Name: CXC Chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 CXC Chemokine Ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 Cytometry 기반 시험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 배우세요 CXCL12와 CXCR4 결합을 억제하는 화합물을 식별하는 유세포 분석 기반 세포 결합 분석법을 활용한 G단백질 연결 수용체 약물 발굴 방법을. 방사성 표지 없이 살아있는 세포를 사용하여 정확한 수용체 결합 분석이 가능합니다.

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저자 에릭 Fonteyn 우수한 기술 지원에 대해 감사 하 고 싶습니다. 이 일 구 루벤에 의해 지원 되었습니다 (no를 부여 합니다. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, no를 부여. G.485.08)와 Fondation Dormeur 파두츠.

1입니다. 세포 배양의 유지 보수
참고: 1과 2에 설명 된 모든 단계는 층 류 캐비닛에 무 균 조건 하에서 수행 됩니다.
<ol><li>37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터 T75 문화 플라스 크에 세포 성장. 참고:이 분석 결과에서 Jurkat 세포 (즉, 인간의 leukemic T 림프 구 세포 endogenously CXCR417익스프레스)는 사용 됩니다. 세포 표면에 CXCR4 표현의 cytometry에 의하여 세포 배양을 통해 평가 되어야 한다. 그러나 교류 cytometry 절차 및 셀 표면에 수용 체 식 수준 아니다,,이 프로토콜의 범위 내에서 하지만 되었습니다 확인 시 약의 설명 설명 이전17.</li>
	<li>하자 Jurkat 세포 성장에 80-85%에 도달할 때까지 confluency. 소설 플라스 크에 세포를 뿌리고, 하기 전에 실내 온도 (RT)를 도달 하는 모든 시 약을 하실 수 있습니다.</li>
	<li>소설 T75 문화 플라스 크를 신선한 완전 한 성장 매체 (RPMI-1640 매체, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2mm 글루타민) 20 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>소설 T75 문화 플라스 크를 (세포 현 탁 액 25 mL를 포함 하는) 원래 T75 플라스 크에서 Jurkat 세포 현 탁 액 5 mL를 추가 합니다. 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.</li>
</ol>2. 경쟁 분석 결과 바인딩 CXCL12, 분석 결과 버퍼 및 Jurkat 세포의 준비.
<ol><li>동결 건조 된 시 약 (어둠 속에서-80 ° C에 저장) 초순 0.01% (볼륨/볼륨) 폴 20의 보충에 용 해 하 여 CXCL12AF647 (20 µ g/mL, 참조 테이블의 재료 및 시 약)의 재고 솔루션을 준비 합니다. 단일 저장소-80 ° c, 빛 으로부터 보호이 재고 솔루션에서 aliquots를 사용 합니다.</li>
	<li>200 mL 행 크의 균형 소금물 (HBSS, 10 배, 페 놀 레드과 나트륨 중 탄산염, 최종 농도 x 1 없이) 40 mL HEPES (1 M, 20mm 최종 농도)를 추가 하 여 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. 추가 초순 2 L. 추가 4 g (0.2% 무게/볼륨) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 최종 볼륨을 가져오고 자기 통해 BSA를 분해 하는 감동. 마지막으로, pH 7.4 (NaOH을 사용 하 여이 대 한)를 조정 하 고 참조 테이블의 재료 및 시 약0.2 µ m 숨 구멍을 통해 솔루션 필터 진공 매니폴드를 사용 하 여. 참고:이 분석 결과 버퍼 프로토콜의 모든 추가 단계에 사용 됩니다.</li>
