>
</ol>2. Cryo-포함 TA/EDL 근육의
<ol><li>컨테이너, 예를 들어액체 질소 목욕 준비., 액체 질소 Dewar 플라스 크. 작은 플라스틱 비 커에 (약 20 mL) 반 전체에 methylbutane를 붓는 다. 그럼 그것을 동결에 액체 질소 목욕에서 비 커를 넣어. 몇 분 후에 methylbutane 동결 되었음을 확인 합니다. 참고: 액체 질소는 드라이 아이스의 양동이 의해 대체 될 수 있지만 동결 시간 느립니다.</li>
	<li>해 부 TA/EDL 작은 플라스틱 주사기 플런저의 평평한 표면에 놓으십시오. 완전히 조교/EDL 몇 방울의 최적의 절삭 온도 (O.C.T.) 화합물 (냉동 매체)로 커버.</li>
	<li>액체 질소 목욕 중 methylbutane 비 커 고 따뜻한 개체와 표면 해빙 (예.가 위 손잡이). 신속 하 게 딥은 O.C.T. 스냅-동결 조직에 녹 인된 methylbutane로 플런저에 TA/EDL을 커버.</li>
	<li>집게와 플런저에서 포함 된 조직을 분리 하 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 넣어. 더 많은 샘플을 처리 하는 동안 그것을 저장 하는 장소 액체 질소에 튜브. 참고: 포함 된 조직 저장할 수 있습니다 장기 (2 년) 또는-20 ° C-80 ° C에서 짧은 기간 (6 개월)에 대 한.</li>
</ol>3. cryostat 단면
<ol><li>O.C.T.는 cryostat의 견본 홀더의 중심에 복합의 한 방울을 추가 합니다. O.C.T. 화합물은 거의 확정 될 때까지 기다립니다. 신속 하 게 발목 쪽으로 수직 O.C.T. 화합물에 포함 된 TA/EDL 스틱 다운 및 무릎 쪽까지.</li>
	<li>탑재 한 cryostat에 견본 홀더, 조직 10 µ m 간격 자르고에 대 한 프 로스트 코팅 슬라이드와 cryo-섹션을 수집 한 슬라이드에 4-8 절.</li>
	<li>적어도 3 h 하룻밤 실 온에서 섹션을 건조. 참고: 비록 하룻밤 이상 냉장고에 섹션을 건조 하는 것은 허용, 그것은 필연적으로 증가 합니다 하지는 autofluorescence. 최상의 결과 얻으려면 건조 0.5 h에 대 한 섹션 진행 됩니다 고정과 얼룩 단계 즉시.</li>
	<li>슬라이드 상자에서 슬라이드를 수집, 즉시 그들을 사용 하 여 또는-80 ° C 또는-20 ° C 나중에 사용할 슬라이드를 저장.</li>
</ol>4입니다. 면역 형광 염색 법에 대 한 시 약의 준비
<ol><li>
버퍼를 준비:
	<ol>
<li>10 x PBS에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 2 리터를 준비 합니다.</li>
		<li>1 x PBS 16%에서 4 %paraformaldehyde (PFA)의 40 mL 준비 PFA.</li>
		<li>PBST의 2 리터를 준비: 0.1% 트리톤-100 1 x PBS.</li>
		<li>2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 PBST-b: PBST의 50 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>2%와 5 %BSA 정상 염소 혈 청으로 PBST-B-g: PBST의 10 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>1 mL 차단 솔루션의 준비. 희석 AffiniPure 팹 조각 염소 반대로 마우스 IgG (H + L) (1:10) PBST-b</li>
		<li>1 x 시트르산 버퍼의 200ml를 준비 합니다. 참고: 위의 솔루션의 볼륨은 적어도 5 슬라이드에 대 한 충분 한. 볼륨은 슬라이드의 수와 슬라이드 컨테이너의 크기에 따라 조정 되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
항 체 얼룩을 준비:
	<ol>
<li>1 차 항 체 (작업 농도): Pax7 마우스 단일 클론 항 체 (IgG1) 희석 하 여 1 차적인 항 체 혼합의 1.2 mL를 준비 (1-5 µ g/mL) + Laminin polyclonal 토끼 항 체 (0.5-2 µ g/mL) + MF20 마우스 단일 클론 항 체 (IgG2b) (0.5-2.5 µ g / mL) PBST-B-g 참고: MF20 마우스 단일 클론 항 체 (IgG2b) 선택 사항입니다.</li>
		<li>2 차 항 체 (작업 농도): 염소 반대로 마우스 IgG1 크로스 흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 488 diluting 하 여 1.2 mL 이차 항 체 혼합의 준비 (0.5-2 µ g/mL) + 염소-토끼 IgG (H + L) 높은 간-흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 플러스 555 (0.5-2 µ g/mL) + 염소 반대로 마우스 IgG2b 크로스 흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 647 (0.5-2 µ g/mL) PBST-B-g 참고: 알 렉 사 Fluor 647 선택 사항입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 면역 형광 염색 법 단계
