Name: 특정 및 감귤 류 녹화 병원 체 Candidatus liberibacter 종 감귤 잎 조직 샘플에서 사용 하 여 기존의 PCR의 정확한 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 학습하세요 감귤 녹화 병원체 Candidatus liberibacter spp.를 감귤 잎 조직에서 PCR과 DNA 추출로 정확히 검출하는 방법을. 이 기법은 농부와 연구자가 병원체를 신속히 식별하는 데 도움을 줍니다.

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H.C. 개념과 Z. Q. F.; 조사, H. C., 제이 C, 그리고 Z. Q. F; 리소스, Z. Q. F.; 쓰기-원래 초안, I. A. P.; 쓰기-검토 및 편집, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. 그리고 Z. Q. F.; 시각화, H. C.; 감독, Z. Q. F.; 자금 수집, Z. Q. F와 F. Q. l.
사우스 캐롤라이나 개선 교사 품질 등 교육 상태 부여 라는 프로젝트, 강화 중간 학년 과학 교사 ' 지식 공장 과정, 구조 및 기능을 통해 참여 식물 과학 연구 (공장에서 과학)
미국 Sates의 교육부 (CFDA 번호 84.367B)에 의해 수 여 하는 자금
게놈 DNA 샘플 제공에 대 한 플로리다의 대학 박사 Nian 왕 감사 하 고 싶습니다 저자에서 감염 감귤 나무 발렌시아.

