Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

이 프로토콜의 전반적인 목표는 면역형광을 통해 성인 골격근 위성 세포를 식별하는 것입니다. 이 방법은 생리학적 및 병리학적 상태 모두에서 근육 줄기 세포의 수와 분포와 관련된 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 제한된 조작만으로 생리학적 환경에서 근육 줄기 세포를 확인할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Faiza Naz입니다. 시작하려면 Dewar 플라스크에 액체 질소를 부어 액체 질소 수조를 준비합니다. 다음으로 10ml의 메틸부탄을 20ml의 플라스틱 비커에 붓고 비커를 액체 질소 수조로 옮깁니다.

절개된 경골 전방근을 작은 플라스틱 주사기 플런저의 평평한 표면에 놓습니다. 다음으로, 최적 절단 온도 화합물 몇 방울 또는 OCT 액체 질소 수조에서 메틸 부탄의 비커를 제거한 다음 가위의 손잡이를 사용하여 표면을 해동하십시오. OCT로 덮인 조직을 녹은 메틸 부탄에 빠르게 담그어 스냅 프리즈합니다.

그런 다음 집게를 사용하여 플런저에서 내장된 조직을 분리하고 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 마이크로 원심분리기 튜브를 액체 질소에 보관하십시오. 저온 유지 장치 절편을 시작하려면 저온 유지 장치의 검체 홀더 중앙에 O.C.T.compound 한 방울을 추가하고 부분적으로 응고되도록 합니다.

그런 다음 발목 쪽이 아래, 무릎 쪽이 위로 향하게 하여 내장된 조직을 OCT 컴파운드에 붙입니다. 다음으로, 검체 홀더를 저온 유지 장치에 장착하고 10마이크로미터 간격으로 조직을 절단합니다. 서리로 코팅된 각 슬라이드에서 4-8개의 극저온 절편을 수집합니다.

섹션을 실온에서 3시간 동안 건조시킨 다음 슬라이드를 슬라이드 상자에 모아 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 그런 다음 슬라이드 상자에서 슬라이드를 제거하고 실온으로 데웁니다. 그런 다음 액체 차단 펜을 사용하여 극저온 절편 주변 영역을 표시하여 액체가 측면에서 흘러내리는 것을 방지합니다.

흄 후드에서 표시된 영역에 300-500 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드를 첨가하십시오. 슬라이드를 실온에서 10분 동안 배양하여 섹션을 고정합니다. 다음으로, 슬라이드 용기에 PBS로 슬라이드의 파라포름알데히드를 헹굽니다.

항원 회수를 시작하려면 슬라이드 용기에 200ml의 구연산염 완충액을 채우고 슬라이드를 용기로 옮깁니다. 그런 다음 슬라이드 용기를 고압의 압력솥에 10분 동안 옮깁니다. 항원 회수 단계는 절편을 실온에서 30분 동안 건조하고 즉시 진행하는 경우 선택 사항입니다.

이 경우 항원 회수 단계가 필요하지 않습니다. 그러나 절편을 실온에서 3시간 이상 건조시킨 다음 섭씨 영하 80도에서 보관하는 경우 항원 회수 단계가 필요합니다. 그런 다음 슬라이드 용기를 흐르는 물에 10분 동안 식힙니다.

그런 다음 슬라이드를 PBST 200ml가 담긴 새 용기로 옮기고 PBST로 헹굽니다. 물에 적신 실험실 물티슈를 트레이에 추가한 다음 헹궈진 슬라이드를 PAP 펜으로 말하고 트레이에 넣습니다. 슬라이드에 200마이크로리터의 차단 용액을 추가합니다.

그런 다음 트레이를 덮고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 사용 중인 Pax7 항체는 마우스 단클론 항체이기 때문에 차단 단계가 매우 중요합니다. mouse-on-mouse 차단 단계는 불특정 바인딩을 줄입니다.

그런 다음 슬라이드 용기에 PBST가 있는 슬라이드를 헹구고 트레이에 다시 넣습니다. 1차 항체 믹스 200마이크로리터를 슬라이드에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, PBST로 슬라이드를 헹군 다음 200마이크로리터의 2차 항체 혼합물을 넣고 실온의 암흑 속에서 1시간 동안 배양합니다.

잠복기가 끝나면 PBST로 슬라이드를 헹굽니다. 슬라이드 용기에 DAPI를 희석하고 용기에서 슬라이드를 3분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBST로 DAPI를 5분 동안 헹굽니다.

마지막으로 장착 미디어로 슬라이드를 장착하고 커버 슬립을 적용합니다. 이 연구에서는 형광 현미경을 통해 성인 휴지 근육 부분에서 위성 세포를 성공적으로 시각화했습니다. 성인 근육 조직과 특정 유형의 섬유에서 일반적으로 볼 수 있는 배경 소음은 마우스 대 마우스 차단을 사용하여 줄입니다.

특이적 면역염색 신호는 밝은 Alexa 염료와 접합된 2차 항체를 사용하여 강화됩니다. 이광자 컨포칼 현미경은 광시야 형광 현미경에 비해 더 선명한 이미지를 캡처합니다. 동일한 프로토콜이 어린 마우스, 마우스 배아 및 손상된 성인 근육 조직의 근육 조직에도 적용될 수 있습니다.

청소년 근육 조직과 배아 근육 조직 모두 더 많은 활성화된 위성 세포 또는 상대적으로 더 큰 핵을 가진 Pax7 근육 전구체를 나타냅니다. 따라서 성체 마우스보다 어린 마우스의 위성 세포를 시각화하는 것이 더 쉬워집니다. 손상된 근육 조직에서는 활성화된 Pax7 양성 세포가 더 많이 보입니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 자가형광 및 비특이적 마우스 대 마우스 면역 결합에서 발생하는 노이즈를 완전히 제거할 수는 없지만 이 프로토콜을 사용하면 노이즈를 크게 줄일 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 근육 동결절제술에서 위성 세포를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.