<ol><li>
Rehydrate 하 고 PFA와 cryo-섹션을 수정.
	<ol>
<li>슬라이드 상자에서 TA/EDL cryo-섹션 슬라이드의 몇 가지를 제거 합니다. 따뜻한 실 온에서 슬라이드 잡고 트레이에 슬라이드.</li>
		<li>액체 차단 펜 (PAP 펜)를 사용 하 여 모든 곳을 알아내는-섹션 슬라이드에 포함 된 영역을 그립니다. 이 원형 슬라이드 밖 흐르는 솔루션을 막을 것 이다.</li>
		<li>실험실 연기 후드에는 트레이 가져가 라. 300-500 µ L 4%의 추가 10 분 1 x PBS와 PFA에 밖으로 세척에 대 한 실 온에서 섹션을 해결 하기 위해 원된 영역 내에서 슬라이드에 PFA 슬라이드 컨테이너에서 적어도 3 x 5 분. 주의: PFA는 독성과 유해 폐기물; 그것은 관리와 함께 작동 한다 고 유해 폐기물 용기에 폐기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
항 원 복구
	<ol>
<li>구 연산 염 버퍼의 200 mL와 함께 다른 슬라이드 컨테이너를 작성.</li>
		<li>컨테이너에 슬라이드를 전송 합니다. 압력 밥 솥 요리 10 분에 대 한 높은 압력 모드에서 슬라이드를 슬라이드와 함께 컨테이너를 전송 합니다.</li>
		<li>배수 물 10 분 전송에 대 한 모든 슬라이드 PBST (200 mL)와 새로운 컨테이너와 컨테이너를 쿨, 3 x 5 분 이상에 대 한 PBST와 슬라이드를 씻어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
차단
	<ol>
<li>슬라이드의 건조를 피하기 위해 습 한 환경을 만들기 위해 슬라이드를 잡고 트레이를 물에 젖은 kimwipes를 추가 합니다.</li>
		<li>트레이, 다시 슬라이드를 이동 하 고 각 슬라이드에 솔루션 차단의 200 µ L를 추가 합니다. 모자와 함께 트레이 커버 하 고 30 분 동안 개발 차단 하자. 참고: Pax7 항 체는 마우스 단일 클론 항 체 때문에 마우스 IgG 마우스 근육 조직에 높은 백그라운드를 만드는의 불특정 바인딩. AffiniPure 팹 조각 염소 반대로 마우스 IgG (H + L)를 사용 하 여 마우스에 마우스 난다 바인딩을 차단 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 차 항 체를 적용 합니다.
	<ol>
<li>슬라이드 슬라이드 컨테이너에서 한 번 PBST와 린스. 그런 다음 다시 얼룩 트레이 슬라이드를 이동 합니다.</li>
		<li>각 슬라이드에 1 차적인 항 체 혼합의 200 µ L을 적용 하 고 모자, 트레이 커버 개발 1 시간 실내 온도에 또는 하룻밤에 4 ° C에서 반응 하 게. 참고: 4 ° C에서 하룻밤 반응 비록 만족 스러운 결과 제공 실 온에서 반응 개발 최상의 결과 제공 합니다. Myosin MF20 항 체 트리플 (Pax7, Laminin MF20) 라벨 수행 믹스에 추가할 수 있습니다. MF20 얼룩 분화 근육 섬유. 이 단계는 또한 PBST-B-g을 줄이기 위해 다음 단계에서 2 차 항 체 (염소 항 체)에서 잠재적인 난다 바인딩 다른 차단 단계 역할을 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 차 항 체를 적용 합니다.
	<ol>
<li>실 온에서 PBST와 함께 1 차 항 체에 밖으로 세척 적어도 3 x 5 분.</li>
		<li>각 슬라이드에 이차 항 체 혼합의 200 µ L을 추가 하 고 허용 하는 적어도 1 시간에 대 한 실 온에서 개발 하는 반응. 참고: Pax7 + Laminin에 대 한 사용 하 여 염소 반대로 마우스 IgG1 알 렉 사 488와 염소 안티 토끼 알 렉 사 555. Pax7 + Laminin + MF20, 염소 반대로 마우스 IgG2b 알 렉 사 647 믹스에 추가.</li>
		<li>PBST와 2 차 항 체에 밖으로 세척 적어도 3 x 5 분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) 카운터 얼룩 및 장착
	<ol>
<li>PBST 슬라이드 컨테이너, 예를 들어, PBST의 200 mL에 DAPI의 10 µ L에에서 DAPI (1:20, 000)를 희석.</li>
		<li>슬라이드 3 분 DAPI 컨테이너에 얼룩.</li>
		<li>PBST와 DAPI 적어도 5 x 5 분 동안 세척 한다.</li>