1. 격리 Genomic DNA 게놈 추출 키트를 사용 하 여 식물 조직에서
<ol><li>감귤 류의 잎 조직이 절단 전체 신선한 깨끗 한가 위를 사용 하 여 감귤 나무에서 잎 그리고 깨끗 한 플라스틱 샌드위치 봉지에 잎을 배치 하 여 얻을. 참고: 잎 조직이 포함 된 가방 두어야 한다 또는 절연된 용기에 얼음에 4 ° C 냉장고에 변질을 피하기 위해 컬렉션 후 가능한 한 빨리.</li>
	<li>박격포와 유 봉 진정 액체 질소의 작은 금액을 추가 합니다. 그들은 재미는 하는 동안 잎 조직, 약 1 평방 인치 크기에서의 작은 조각을 잘라가 위를 사용 합니다. 장소는 박격포에서 컷된 조직 즉시 동결. 필요한 경우 더 많은 액체 질소를 추가 합니다. 참고: 절연된 장갑 항상 액체 질소를 처리 하는 동안 착용 한다.</li>
	<li>신속 하 게 박격포를 사용 하 여 정밀한 분말으로 식물 조직을 갈아. 액체 질소가 완전히 증발 하 고 좋은 녹색 분말 남아 때까지 연 삭 계속.</li>
	<li>짧게 진정에 대 한 10-15, 액체 질소에 금속 주걱 다음 주걱을 사용 하 여 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 박격포 내부 지상 조직 특 종.</li>
	<li>핵 세포 솔루션의 600 µ L 추가 (참조 테이블의 재료)를 사용 하 여 1000 µ L 플라스틱 및 소용돌이 1-3 s에 대 한 샘플 다음 15 분 동안 65 ° C 물 욕조에 품 어.</li>
	<li>그것을 혼합 하 여 15 분 동안 캐비닛 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어 튜브 2-5 번 반전, lysate 10µL 피 펫 사용을 RNase 솔루션의 3 µ L를 추가 합니다. 참고: 계속 하기 전에 실내 온도에 냉각 하는 혼합물을 허용 한다.</li>
	<li>회사 펠 릿 형태로 13000 x g에 단백질 강 수 솔루션, 고속 20 s, 다음 3 분 동안 원심 분리기에서 소용돌이의 200 µ L를 추가 합니다. 샘플은 centrifuged 되 고, 하는 동안 신선한 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 실 온 소 프로 파 놀의 600 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>1000 µ L 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 소 프로 파 놀을 포함 하는 신선한 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 전송 하는 centrifuged 샘플에서는 상쾌한 제거. 펠 릿 지금 삭제 수 있습니다. 참고: 펠 릿 위에 상쾌한의 조금만 금액을 남겨 두어서 단백질으로 상쾌한을 오염 하지 마십시오.</li>
	<li>DNA 가닥 스레드-처럼의 질량으로 표시 될 때까지 튜브를 반전 한 다음 실 온에서 1 분 13000 x g에서 원심.</li>
	<li>상쾌한 가만히 따르다, 펠 릿을 70% 에탄올의 600 µ L를 추가, 여러 번 세척 하는 DNA 고 1 분 13000 x g에서 원심 튜브를 반전.</li>
	<li>조심 스럽게 발음 에탄올, 느슨한 DNA 펠 릿을 떠나 다음 열고 관, 흡수 성 종이 반전. 15 분 동안 실 온에서 건조 공기.</li>
	<li>튜브를 활용 하 여 주기적으로 혼합 하는 동안 1 시간에 대 한 65 ° C 물 욕조에 DNA를 품 어 다음 말린된 DNA 펠 릿을 DNA Rehydration 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>Microcuvette에 순화 된 물의 1 µ L을 놓고 빈으로 사용할 분 광 광도 계에 그것을 삽입 합니다. Microcuvette에 1 µ L의 샘플을 배치 하는 분 광 광도 계에 삽입 하 여 현재의 DNA의 농도 계산 합니다. DNA 농도 (ng / µ L) × (260-320)로 계산 된 희석 요소 × 50 ng / µ L를 될 수 있습니다. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 샘플 4 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
</ol>2. Genomic DNA 견본에 PCR을 수행 합니다.
<ol><li>결합 10 µ L 2 x PCR 마스터 믹스 ( 재료의 표참조), 1 µ L 앞으로 뇌관 (10 오후 / µ L), 1 µ L 반전 뇌관 (10 오후 / µ L) (뇌관 순서 표 2 참조), 100 게놈 DNA의 ng는 샘플에서 추출 하 고 물 (최대 20 µ L 최종 볼륨)에서 정화 한 50 µ L PCR 튜브, 혼합, 영화와 짧게 원심 분리기.</li>
	<li>thermocycler에 PCR 튜브를 삽입 하 고 적절 하 게 실행 ( 표 1참조). 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 필요한 경우, 반응이 완료 된 후 4 ° C에서 예제를 저장 합니다.</li>
</ol>3. electrophorese는 Agarose 젤에 증폭 된 DNA
<ol><li>그리고 무게 0.4 g agarose 분말 1 x TAE 버퍼 함께 깨끗 한 200 mL 삼각 플라스 크, 최대 50 mL 작성에 추가할.</li>
	<li>모든 30 떨고 1.5 분 높은 전자 렌지 s, agarose는 완전히 녹아 때까지. 참고: 절연된 장갑 화상을 방지 하기 위해 액체 agarose를 처리 하는 동안 착용 한다.</li>
	<li>레벨 젤 금형에 액체 agarose 젤을 부 어 다음 액체 agarose를 흔들어 혼합, 10 mg/mL ethidium 평범한 사람의 2.5 µ L를 추가 합니다. 신속 하 게 붓는 후 표준 12-치아 젤 빗을 삽입 합니다.</li>
	<li>실 온에서 20 분을 기다린 다음 제거 젤 빗, 젤 허용 고 젤 수준 젤 상자 1 x TAE 버퍼 가득 합니다.</li>
	<li>웰 스에 총 증폭된 DNA 샘플을 로드 하는 micropipette를 사용 하 여. DNA의 5 µ L 사다리 ( 재료의 표참조)을 샘플에서 별도 잘에서 추가 합니다.</li>
	<li>35 분 90, 상수에 대 한 샘플을 electrophorese 다음 젤을 제거 하 고 UV transilluminator에.</li>
	<li>사진 하 고 302에서 UV transillumination를 사용 하는 동안 패턴 밴딩 젤 분석 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Field Office, F. lorida <a target="_blank" href="http://citrusindustry.net/wp-content/uploads/2016/10/cit1016.pdf">Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size</a>. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).</li>
<li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/2aa9/2db973c8f73893a0799ef82cb8883821127b.pdf">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).</li>
<li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="https://conference.ifas.ufl.edu/citrus12/PDF%20Presentations/Fri-pdf/1045%20Spreen.pdf">The economic impact of HLB on the florida citrus industry</a>. , University of Florida. (2012).</li>
<li>UICEP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathology%22">Pathology</a>. , (2013).</li>
<li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li>
<li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+%28huanglongbing%29+bacterium+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li>
<li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-92-11-1547">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li>
<li>Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="https://www.cacitrusmutual.com/wp-content/uploads/2015/12/2015-USDA-Citrus-Fruits-Summary.pdf">Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015)</a>. , (2015).</li>
<li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+%CE%B2+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li>
<li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263(2012).</li>
<li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li>
</ol>

Huan 첸,이 안 아서 팔 머, Jian 첸, 명 장, 스티븐 L. 톰슨, Fengquan Liu와 청 청 푸 관심 없음 충돌 선언합니다.