	<li>수와 세포의 생존 능력을 계산 합니다. 이 위해, 세포 현 탁 액의 샘플 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 희석. 참고: 우리 정기적으로 사용 하 여 자동된 세포 생존 능력 분석 ( 테이블의 재료 및 시 약참조) 다양 한 농도에서 세포 정지 계산의 능력. 셀 계산에 대 한 세포 현 탁 액 1.5 ml PBS (다른 희석, 예를 들어, 1.9 ml PBS, 0.1 mL 있습니다 가능) 0.5 mL를 희석. Trypan blue 염료 제외 방법에 근거 하는이 메서드의 사용 되었습니다26위에서 설명한. 다른 여러 장치 계산 셀 번호와 동일 하 게 작동 하는 생존에 대 한 상업적으로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>5 분에 대 한 400 x g에서 원심 (사용 하는 원심 분리기의 종류에 대 한 재료 및 시 약의 표 참조)에 의해 살 균 50 mL 튜브에 셀 (즉, ~ 24 x 106 셀 하나의 완전 한 96 잘 접시와 분석 결과 실행)의 원하는 번호를 수집 실시간</li>
	<li>부드럽게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 붓는 다. 신선한 분석 결과 버퍼를 추가 (예: 20 mL)와 부드럽게 위아래로 pipetting으로 셀 resuspend.</li>
	<li>실시간에서 5 분에 대 한 400 x g에서 다시 셀을 원심</li>
	<li>상쾌한 떨어져 다시와 5 x 106 셀/mL의 조밀도를 신선한 분석 결과 버퍼에서 셀 펠 릿 resuspend.</li>
</ol>3. 경쟁 의무적인 분석 실험
참고: 실제 경쟁 바인딩 분석 결과 RT에서 수행 되 고 비 살 균 조건 하에서 수행할 수 있습니다.
<ol><li>조사 분석 결과 버퍼에서 화합물을 희석 (2.2 참조) 원하는 농도를. 자세한 화합물의 특성에 대 한 초기 심사 (예를 들어, 10 µ M 최종 농도)에 대 한 화합물의 농도 고정된 하거나, 또는 농도의 직렬 희석 시리즈 준비 중 (예를 들어, 1/3, 1/4 또는 1 / 5 희석 시리즈 1 µ M, 최종 농도에서 시작). 복합 솔루션 궁극적으로 2 x 분석 결과;에 희석 될 다는 것을 명심합니다 따라서, 집중된 솔루션 x 2를 준비 합니다.</li>
	<li>바닥판 라운드 분명 96-잘으로 복합 솔루션 (2 배 농축) 100 µ L를 분배 ( 테이블의 재료 및 시 약참조) 밖으로 (예를 들어, 그림 1C) 미리 정의 된 실험 배치에 따르면. 참고:이 단계에서 부정과 긍정적인 제어 샘플 분석 결과에 포함 됩니다. 부정적인 컨트롤 샘플분석 결과 버퍼의 100 µ L 96 잘 접시의 우물에 화합물 대신 추가 됩니다. 긍정적인 컨트롤 샘플에 대 한 분석 결과 버퍼는이 단계에 추가 됩니다. 또한 여러 가지 화합물의 희석 시리즈 테스트는 일반적인 실험 레이아웃에 대 한 그림 1C 참조.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 50 µ L 추가 (2.7; 참조 106 셀 x 0.25) 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시에 시 약 저수지에서. 어둠 속에서 RT에서 15 분 동안 접시를 품 어.</li>
	<li>붙일 레이블된 CXCL12의 50 µ L 추가 (CXCL12AF647 분석 결과 버퍼, 집중 하는 4 x 25 ng/mL의 최종 농도에즉, 100 ng/mL) 96 잘 접시의 우물에 비슷한 시 저수지에서. 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 품 어. 주: 부정적인 컨트롤 샘플에 대 한 추가 분석 결과 버퍼 대신 합니다. 따라서, 부정적인 컨트롤 샘플에서 검출 하는 형광 신호 autofluorescent 배경 신호 (그림 1A)에 대응 됩니다. 긍정적인 통제 견본CXCL12AF647의 50 µ L/잘 추가 합니다. 긍정적인 통제 견본 최대한 형광 신호 감지, 이후 아무 잠재적인 억제 화합물과 사전 외피에 의해 포함 되었다 (그림 1A)를 얻을 것입니다.</li>
	<li>접시를 뒤집어 여 실시간 제거 수송과 세포에서 상쾌한에 5 분에 대 한 400 x g에서 96 잘 접시를 원심. 조직에 접시를 건조.</li>