		<li>설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 합니다. Coverslips와 함께 슬라이드 커버. 주의: DAPI는 유독 하 고 위험한; 그것은 신중 하 게 처리 해야 한다 고 유해 폐기물 병에서 삭제.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 형광 현미경 검사 법
참고: immunofluorescent 얼룩 프로토콜 위에 보고는 넓은 필드 형광 또는 confocal 현미경으로 SCs 시각화를 수 있습니다. 그것은 처음 SCs를 식별 하는 도전 수 있습니다. 도움이 될 수 있는 몇 가지 권장 되는 단계는 여기 있다.
<ol><li>DAPI 채널 및 낮은 배율 목표를 사용 하 여 슬라이드에 대 한 섹션을 시각화.</li>
	<li>높은 낮은 배율을 전환 합니다. 관찰 하기 위해 SCs, 적어도 20 X 목적은 필요)입니다.</li>
	<li>488 (FITC)에 대 한 듀얼 필터 큐브를 사용 하 여 / 555 (Rhodamine) Pax7 Laminin를 모두 관찰 하는 SCs를 식별 하는 동시에 신호. 이 설정에서 Pax7 얼룩의 신호는 배경 잡음을 더 나은 대비.</li>
	<li>신속 하 게 제대로 식별 SCs DAPI FITC에서 채널 대체. 모든 SCs Pax7/DAPI 양성 해야 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li>
<li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li>
<li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+insect+eye+to+vertebrate+muscle%3A+redeployment+of+a+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li>
<li>Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+in+Muscular+Dystrophy+-+Lost+in+Polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity.</a> Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).</li>
<li>Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+the+engines+of+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, the engines of muscle repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).</li>
<li>Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%3A+therapeutic+potential+and+roadblocks%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li>
<li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li>
<li>Giordani, L., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+skeletal+muscle+regeneration%3A+Integrating+genetic+determinants+and+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes.</a> FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+acts+directly+on+the+zebrafish+dermomyotome+to+promote+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation.</a> Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).</li>
<li>Juan, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+EZH2+controls+self-renewal+and+safeguards+the+transcriptional+identity+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells.</a> Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).</li>
<li>Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence%3A+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li>
<li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