그것은 중요 한 최적의 실험 조건 달성 하기 위해 정확 하 게 모든 단계는 따 랐 다입니다. 전체 잎 조직;이 데모 중에 사용 된 그러나, 이론적으로 식물 조직의 모든 종류를 포함 하는 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 이전, 연구 전체 잎 조직, 보다는 오히려 잎 정 맥 조직이, genomic DNA를 추출 있고 비슷한 결과11를 달성. 감귤 류의 FBOX 유전자에 해당 하는 밴드를 하지 못하면 표시 결과 유효 하지 않습니다, 그리고 하나 이상의 절차에 몇 가지 기술적 오류가 있을 수 있습니다. 일반적인 오류 포함: 오염 또는 부적절 하 게 멸 균 물, micropipette 팁, 또는 microcentrifuge 튜브;를 사용 하 여 게놈 DNA 추출; 하는 동안 또는 PCR 혼합에 필요한 하나 이상의 구성 요소를 추가 하는 실패 적절 한 thermocycler 조건; 유지 하기 실패 시 약 또는 그들의 만료 날짜; 다른 재료를 사용 하 여 브로민 추가 실패 브롬 또는...

감귤 류 녹화, 일컬어 huanglongbing, 감귤 나무의 상당한 손실이 발생 했습니다. 한 대표적인 케이스는 플로리다, 질병을 70% 감소를 플로리다 오렌지 박스의 생산에 244 백만 상자에서 1997-1998 시즌에 2016-2017 시즌1월 70 백만 상자 전망 이다. 플로리다에서 감귤 나무의 90% 이상 감염된2, 고 플로리다 감귤 산업 손실 약 1 십억 달러 감귤 류 녹화3중요 한 역할 담당 하는 점에서 감귤 류의 질병으로 인해 매년 추정 된다. 감귤 류 녹화 침략 적 아시아 감귤 류 psyllid Diaphorina citri 에 의해 주로 전염 됩니다 그러나 또한 감염 된 조직. 의 접목 하 여 확산 될 수 있습니다. 질병 정 맥, 비대칭 노란 잎 mottling, 조 defoliation, 나뭇가지 dieback, 루트 부패 및 식물의 죽음의 황 변 발생 합니다. 중요 한 것은, 질병 거의 과일을 생산 하는 시즌에서 꽃을 생산 하는 감귤 류 식물을 발생 합니다. 감염 된 감귤 류 식물에 의해 생산 되는 과일은 미 숙, 녹색, 및 쓴 맛4.
이 방법의 목적은 정확 하 게 하는 것입니다 하 고 정확 하 게 운동 박테리아 Candidatus liberibacter 종, 감귤 류 녹화, 감염 된 감귤 나무5의 체 관 부 내 생활의 원인이 되는 에이전트를 식별 합니다. 게놈 DNA는 살아있는 박테리아를 포함 하는 전체 잎 조직에서 추출 됩니다. 이 추출 된 게놈 DNA oligonucleotides 세균의 16S rDNA 시퀀스에 보완를이 순서를 증폭 하는 데 사용 됩니다 기존의 PCR에 대 한 템플릿으로 사용 됩니다. 감귤 류의 FBOX 유전자 보완 oligonucleotides 내부 증폭 컨트롤로 사용 됩니다. 우리는 이전 연구6에서 성공 하려면 입증 되었습니다 때문에이 방법을 사용 하 여 선택 했습니다.
이 메서드는 간단 하 고, 상대적으로 저렴 한, 어떤 일반적으로 갖춘된 생화학 실험실에서 수행할 수 있는 명확한 이점이 있다. 또한, PCR이 병원 체7, 그리고 생존과 이내 asymptomatic 호스트8년 재현 병원 체의 능력 배양의 어려움으로 인해이 병원 체를 탐지 하기 위한 가장 정확 하 고 정확한 방법에 남아 있다. 많은 다른 전문 PCR 분석 실험 성공적으로;이 병원 체를 검출 하는 데 사용 되었습니다. 그러나, 기존의 PCR 무 증상 호스트8내 특히 정확 하 고 특정 검색에 대 한 간단한 분석 결과 남아 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions</td></tr><tr><td>액상 질소</td><td>Air Products</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler pro with control panel</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td></td></tr><tr><td>1250 W Microwave</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5424 탁상용 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 디지털 수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-15Q</td><td></td></tr><tr><td>금속 주걱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z283274</td><td></td></tr><tr><td>모르타르 및 유봉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td></td></tr><tr><td>LSE Vortex Mixer</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>멸균 10 &mu; L 팁</td><td>TipOne</td><td>1161-3730</td><td></td></tr><tr><td>멸균 200 &mu; L 팁</td><td>TipOne</td><td>1163-1730</td><td></td></tr><tr><td>멸균 1250 &mu; L 팁</td><td>TipOne</td><td>1161-1750</td><td></td></tr><tr><td>가변 볼륨 피펫터 키트</td><td>VWR</td><td>75788-460</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>IBI 사이언티픽</td><td>IB70041</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>17892</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>피셔 케미컬</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>시그마-알드리치</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>&mu; cuvette</td>, <td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td></td></tr><tr><td>쌓을 수 있는 주조 트레이 및 빗,</td><td>Carolina</td><td>213655</td><td></td></tr>, <tr><td>PowerPac, Basic, 전원 공급 장치</td>, <td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr>, <tr><td>Mini-Sub Cell, GT 시스템</td>, <td>Bio-Rad</td>, <td>1704487EDU</td><td></td></tr>, <tr><td>Biospectrometer, basic</td>, <td>Eppendorf</td><td>6135000009</td>, 0.2 mL PCR tubes, <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3439</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>포워드 프라이머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>리</td>버스 프라이머 해당 없음 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>물, PCR 등급</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3315953001</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>1 KB+ DNA ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td></td></tr></tbody></table>