	<li>멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 우물을 시 저수지에서 신선한 분석 결과 버퍼의 200 µ L를 추가 합니다. 바로 진행 합니다.</li>
	<li>접시를 뒤집어 여 실시간 제거는 상쾌한에 x 400g에 5 분 동안 다시 접시를 원심 하 고 조직에 다시 그것을 건조.</li>
	<li>부드럽게 1% paraformaldehyde PBS에 용 해의 200 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend. 이 단계는 셀 해결 됩니다.</li>
	<li>Cytometry 여 형광의 정량화와 즉시 프로토콜을 계속 합니다.</li>
</ol>4. cytometry에 의해 샘플의 분석
CXCL12AF647 얼룩이 고 집착된 셀 cytometry 사용 하 여 분석할 준비가 됩니다. 교류 cytometers의 여러 종류를 사용할 수 있습니다, 하지만 그들은 정확한 레이저 (즉, 빨간색 레이저, 여기 범위 ~ 630 nm) 여기와 fluorophore 탐지에 대 한 적합 한 필터 장착 해야 (방출 필터 ~ 660 nm). 그들은 96 잘 접시 형태로 샘플을 처리할 수 있이 필요가 있다. 적당 한 흐름 cytometry 장치의 예는 테이블의 재료 및 시 약에부여 됩니다.
<ol><li>장치를 시작 하 고 해당 소프트웨어를 열고 ( 테이블의 재료 및 시 약참조).</li>
	<li>점 오 점 형식으로 시각을 다음 세포 매개 변수 선택: 산포 (FSC), 측면 살포 (SSC) 및 fluorophore (CXCL12AF647) 검색 채널 전달. 참고: FSC 매개 변수를 사용 하는 세포는 차별 그들의 크기에 따라 감지 된 빛 흡수 셀의 직경에 비례 이기 때문. SSC 매개 변수를 90 ° 각도로 산란 측정 셀의 세분성에 대 한 정보를 제공 합니다.</li>
	<li>FSC 그리고 SSC 매개 변수를 기반으로 정의 된 동질적인 셀 인구의 게이팅을 수행 하려면 하나의 샘플 (예를 들어, 부정적인 컨트롤 샘플)을 선택 합니다.<ol>
<li>교류 cytometer에 집착 셀 ~ 100 µ L의 자동 주입이 부정적인 컨트롤 샘플에서 선택 합니다. 옵션 "혼합" 주입 하기 전에 선택한 1.5 µ L/s의 샘플 유량을 사용 합니다.</li>
		<li>"취득 데이터."를 선택 하 여이 샘플을 실행 이 샘플에 대 한 FSC 그리고 SSC 매개 변수는 화면에 표시 됩니다.</li>
		<li>소프트웨어의 제어 도구를 선택 합니다. 미리 FSC 그리고 SSC 점 오 점 시각에 따라 달라 집니다, 게이팅 하 여 균일 하 고 가능한 세포 인구를 정의 합니다. 이렇게 하려면 homogenously 분산된 단일 셀 (이 하 "행사")이 두 차원에 따라 포함 (를 사용 하 여 소프트웨어의 제어 도구) 다각형을 만듭니다. 참고: 제어 절차는 추가 분석을 위해 사용 될 것 이다 균질이 고 실행 가능한 세포 인구를 정의 하는 것을 목표로. 게이팅 가능한 세포의 대다수 FSC 그리고 SSC 매개 변수에 따라 동종 세포 인구를 형성할 것 이다 가정에 의존 합니다. 이 단계를 수행 하 여 세포질 파편, 죽은 세포, 및 셀 집계 수 주로에서 제외 추가 분석. 제어 프로세스의 그림은 그림 1B에서 제공 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20000 "" (즉, 단일 셀) 당 이벤트 샘플 분석을 선택 합니다. 참고:이 각 샘플에 대 한 미리 정의 된 게이트 내에 있는 20000 셀 결국 분석 될 것 이다 의미 합니다. 각 샘플에 대 한 데이터 수집 이벤트의이 수 분석 될 때까지 계속 됩니다.</li>
	<li>실행 (선택 "레코드 데이터")를 시작 합니다. 교류 cytometry 장치 각 샘플에 대 한 평균 형광 강도 (MFI)을 기록 하 여 지금 모든 샘플 하나 하나를 분석 합니다. 이 MFI 의미 형광 신호에 해당 하는 미리 정의 된 게이트 내에 있는 20000 셀에 해당 합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
각 샘플에 대 한 얻은 MFI를 사용 하 여 모든 추가 계산을 수행 하. 교류 cytometry 데이터의 분석 ( 테이블의 재료 및 시 약참조) 여러 상용 소프트웨어 패키지에서 수행할 수 있습니다.