위의 프로토콜 Pax7/MF20 zebrafish 골격 근육12얼룩의 방법에 근거 했다. 사용 하 고 단계 차단 솔루션은 동일 하거나 유사한. 사용 하는 항 체는 동일 합니다. 조정된 단계 마우스 근육 조직과 SCs의 기능에 근거 했다. 첫째, 항 체 Laminin 시각화 하 고 SCs의 위치를 확인할 수 있도록 믹스에 추가 되었습니다. 그것은 특히 도움이 488/555;의 듀얼 필터 큐브를 사용 하 여 현미경 SCs의 수를 계산 하 이 크게 시끄러운 autofluorescent 배경에서 밖으로 서 SC 파생 Pax7 신호를 향상. 둘째, 사용 Pax7 항 체는 마우스 항 체 이기 때문에, 우리는 마우스에 마우스 차단 단계 (5.3)을 줄이기 위해 마우스 IgG의 불특정 바인딩에서 발생 배경 추가. 셋째, 항 원 검색 단계 (단계 5.2) 조직을 고정 하는 PFA에 Pax7 항 체와 얼룩에 대 한 중요 했다.
동일한 프로토콜 (강아지와 ...

골격 근육 multinucleated 근육 세포의 구성, myotubes 이라고, myofibers, 힘 및 수 축을 통해 움직임을 생성 하는 구성. Craniofacial 일부 근육을 제외 하면 대부분 골격 근육 somite1라고 하는 임시 미 발달 구조에서 파생 됩니다. 조직적 전조 세포 상피 somite myoblasts 될에서 delaminate. 더 Myoblasts myocytes 멀티 nucleated myofibers를 myotubes 될 융합으로 구분 합니다. 위의 과정은 myogenesis 이라고 불리고 일시적으로 통제 제어 유전자 발현의 특징 이다. 조직적 선구자 표현할 Pax3 Pax7, 반면 myoblasts 익스프레스 MyoD 또는 Myf5 myocytes 익스프레스 myogenin myosins2,3. 근육 성장 있는 myofibers 될 큰 근육 섬유 크기 (비 대)4증가 기존 섬유 (증식)에 더 많은 myonuclei를 통합 하는 프로세스입니다. 근육 성장, 동안 줄기 세포 속성을 차별화 하 고 자기 갱신 수에 있는 조직적 셀의 지속 가능한 소스가입니다. 이 세포는 위성 세포 sarcolemma는 myofiber의 (세포 막)와 기저 lamina5사이 그들의 물리적 위치에 따라 불린다. SCs는 적극적으로 청소년 단계 (출생 후 쥐의 첫 2-3 주), 근육 성장에 기여 하지만 성인 근육6휴식에서 무부하 될. 놀랍게도, 그들은 근육에 다시 활성화 될 수 있습니다 손상 및 복구 손상 된 근육7새로운 근육 세포로 분화.
줄기 세포 속성 기본 근육 생물학 및 근육 질환8의 치료에 대 한 관련 SCs의 연구를 확인합니다. 결과적으로, 그것은 과거 십 년간에서 강렬한 수 사의 영역 되었습니다. 유전학 그리고 epigenetics SCs9,10의 해 부에 엄청난 진행이 했다. 분리 하 고 제자리에 SCs 식별에 관련 된 기술은 개발 하 고 방법11에 따라 최적화 된 했다. Immunofluorescent 얼룩 Pax7를 포함 하 여 특정 항 체를 사용 하 여 SCs의 식별 수 있습니다. 그러나, 부족 및 강한 자동-형광 성인 골격 근육 조직을 결합 하는 SCs의 작은 크기 렌더링 시각화 도전. 여기, 우리는 immunofluorescent 얼룩 프로토콜 Pax7 마우스 근육 조직에 대 한 최적화 및 zebrafish 근육12는 기존 방법에 따라 설명 합니다. 또한, 뚜렷한 fluorophore 표시 Laminin 항 체 기저 lamina는 SCs는 위치를 식별 하기 위해 채택 된다. 이 프로토콜은 지속적으로 Pax7 긍정적인 SCs와 모든 테스트 생리 적 조건 및 발달 단계에서 조직적 선구자의 시각화 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>methylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>최적 절단 온도(O.C.T.) 화합물</td><td>전자 현미경 과학</td><td>62550-01</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco, Themo Fisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>TED PELLA</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Thermo Fisher</td><td>0 1-6201</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment 염소 안티 마우스 IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>20x 구연산염 완충액</td><td>Thermo Fisher</td><td>00 500</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 단클론 마우스 항체(IgG1)(상등액)</td><td>발달 연구 하이브리도마 은행</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>라미닌 다클론 토끼 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>MF20 단클론 마우스 항체(IgG2b)(상등액)</td><td>발달 연구 하이브리도마 Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary 항체, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21242</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsobed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>라이카 CM1860 저온 유지 장치 라이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>카 DM6000 광시야 형광 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>라이카 DMR 광시야 형광 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 컨포칼 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM780 컨포칼 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuisinart 전자 압력솥</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pax7 laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