특정 및 감귤 류 녹화 병원 체 candidatus liberibacter 종 감귤 잎 조직 샘플에서 사용 하 여 기존의 pcr의 정확한 검출

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

감귤 류 녹화, 일컬어 huanglongbing, 세계적으로 감귤 류 농장을 ravaging 파괴적인 감귤 류의 질병 이다. 이 질병 원인과 비대칭 노란 잎 mottling, 정 맥 yellowing, defoliation, 루트 부패, 궁극적으로, 감귤 류 식물의 죽음. 감염, 감귤 류 식물 성장 저하는 고 시즌에서 꽃을 생산. 이 꽃 거의 항복 과일, 그리고 그 작은, 쓴, 불규칙 모양의 감귤 항복 할 바람직하지 않다. 이 질병은 감염 된 감귤 직물의 접목 하 여 아시아 감귤 류 psyllid, Diaphorina citri에 의해 확산. 병원 체는 감귤 류 식물 내에서 길고 가변 인큐베이션 기간-가끔 년 전에 증상이 나타납니다. 이 병원 균에서 체 외에서 배양 하려고 낮은으로 인해 성공 했습니다 하 고 내 병원 체의 고르지 못한 농도 감귤 류 조직, 감염 또는 환경 복제 하기 어렵기 때문에 조건의 성장에 도움이 병원 체입니다. 전에 그것은, 그것의 긴 잠복기와 병원 체 문화 연구원 못하는 질병을 식별 하기 위해 매우 어렵습니다. 그 결과, 질병만 된다 명백한 후 갑자기 감귤 류의 농부의 전체 수율을 파괴. 여기에 제시 된 감귤 류 녹화 병원 체, 게놈 DNA 추출 키트 및 PCR를 사용 하 여 Candidatus liberibacter 종의 정확 하 고 구체적인 검색 방법이입니다. 이 메서드는 간단 하 고, 효율적, 비용 효과, 고 정량 분석에 대 한 적응. 이 메서드는 모든 감귤 류의 조직;에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 잠재적으로 조직에 병원 체의 양에 의해 제한 됩니다. 그럼에도 불구 하 고,이 메서드 이전, 감염 된 감귤 류 식물을 식별 하는 감귤 류의 농민을 허용 하 고 더욱 확산 될 수 있습니다 전에이 파괴적인 질병의 확산을 억제.