<ol><li>복합 사전 인큐베이션 결과로 형광 바인딩 신호의 비율 억제를 결정 하려면 다음 수식을 적용. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq1.jpg"> 장소: MFI특급 (= 화합물 취급) 실험의 MFI = 샘플 MFIPC 긍정적인 통제의 MFI를 = MFINC 부정적인 컨트롤의 MFI를 =</li>
	<li>(즉, 50%에 의해 형광 바인딩 신호를 줄일 수 있는 화합물의 농도) 화합물의 IC50 값을 확인 하려면 다음 수식을 적용: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq2.jpg"> 장소: 로그conc.2 = 50% 미만에서 발생 하는 화합물의 농도의 로그 PC와 NC의 MFI 값의 차이의 저해 로그conc.1 = 50% 이상에서 발생 하는 화합물의 농도의 로그 PC와 NC의 MFI 값의 차이의 저해 참고: 또는, 높은 활성 화합물의 경우 규모의 여러 로그를 다루는 복용량 응답 곡선 생성할 수 있습니다 화합물의 각 시험된 농도에 해당 MFI에 기반. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 비선형 회귀 곡선 맞춤을 적용 하 여 (참조 테이블의 재료 및 시 약), IC50 값 다음 생성 된 커브에서 연 역 될 수 있습니다. 이 분석 방법의 예는 그림 3에 표시 됩니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

바인딩 분석 (즉, 채도 바인딩 및 바인딩 운동 실험)의 다른 유형에 비해, 경쟁 의무적인 분석 실험은 심사 목적에 가장 적합. 실제로, 그들은 레이블이 지정 된 수용 체 ligand의 고정 된 금액의 바인딩을 방해 하는 그들의 기능을 채 점 하 여 레이블이 없는 화합물, 예를 들어 작은 분자의 큰 배치의 평가 허용. 레이블이 리간드 보다 다른 수용 체 사이트에 바인딩되는 화합물 분석 결과에 들 키 지 유지 수 있습니다. 비록 경쟁 바인딩 실험 설명 여기에 초점을 맞추고 CXCR4 chemokine 수용 체에 특히, 그것은 아마 뿐만 아니라 다른 GPCRs에 대 한 경쟁 의무적인 분석 실험의 디자인에 대 한 청사진으로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, CXC chemokine 수용 체 7 (CXCR7)은 CXCL12, 높은 선호도29,와 바인딩 CXCL1230의 능력에 대 한 대체 수용 체로 묘사 되었다. 따...