면역 형광 검사 조직 섹션에 다른 세포 유형을 식별 하는 데 도움이 효과적인 방법입니다. 원하는 셀 인구를 공부 하기 위하여 특정 셀 표식에 대 한 항 체는 조직 섹션에 적용 됩니다. 성인 골격 근육 인공위성 세포 (SCs)는 근육 수리 및 재생에 기여 하는 줄기 세포 이다. 따라서, 그것은 시각화 하 고 다른 생리 적인 조건 하에서 위성 세포 인구를 추적 하는 것이 중요입니다. 골격 근육을 휴식, SCs 기저 lamina 및 myofiber 플라즈마 멤브레인 사이 상주 합니다. SCs는 myofibers 또는 세포 배양에서 식별 하는 데 일반적으로 사용 되 마커 Pax7 짝된 상자 단백질입니다. 이 문서에서는, 골격 근육 부분에 최적화 된 Pax7 면역 형광 검사 프로토콜은 일반적인 얼룩 및 백그라운드를 최소화 하 여. 기저 lamina의 단백질 (laminin)를 인식 하는 또 다른 항 체도 SCs 유사한 프로토콜을 식별 하는 데 사용할 수 있습니다 또한 더블 또는 트리플 Pax7 및 관심사의 추가적인 단백질을 위한 항 체와 라벨을 수행 하기 위해 추가 되었다.