긍정적인 결과 수익률 500 해당 고유 밴드 Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, 및/또는 독특한 밴드 700 해당 bp bp Laa2/Laj5, 16S ribosomal β에 삽입에 대 한 오 페론9. 내부 증폭 제어 밴드 또한 400에 표시 되어야 합니다 혈압. 이 밴드는 감귤 류의 FBOX 유전자10, 증폭에 해당 하며 유효 하기 결과 대 한 표시 되어야 합니다 (그림 1 및 그림 2). 두 500의 부족 혈압과 700 bp 밴드는 400 bp 밴드는 존재 하는 동안 부정적인 ...

감귤 류 녹화는 세계적으로 감귤 류 작물에 영향을 미치는 특히 파괴적인 질병 이다. 여기에 제시 된 간단한 방법을 사용 하는 PCR 및 감귤 잎 조직이의 게놈 DNA 추출 감귤 류 녹화 병원 체, Candidatus liberibacter 종의 정확 하 고 정확한 식별에 대 한

특정 및 감귤 류 녹화 병원 체 Candidatus liberibacter 종 감귤 잎 조직 샘플에서 사용 하 여 기존의 PCR의 정확한 검출

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

이 절차의 전반적인 목표는 감귤류 잎 조직에서 감귤류 녹화 병원균인 Candidatus liberibacter spp.를 정확하게 검출하는 것입니다. 이 방법을 통해 감귤류 농부와 연구자들은 감귤류 녹화를 일으키는 병원균의 존재를 빠르고 정확하게 식별할 수 있습니다.시연은 제 연구실의 대학원생인 Ian Palmer가 시연할 것입니다. 이 방법은 효율적이고 비용 효율적이며 정량 분석에 적용할 수 있습니다. 또한 최소한의 실험실 경험과 장비로 수행할 수 있습니다.먼저 깨끗한 가위를 사용하여 감귤 나무에서 신선한 잎을 통째로 잘라 깨끗한 플라스틱 샌드위치 백에 넣습니다. 그런 다음 소량의 액체 질소를 첨가하여 절구와 절굿공이를 식힙니다. 그런 다음 가위를 사용하여 약 1제곱인치 크기의 잎 조직의 작은 조각을 자릅니다.잎 조각을 모르타르에 넣어 즉시 얼립니다. 액체 질소가 증발하고 미세한 녹색 가루가 남을 때까지 모르타르로 잎 조직을 빠르게 분쇄하기 시작합니다. 다음으로 금속 주걱을 액체 질소에 10-15초 동안 냉각시킵니다.그런 다음 차가운 주걱을 사용하여 1.5ML 마이크로 원심분리기 튜브에 모르타르에서 지상 조직을 퍼냅니다. 1000ML 피펫을 사용하여 샘플에 600ML의 핵 용해 용액을 추가합니다. 그런 다음 1-3초 동안 샘플을 소용돌이치십시오.튜브를 섭씨 65도의 수조에서 15분 동안 배양합니다. 잠복기가 끝나면 10ML 피펫을 사용하여 3ML의 RNA 용액을 lycate에 추가하여 RNA를 제거합니다. 그런 다음 튜브의 내용물을 2-5회 뒤집어 섞습니다.캐비닛 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후 단백질 침전 용액 200ML를 샘플에 첨가합니다. 20초 동안 튜브를 고속으로 소용돌이치십시오.그런 다음 13000G에서 3분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 과정에서 실온에서 유지되는 이소프로판올 600ML를 새로운 1.5ML 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 원심분리가 끝난 후 원심분리기 튜브에서 이소프로판올이 함유된 튜브로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.펠릿을 버리십시오. DNA가 가닥과 같은 실처럼 보이도록 튜브를 뒤집습니다. 다음으로 실온에서 13000G에서 1분 동안 샘플을 원심분리합니다.원심분리 후 상등액을 디캔팅합니다. 그런 다음 펠릿에 600ML의 70% 에탄올을 추가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 펠릿을 세척하십시오.13000G에서 튜브를 1분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 그런 다음 흡수성 종이에 뚜껑을 연 상태로 튜브를 뒤집어 15분 동안 자연 건조시킵니다.