G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)는 세포 표면 단백질 (예를 들면, 펩 티 드, 단백질 호르몬, 아민) extracellular ligands에 의해 활성화 될 수 있는, 많은 생리 적 그리고 발달을 조절 함으로써 처리1. 한 길 항 제는 GPCR 바인딩 주머니 차지 하 고, 수용 체 단백질에 유도 구조적 변화 Gα의 구성 된 세포내 수용 체 관련 된 heterotrimeric G 단백질의 바인딩을 촉진-GDP와 Gβγ 소 단위. Gα 소 단위 결과 G 단백질 소 단위 (Gα-GTP와 Gβγ)를 차례로 추가 시작 하류의 분리에 GDP에 대 한 GTP의 후속 교환 신호 경로2,3. Gα-GTP 분해 된다 때 다시 협회 Gα의 GDP와 Gβγ 소 단위 변환 G 단백질 다시는 휴식 상태3,4. G 단백질의 다른 종류 (Gs, Gi/o, Gq, G12/13), 존재는 Gα 소 단위5시퀀스 유사성에 따라 분류 한다. 모두 이러한 G 단백질 수용 체 활성화에 생물학 응답 기초 정의 된 세포내 신호 통로 유도. 수용 체 활성화 후 GPCR kinases (GRKs) 함으로써 β-arrestins와의 상호 작용을 촉진 하는 GPCRs의 세포내 꼬리 phosphorylate. 이 프로세스는 G 단백질 신호, 수용 체 탈 감 작과 국제화6의 종료에 리드. Β-arrestins는7을 신호 하는 G 단백질의 독립적인 폭포 트리거 신호 다 분자 복합물의 부분 있습니다.
GPCRs는 치료 적 개입에 대 한 가장 유효한 분자 표적 사이 많은의 병 인에 기여 하 고 규제 완화 GPCR 중재 신호, 예를 들면 수용 체 유전자 또는 수용 체 overexpression에 이득의 기능 돌연변이 때문으로 인간의 질병8. 따라서, GPCRs 제약 산업8,,910조사 약물 목표의 가장 중요 한 클래스 중 하나를 나타냅니다. 임상 관련 GPCR의 주목할 만한 보기는 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4) CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)11유일한 자연 리간드에 의해 활성화 될 수 있는 이다. 때문에 인간 면역 결핍 바이러스 1에 대 한 주요 공동 수용 체로 서의 설립된 역할 (HIV-1) 항목 및 클러스터 차별화 4의 (CD4) 긍정적인 T 세포12, CXCR4 항 바이러스 약물 대상으로 조사에 처음에 감염. 더 골에서 CXCL12 CXCR4 상호 작용 조절 유지 그리고 줄기와 뿌리의 유도 세포13. 또한, 암 생물학 (예: 종양 세포 생존, 전이, 종양 관련 신생)14 의 여러 측면에 몇 가지 다른 인간의 질병 (예를 들어, 염증 성 질환)15, CXCR4의 개입을 주어진 약물 발견에 대 한 유망 대상으로 상당한 관심을 발생합니다. AMD3100, 특히 표적으로 CXCR4, 작은 분자 항 HIV 약물 후보16 처음 밝혀졌다 이며 여전히 가장 강력한 CXCR4 길 항 근 날짜17에 설명 중 하나. 그러나 개발으로는 항 바이러스 약물은,,18를 중단. 현재이 분자 다 발성 림프 종 환자18의 치료 중 줄기 세포 동원 에이전트로 사용 됩니다. 다른 여러 가지 화학적으로 관련이 없는 작은 분자와 다양 한 효능 가진 CXCR4 기능을 억제 하는 생물 의약품 설명된19되었습니다.