위의 단계에 따라 SCs 성공적으로 성인 휴식 근육 섹션 형광 현미경 (그림 1)의 밑에 구상 될 수 있다. 비록 성인 근육 조직 섬유의 특정 유형에 서 강한 자동 형광 있다, 밝은 알 렉 사 시리즈 염료 배경 잡음을 극복할 수와 신호 밖으로 서 (그림 1A, B, 화살표 머리). 두 광자 공초점 현미경 넓은 분야 형광 현미경 (그림 1A) 보다 상대적으로 깔끔한 이미지를 (그림 1B)를 캡처합니다. 동일한 프로토콜 또한 청소년 생쥐 (그림 2A), 마우스 배아 (그림 2B)의 근육 조직에서 잘 작동 하 고 부상 성인 근육 ...

위성 세포의 정확한 식별 다양 한 생리 및 병 적인 조건 하에서 그들의 기능을 공부 하는 것이 필수적입니다. 이 문서는 얼룩 면역 형광 기반으로 성인 골격 근육 섹션에 위성 셀을 식별 하는 프로토콜을 제공 합니다.

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 면역형광을 통해 성인 골격근 위성 세포를 식별하는 것입니다. 이 방법은 생리학적 및 병리학적 상태 모두에서 근육 줄기 세포의 수와 분포와 관련된 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 제한된 조작만으로 생리학적 환경에서 근육 줄기 세포를 확인할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Faiza Naz입니다. 시작하려면 Dewar 플라스크에 액체 질소를 부어 액체 질소 수조를 준비합니다. 다음으로 10ml의 메틸부탄을 20ml의 플라스틱 비커에 붓고 비커를 액체 질소 수조로 옮깁니다.절개된 경골 전방근을 작은 플라스틱 주사기 플런저의 평평한 표면에 놓습니다. 다음으로, 최적 절단 온도 화합물 몇 방울 또는 OCT 액체 질소 수조에서 메틸 부탄의 비커를 제거한 다음 가위의 손잡이를 사용하여 표면을 해동하십시오. OCT로 덮인 조직을 녹은 메틸 부탄에 빠르게 담그어 스냅 프리즈합니다.그런 다음 집게를 사용하여 플런저에서 내장된 조직을 분리하고 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 마이크로 원심분리기 튜브를 액체 질소에 보관하십시오. 저온 유지 장치 절편을 시작하려면 저온 유지 장치의 검체 홀더 중앙에 O.C.T.compound 한 방울을 추가하고 부분적으로 응고되도록 합니다.그런 다음 발목 쪽이 아래, 무릎 쪽이 위로 향하게 하여 내장된 조직을 OCT 컴파운드에 붙입니다. 다음으로, 검체 홀더를 저온 유지 장치에 장착하고 10마이크로미터 간격으로 조직을 절단합니다. 서리로 코팅된 각 슬라이드에서 4-8개의 극저온 절편을 수집합니다.섹션을 실온에서 3시간 동안 건조시킨 다음 슬라이드를 슬라이드 상자에 모아 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 그런 다음 슬라이드 상자에서 슬라이드를 제거하고 실온으로 데웁니다. 그런 다음 액체 차단 펜을 사용하여 극저온 절편 주변 영역을 표시하여 액체가 측면에서 흘러내리는 것을 방지합니다.흄 후드에서 표시된 영역에 300-500 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드를 첨가하십시오. 슬라이드를 실온에서 10분 동안 배양하여 섹션을 고정합니다. 다음으로, 슬라이드 용기에 PBS로 슬라이드의 파라포름알데히드를 헹굽니다.항원 회수를 시작하려면 슬라이드 용기에 200ml의 구연산염 완충액을 채우고 슬라이드를 용기로 옮깁니다. 그런 다음 슬라이드 용기를 고압의 압력솥에 10분 동안 옮깁니다. 항원 회수 단계는 절편을 실온에서 30분 동안 건조하고 즉시 진행하는 경우 선택 사항입니다.이 경우 항원 회수 단계가 필요하지 않습니다. 그러나 절편을 실온에서 3시간 이상 건조시킨 다음 섭씨 영하 80도에서 보관하는 경우 항원 회수 단계가 필요합니다. 그런 다음 슬라이드 용기를 흐르는 물에 10분 동안 식힙니다.그런 다음 슬라이드를 PBST 200ml가 담긴 새 용기로 옮기고 PBST로 헹굽니다. 물에 적신 실험실 물티슈를 트레이에 추가한 다음 헹궈진 슬라이드를 PAP 펜으로 말하고 트레이에 넣습니다. 슬라이드에 200마이크로리터의 차단 용액을 추가합니다.그런 다음 트레이를 덮고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 사용 중인 Pax7 항체는 마우스 단클론 항체이기 때문에 차단 단계가 매우 중요합니다. mouse-on-mouse 차단 단계는 불특정 바인딩을 줄입니다.그런 다음 슬라이드 용기에 PBST가 있는 슬라이드를 헹구고 트레이에 다시 넣습니다. 1차 항체 믹스 200마이크로리터를 슬라이드에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, PBST로 슬라이드를 헹군 다음 200마이크로리터의 2차 항체 혼합물을 넣고 실온의 암흑 속에서 1시간 동안 배양합니다.잠복기가 끝나면 PBST로 슬라이드를 헹굽니다. 슬라이드 용기에 DAPI를 희석하고 용기에서 슬라이드를 3분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBST로 DAPI를 5분 동안 헹굽니다.마지막으로 장착 미디어로 슬라이드를 장착하고 커버 슬립을 적용합니다. 이 연구에서는 형광 현미경을 통해 성인 휴지 근육 부분에서 위성 세포를 성공적으로 시각화했습니다. 성인 근육 조직과 특정 유형의 섬유에서 일반적으로 볼 수 있는 배경 소음은 마우스 대 마우스 차단을 사용하여 줄입니다.특이적 면역염색 신호는 밝은 Alexa 염료와 접합된 2차 항체를 사용하여 강화됩니다. 이광자 컨포칼 현미경은 광시야 형광 현미경에 비해 더 선명한 이미지를 캡처합니다. 동일한 프로토콜이 어린 마우스, 마우스 배아 및 손상된 성인 근육 조직의 근육 조직에도 적용될 수 있습니다.청소년 근육 조직과 배아 근육 조직 모두 더 많은 활성화된 위성 세포 또는 상대적으로 더 큰 핵을 가진 Pax7 근육 전구체를 나타냅니다. 따라서 성체 마우스보다 어린 마우스의 위성 세포를 시각화하는 것이 더 쉬워집니다. 손상된 근육 조직에서는 활성화된 Pax7 양성 세포가 더 많이 보입니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 자가형광 및 비특이적 마우스 대 마우스 면역 결합에서 발생하는 노이즈를 완전히 제거할 수는 없지만 이 프로토콜을 사용하면 노이즈를 크게 줄일 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 근육 동결절제술에서 위성 세포를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

myofibers의 절연과 문화는 황금...