건조되면 펠릿에 DNA 재수화 용액 100ML를 추가합니다. DNA 현탁액을 섭씨 65도의 수조에서 한 시간 동안 배양합니다. 혼합하는 동안 주기적으로 튜브를 두드리십시오.마이크로 큐벳에 정제수 1ML를 넣으십시오. 분광 광도계에서 물을 빈 것으로 읽습니다. 그런 다음 마이크로 큐벳에 샘플 1ML를 추가합니다.분광 광도계에 마이크로 큐벳을 놓고 DNA 농도를 얻습니다. 50ML PCR 튜브에 모든 시약과 100나노그램의 게놈 DNA를 첨가하여 PCR 반응을 구성합니다. 튜브를 부드럽게 튕겨 시약을 혼합한 다음 빠르게 원심분리합니다.PCR 튜브를 열 순환기에 넣고 프로그램을 실행합니다. 아가로스 젤을 준비하려면 아가로스 가루 0.4g의 무게를 짙니다. 그런 다음 아가로스 분말을 200ML 삼각 플라스크에 넣고 50X TAE 완충액으로 부피를 1ML로 조정합니다.아가로스 혼합물을 전자레인지에 약 1.5분 동안 고온으로 돌립니다. 아가로스가 완전히 녹을 때까지 30초마다 흔듭니다. 다음으로 액체 아가로스에 브롬화 에티듐 밀리리터당 10밀리그램 2.5ML를 첨가합니다.그런 다음 플라스크를 흔들어 브롬화 에티듐을 혼합하고 액체 아가로스 젤을 평평한 젤 틀에 빠르게 붓습니다. 즉시 표준 12 치아 젤 빗을 삽입하십시오. 젤을 실온에서 약 20분 동안 식힌 다음 젤 빗을 제거합니다.이제 1X TAE 완충액으로 채워진 전기영동 장치에 응고된 겔을 놓습니다. 나중에 총 증폭된 DNA 샘플과 DNA 5ML를 겔의 별도 웰에 로드합니다. 90볼트에서 35분 동안 일정한 전기영동 장치를 시작합니다.그런 다음 전기 영동 장치에서 젤을 제거합니다. 다음으로 UV transilluminator에 젤을 놓습니다. 302나노미터의 투과광기에서 겔 밴딩 패턴의 사진을 캡처합니다.녹화 박테리아를 확인하기 위해 감염된 샘플과 감염되지 않은 샘플 모두에서 얻은 PCR 증폭 게놈 DNA를 전기영동합니다. 겔에서 500 염기쌍에 해당하는 이러한 밴드는 CL asiaticas 박테리아에서 Las16S 리보솜 DNA의 특정 영역이 존재함을 나타냅니다. 700 염기쌍에 해당하는 이러한 밴드는 LAA2/LAJ5의 존재를 나타내며 박테리아의 16S 리보솜 베타 오페론 DNA 염기서열에 삽입물이 존재함을 나타냅니다.400 염기쌍에서 이러한 뚜렷한 띠는 내부 증폭 제어를 나타내는 감귤류 F-box 유전자의 증폭만을 나타냅니다. 결과가 유효한 것으로 간주되려면 이 밴드의 존재가 필요합니다. 반대로, 400 염기쌍에 밴드만 존재하고 500 및 700 염기쌍에 다른 밴드가 없다는 것은 건강한 감귤류 조직을 나타냅니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 존재하는 병원체의 양을 검출하기 위한 RTQPCR과 같은 보다 정량적인 방법의 성능을 허용하도록 조정될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

출처: 굴라, S. 외. 다중성 PCR 및 모세관 전기영동을 이용한 어류 병원성 박테리아 Yersinia ruckeri 의 다중 좌위 변수 연합 반복 분석. J. Vis. 경험 (2019).이 프로토콜은 고립된 집락을 초순수수에 부탁하고 열을 가해 세포를 용해하여 Yersinia ruckeri 에서 유전체 DNA를 추출합니다. 원심분리는 DNA 함유 상청액을 세포 잔해에서 분리하여 PCR 기반 유전체형 분석과 역학 분석에 적합한 주형 DNA를 생성합니다.

병원성 박테리아에 감염된 식물 잎 조직에서 유전체 DNA 추출

출처: 첸, H. 외. 감귤잎 조직 샘플에 대한 기존 PCR을 이용한 감귤 녹색 병원체 Candidatus liberibacter 속의 특이적이고 정확한 검출. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 병원성 박테리아에 감염된 감귤 잎 조직에서 전체 유전체 DNA를 추출하는 과정을 보여줍니다. 이 프로토콜은 체관에 제한된 병원체의 PCR 기반 후속 검출을 위한 신뢰할 수 있는 DNA 회수를 가능하게 합니다.