수용 체 바인딩 메서드는 관심의 GPCR와 직접 상호 작용 하는 화합물 (예를 들어, 작은 분자)의 id를 허용 하는 약리학에 귀중 한 도구입니다. 바인딩 연구를 수행 하기 위해서는 세포내 신호 속성 또는 특정된 GPCR의 기능에 관한 사전 지식에 대 한 필요가 있다. 이 이점을로 간주 될 수 있습니다, 하지만 그것은 화합물 바인딩 설명 될 수 있는 수용 체에 대 한 그들의 잠재적인 agonistic 또는 대립 활동을 평가 하 여 특징 추가 될 필요가 의미. 이 활동은 GPCR 연구에 관련 된 약리학 또는 생물학 분석 실험을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 그들의 작업 프로필에 의존, 수용 체 바인딩 분자 수 있습니다 다음 잠재적으로 진화 될 전 임상 및 임상 연구에 조사에 대 한 소설 리드 화합물. 예를 들어 종양 세포20, 비 침 투 적인 vivo에서 이미징 radiolabeling 여 치료 또는 진단 도구를 생성 하는 건설 기계 또는 잠재력으로 특히 높은 선호도와 수용 체에 묶는 분자도 사용할 수 있습니다. 치료제21의 대상 배달 차량. CXCR4, 경우 종양 세포의 이미징 vivo에서 이미 입증 되었습니다 레이블이 CXCR4 타겟팅 분자 인간 암 xenografts20,22,23의 시각화를 허용 하는 어떤 점에서 마우스 모델을 사용 하 여 .
이 보고서에서 우리는 작은 분자와 방해 하는 직접 길 항 제 (CXCL12) 바인딩 CXCR4 biologics의 식별을 가능 하 게 경쟁 바인딩 분석 결과 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 분석 결과의 기본 원리는 붙일 레이블된 ligand의 고정 된 금액 간의 경쟁 (CXCL12AF647, 참조 테이블의 재료 및 시 약)과 화합물 바인딩 수용 체 단백질17, 에 대 한 레이블 없음 24. 레이블이 ligand CXCR4 표현 하는 단일 셀에 바인딩된에서 특정 형광 신호 다음 cytometry에 의해 분석 됩니다. 이 형광 신호 레이블 없는 작은 분자 CXCL12AF647 와 CXCR4 간의 상호 작용을 방해 하는 경우에 줄어들 것입니다. 분석 결과 endogenously 익스프레스 CXCR4 조작 아닌 살아있는 세포를 사용 하 여 (즉, Jurkat 세포). 따라서, 아무 세포 막 준비는 필요 하 게 분석 결과 편리, 신속 하 고 늘어난된 처리량과 호환. 붙일 레이블된 ligand 사용 되므로 방사능은 피 한다.
분석 결과에서 CXCL12AF647 바인딩을 방해 하는 작은 분자 화합물 (즉, 바인딩 사이트는 자연에 의해 점령 orthosteric 수용 체 바인딩 사이트와 상호 작용을 확률이 CXCL12 CXCR4 위한 자연 길 항 제 이므로 주 작동 근)입니다. 그들은 CXCL12의 바인딩을 좌우 하지 않는다 것 세 orthosteric 바인딩 사이트에서 고유 수용 체 바인딩 사이트와 상호 작용 하는 분자 들 키 지 않고, 남아 있습니다. 예를 들어, 긍정적이 고 부정적인 allosteric 변조기, 분자 allosteric 바인딩 사이트25에 행동을 타겟팅 하는 GPCR의 중요 하 고 신흥 카테고리 것입니다 잠재적으로 하지 주워이 분석 결과 함께. 또한, 수용 체 길 항 제 또는 촉진제로는 화합물이 바인딩 분석 기능으로 식별 여부를 파생 수 없습니다. 추가적인 약리 또는 기능 수용 체 관련 분석 실험에서 확인 된 화합물의 조사 따라서 하셔야 합니다. 이 분석 실험의 (조합) 포함 될 수 있습니다 두 번째 메신저 (예를 들어, 캘리포니아2 +, 순환 아데노신 monophosphate (캠프)), phenotypic의 검출에 대 한 분석 실험 세포 형광 또는 발광 기반 또는 생물학 분석 실험 및 β-arrestin GPCR 연구의 특정 신호 속성에 따라 어떤 선택 채용 분석 실험 따라서, 주로 여기에 설명 된 경쟁 바인딩 분석 결과 초기 심사 분석 결과 수용 체 바인딩 힘으로 화합물의 깊이 특성을 사용 하도록 다른 세포 기반 분석으로 보완 하는 역할을 합니다.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>Becton Dickinson</td><td>해당 사항 없음</td><td>유세포 분석 장치</td></tr><tr><td>BD FACSDIVA 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSArray</td><td>Becton Dickinson</td><td>해당 없음</td><td>유세포 분석 장치</td></tr><tr><td>BD FACSArray 시스템 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td>그림 2 및 그림 3에서 비선형 회귀 분석에 사용되는 소프트웨어 패키지</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo는 현재 BD가 전액 출자한 