특정 및 감귤 류 녹화 병원 체 Candidatus liberibacter 종 감귤 잎 조직 샘플에서 사용 하 여 기존의 PCR의 정확한 검출

이 절차의 전반적인 목표는 감귤류 잎 조직에서 감귤류 녹화 병원균인 Candidatus liberibacter spp.를 정확하게 검출하는 것입니다. 이 방법을 통해 감귤류 농부와 연구자들은 감귤류 녹화를 일으키는 병원균의 존재를 빠르고 정확하게 식별할 수 있습니다.

시연은 제 연구실의 대학원생인 Ian Palmer가 시연할 것입니다. 이 방법은 효율적이고 비용 효율적이며 정량 분석에 적용할 수 있습니다. 또한 최소한의 실험실 경험과 장비로 수행할 수 있습니다.

먼저 깨끗한 가위를 사용하여 감귤 나무에서 신선한 잎을 통째로 잘라 깨끗한 플라스틱 샌드위치 백에 넣습니다. 그런 다음 소량의 액체 질소를 첨가하여 절구와 절굿공이를 식힙니다. 그런 다음 가위를 사용하여 약 1제곱인치 크기의 잎 조직의 작은 조각을 자릅니다.

잎 조각을 모르타르에 넣어 즉시 얼립니다. 액체 질소가 증발하고 미세한 녹색 가루가 남을 때까지 모르타르로 잎 조직을 빠르게 분쇄하기 시작합니다. 다음으로 금속 주걱을 액체 질소에 10-15초 동안 냉각시킵니다.

그런 다음 차가운 주걱을 사용하여 1.5ML 마이크로 원심분리기 튜브에 모르타르에서 지상 조직을 퍼냅니다. 1000ML 피펫을 사용하여 샘플에 600ML의 핵 용해 용액을 추가합니다. 그런 다음 1-3초 동안 샘플을 소용돌이치십시오.

튜브를 섭씨 65도의 수조에서 15분 동안 배양합니다. 잠복기가 끝나면 10ML 피펫을 사용하여 3ML의 RNA 용액을 lycate에 추가하여 RNA를 제거합니다. 그런 다음 튜브의 내용물을 2-5회 뒤집어 섞습니다.

캐비닛 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후 단백질 침전 용액 200ML를 샘플에 첨가합니다. 20초 동안 튜브를 고속으로 소용돌이

그런 다음 13000G에서 3분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 과정에서 실온에서 유지되는 이소프로판올 600ML를 새로운 1.5ML 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 원심분리가 끝난 후 원심분리기 튜브에서 이소프로판올이 함유된 튜브로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

펠릿을 버리십시오. DNA가 가닥과 같은 실처럼 보이도록 튜브를 뒤집습니다. 다음으로 실온에서 13000G에서 1분 동안 샘플을 원심분리합니다.

원심분리 후 상등액을 디캔팅합니다. 그런 다음 펠릿에 600ML의 70% 에탄올을 추가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 펠릿을 세척하십시오.

13000G에서 튜브를 1분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 그런 다음 흡수성 종이에 뚜껑을 연 상태로 튜브를 뒤집어 15분 동안 자연 건조시킵니다.

건조되면 펠릿에 DNA 재수화 용액 100ML를 추가합니다. DNA 현탁액을 섭씨 65도의 수조에서 한 시간 동안 배양합니다. 혼합하는 동안 주기적으로 튜브를 두드리십시오.

마이크로 큐벳에 정제수 1ML를 넣으십시오. 분광 광도계에서 물을 빈 것으로 읽습니다. 그런 다음 마이크로 큐벳에 샘플 1ML를 추가합니다.

분광 광도계에 마이크로 큐벳을 놓고 DNA 농도를 얻습니다. 50ML PCR 튜브에 모든 시약과 100나노그램의 게놈 DNA를 첨가하여 PCR 반응을 구성합니다. 튜브를 부드럽게 튕겨 시약을 혼합한 다음 빠르게 원심분리합니다.

PCR 튜브를 열 순환기에 넣고 프로그램을 실행합니다. 아가로스 젤을 준비하려면 아가로스 가루 0.4g의 무게를 짙니다. 그런 다음 아가로스 분말을 200ML 삼각 플라스크에 넣고 50X TAE 완충액으로 부피를 1ML로 조정합니다.

아가로스 혼합물을 전자레인지에 약 1.5분 동안 고온으로 돌립니다. 아가로스가 완전히 녹을 때까지 30초마다 흔듭니다. 다음으로 액체 아가로스에 브롬화 에티듐 밀리리터당 10밀리그램 2.5ML를 첨가합니다.

그런 다음 플라스크를 흔들어 브롬화 에티듐을 혼합하고 액체 아가로스 젤을 평평한 젤 틀에 빠르게 붓습니다. 즉시 표준 12 치아 젤 빗을 삽입하십시오. 젤을 실온에서 약 20분 동안 식힌 다음 젤 빗을 제거합니다.

이제 1X TAE 완충액으로 채워진 전기영동 장치에 응고된 겔을 놓습니다. 나중에 총 증폭된 DNA 샘플과 DNA 5ML를 겔의 별도 웰에 로드합니다. 90볼트에서 35분 동안 일정한 전기영동 장치를 시작합니다.

그런 다음 전기 영동 장치에서 젤을 제거합니다. 다음으로 UV transilluminator에 젤을 놓습니다. 302나노미터의 투과광기에서 겔 밴딩 패턴의 사진을 캡처합니다.

녹화 박테리아를 확인하기 위해 감염된 샘플과 감염되지 않은 샘플 모두에서 얻은 PCR 증폭 게놈 DNA를 전기영동합니다. 겔에서 500 염기쌍에 해당하는 이러한 밴드는 CL asiaticas 박테리아에서 Las16S 리보솜 DNA의 특정 영역이 존재함을 나타냅니다. 700 염기쌍에 해당하는 이러한 밴드는 LAA2/LAJ5의 존재를 나타내며 박테리아의 16S 리보솜 베타 오페론 DNA 염기서열에 삽입물이 존재함을 나타냅니다.

400 염기쌍에서 이러한 뚜렷한 띠는 내부 증폭 제어를 나타내는 감귤류 F-box 유전자의 증폭만을 나타냅니다. 결과가 유효한 것으로 간주되려면 이 밴드의 존재가 필요합니다. 반대로, 400 염기쌍에 밴드만 존재하고 500 및 700 염기쌍에 다른 밴드가 없다는 것은 건강한 감귤류 조직을 나타냅니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 존재하는 병원체의 양을 검출하기 위한 RTQPCR과 같은 보다 정량적인 방법의 성능을 허용하도록 조정될 수 있습니다.