박테리아 감염 탐지를 위한 잎에서 총 DNA 추출

병원체 성장의 정량화는 다양한 애기장대(Arabidopsis) 탈리아나(Arabidopsis) 면역 반응을 특성화하는 강력한 도구입니다. 여기에 설명된 방법은 Pseudomonas syringae pv를 정량화하기 위해 최적화된 주사기 침투 분석을 제공합니다. 마쿨리콜라 성체 애기장대에서 ES4326 성장.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

중첩 된 PCR 틱 보렐 리아 burgdorferi, Lyme 질병의 원인이 되는 에이전트에 대 한 조사를 DNA 추출에 적용 될 수 있는 민감한, 특정, 그리고 간단한 기술입니다. 초기 PCR 실험 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 내부 뇌관을 사용 하 여 후속 반응에 대 한 템플릿 되 긴 amplicons 생성.

중첩된 한 PCR를 사용 하 여 틱에서 라임 질병 스피로, 보렐 리아 Burgdorferi, 감지

이 문서는 Bemisia tabaci 루프 중재 등온 증폭 (램프) 기술 기반에 대 한 빠른 식별 분석 결과 대 한 프로토콜을 보고 합니다. 프로토콜은 최소한의 실험실 훈련이 필요 하 고 따라서, 항구, 공항 등 식물 수입에 대 한 항목의 지점에서 현장 구현 될 수 있습니다.

루프-중재 등온 증폭 (램프) 분석 결과 Bemisia tabaci 의 빠른 식별

현장이나 실험실에서 분석할 수 있는 루프 매개 이더스말 증폭(LAMP) 분석과 결합된 필터 종이 DNA 추출 방법을 사용하여 수원에서 피토프토라 캡시 동물원을 검출하는 방법을 개발했습니다.

루프 매개 이소르말 증폭을 사용하여 관개물에서 피토프토라 캡시 검출

이 연구에서는 CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 기반으로 하는 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스에 대한 빠르고 민감하며 휴대 가능한 검출 방법이 개발되었습니다.

CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 사용한 현장 배치 가능 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 검출

우리는 체관부가 풍부한 나무 껍질 감귤류 새싹 조직을 신속하게 처리하는 도구를 설계, 제작 및 검증했습니다. 현재 방법에 비해 버드우드 조직 추출기(BTE)는 시료 처리량을 늘리고 필요한 인건비 및 장비 비용을 절감했습니다.

기기 엔지니어링을 통한 다운스트림 병원균 검출을 위한 Citrus Budwood 가공 자동화

이 원고는 황룡빙 감귤병과 관련된 박테리아(Candidatus Liberibacter asiaticus) 또는 그 곤충 매개체(Diaphorina citri, Kuwayama)에 대한 분자의 효과를 스크리닝하기 위한 새로운 직접 식물 주입 장치를 설명합니다.

식물의 분자 전달을 위한 직접 주입 장치

이 프로토콜에서, 결합된 재조합효소 중합효소 증폭 CRISPR/Cas12a 분석은 침입성 식물 병원체인 Fusarium oxysporum f. sp. cubense 열대 인종 4의 검출을 위해 설명된다.

Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4를 검출하기 위한 복합 재조합효소 중합효소 증폭 CRISPR/Cas12a 분석

여기에서는 증폭 준비 세포 용해, 재조합효소 중합효소 증폭 및 CRISPR/Cas12a 분석을 사용하여 Lotmaria passim 및 Nosema ceranae 와 같은 꿀벌 병원체에서 DNA를 검출하는 간단하고 빠른 절차를 설명합니다.

RPA/CRISPR/Cas12a 시스템과 결합된 알칼리 용해를 통한 트리파노소마티드 기생충 및 노세마 세라네 의 현장 DNA 검출

학습하세요 감귤 녹화 병원체 Candidatus liberibacter spp.를 감귤 잎 조직에서 PCR과 DNA 추출로 정확히 검출하는 방법을. 이 기법은 농부와 연구자가 병원체를 신속히 식별하는 데 도움을 줍니다.

특정 및 감귤 류 녹화 병원 체 Candidatus liberibacter 종 감귤 잎 조직 샘플에서 사용 하 여 기존의 PCR의 정확한 검출

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