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

정지 위성 세포의 순수 인구의 분리 및 배양은 근육 줄기 세포 집단은 근육 줄기 세포 생물학 및 재생뿐만 아니라, 근육 퇴행 위축 및 기타 퇴행성 질환의 치료를위한 줄기 세포 이식의 이해에 중요하다.

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

체외 배양 시스템은 척추 근육 생성에 대한 우리의 이해에 필수적인 입증했다. 그러나, 많은, 특히 기초 분류군, nonmammalian 골격 근육 발달과 성장에 대해 배웠 겠죠. 이 조직, 근육 조직 전구 세포 (MPC를)의 성체 줄기 세포를 분리하고, 차 문화 속에서 자신의 자기 갱신, 증식 및 분화를 유지하기위한 효율적이고 강력한 프로토콜에 걸쳐 보존 및 분기 규제 메커니즘의 식별 가능 척추 동물의 계통.

기초 척추 계통의 주요 근원 성 전구 세포 / 근원 세포 배양의 준비

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

이 프로토콜은 9 주 된 쥐의 branchiomeric 머리 근육에서 위성 세포의 분리에 대해 설명합니다. 근육은 다른 아가미 아치에서 시작. 이어서, 위성 세포 분화를 연구하기 mm 크기의 스폿 코팅에 배양했다. 이 접근 방법은 위성 세포의 팽창 및 계대를 피한다.

쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성

활성 autophagy는 근육 줄기 세포 (MuSC) 활성화에 필수적인 생산적인 근육 재생과 관련이 있습니다. 여기, 우리는 LC3의 현장 검출을위한 프로토콜을 제공합니다. LC3는 대조군과 손상된 쥐의 근육 조직 절편의 MyoD- 양성 MuSC에서의자가 작용 마커입니다.

근육 줄기 세포에서 Autophagy의 원위치 Immunofluorescent 얼룩

우리는 골격 근의 중재 된 손상과 자가 전달 siRNA의 주입의 조합을 사용하여 위성 세포에서 특정 유전자의 기능적 손실을 조사하는 생체 내 방법을 설명합니다.

심장 독소 부상에 의한 골격 근육 재생 중 위성 세포 기능 분석 및 생체 내 자체 전달 siRNA 주입

여기서, 우리는 동종구균 돌연변이 라민 Δ8-11 마우스 모델, 에머리-드레이퍼스 근 위축증(EDMD)에 대한 매우 가혹한 모델으로부터 초기 산후 발달 단계에서 단일 근육 섬유를 효율적으로 획득하는 방법을 제안한다.

초기 산후 발달에 있는 에머리 드레이푸스 근 이영양증의 Murine 모형에서 단 근섬유 격리 및 문화

이 프로토콜에서 근육 줄기 세포에 대한 체외 배양 및 기능 분석 방법이 설명되어 있어 내인성 틈새 시장을 통해 대부분의 상호 작용을 보존합니다.

성인 근육 줄기 세포 기능 전 비보의 평가를위한 단일 근섬유 배양 분석

골격근은 상주 줄기세포를 포함한 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 각 세포 유형은 근육 항상성과 재생에 특별한 기여를 합니다. 여기에서는 근육 줄기 세포의 2D 배양과 생리학적, in vivo 및 환경적 특성의 많은 부분을 보존하는 ex vivo 환경에서의 근육 세포 틈새에 대해 설명합니다.

틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양

이 프로토콜은 조직 해리, 순차적 여과, 사전 플레이트 및 정의된 배양 조건을 통해 성체 및 신생아 마우스 골격근에서 1차 근모세포를 분리하고 농축하는 표준화된 방법을 제공하여, 위성 세포 유래 근아세포 배양을 하위 실험 응용으로 구축하고 유지할 수 있게 합니다.

시험관 내 근형성 연구를 위한 골격근 위성 세포 분리

학습하세요 면역형광법을 이용한 성체 골격근 위성세포 식별 방법을. 생리적 환경에서 근육 줄기세포를 최소한의 조작으로 관찰할 수 있는 이 기술은 근육 재생 및 질병 연구에 필수적입니다.

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

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