자회사입니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vi-CELL</td><td>Beckman Coulter</td><td>해당</td><td>없음 세포 생존도 분석기</td></tr><tr><td>Sigma 3-18 KS</td><td>Sigma</td><td>해당 없음</td><td>원심분리기</td></tr><tr><td>AMD3100</td><td>Sigma</td><td>A5602-5mg</td><td>특정 CXCR4 길항제</td></tr><tr><td>Maraviroc</td><td>Pfizer</td><td></td><td>항레트로바이러스 약물, CCR5 길항제, Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)에서 연구 가능</td></tr><tr><td>h-SDF1a (AF647)</td><td>ALMAC</td><td>CAF-11-B-01</td><td>형광 표지 CXCL12, CXCL12AF647</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Gibco(Life Technologies)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1933-25G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS(10x), 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음</td><td>Gibco(Life Technologies)</td><td>14065-049</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(1M)</td><td>Gibco(생명 Technologies)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat cells</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시약 저장소 PP</td><td>Sigma</td><td>BR703411</td><td></td></tr><tr><td>Rapid flow filter: 0.2 &micro; m aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin 마이크로타이터 플레이트, 96-well, U bottom, 투명</td><td>Thermo Scientific</td><td>611U96</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes, 50ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 (T75)</td><td>Corning</td><td>353024</td><td></td></tr></tbody></table>

cxc chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 cxc chemokine ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 cytometry 기반 시험

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)의 약리 타겟팅으로 많은 질병의 진행에 기여 장애 GPCR 중재 신호 인간의 건강에 매우 중요입니다. 수용 체의 ligand 쌍 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4) 암 및 염증 성 질환의 치료에 대 한 잠재적인 대상으로 예를 들어 중요 한 임상 관심을 제기 하고있다. 특히 CXCR4 대상 및 수용 체의 기능을 억제 하는 치료 항 체로 서 작은 분자 약리학 유용한 도구 간주 됩니다 따라서. 여기, 흐름 cytometry 기반 셀룰러 분석 결과 CXCL12 바인딩을 CXCR4, 파기 화합물 (예를 들어, 작은 분자) 수 있도록 설명 되어 있습니다. 기본적으로, 분석 결과 붙일 레이블된 CXCL12, CXCR4, 자연 chemokine 주 작동 근의 고정 된 금액 및 레이블이 없는 화합물 사이의 바인딩 수용 체에 대 한 경쟁에 의존 합니다. 따라서, 방사성 레이블이 프로브를 사용 하 여 바람직하지이 분석 결과에 피 한다. 또한, 살아있는 세포 수용 체 (CXCR4) 세포 막 준비 대신의 원본으로 사용 됩니다. 처리량을 증가 플레이트 형식으로 분석 결과의 쉬운 적응 수 있습니다. 이 분석 결과 CXCR4 대상 화합물을 식별 하 귀중 한 제네릭 약물 발견 분석 결과 되도록 표시 되었습니다. 프로토콜 가능성이 적용할 수 있습니다 다른 GPCRs에 적어도 붙일 레이블된 ligands 사용할 수 있습니다 또는 생성 될 수 있습니다. 이러한 GPCRs의 활성화 유도 된 세포내 신호 통로 관한 사전 지식이 필요 하지 않습니다.

바인딩 분석 결과의 일반적인 워크플로 그림 1A에 제공 됩니다. 다른 샘플 형식 (즉, 부정적인 컨트롤, 긍정적인 제어 및 실험 샘플) 표준 실험에 대 한 얻은 흐름 cytometry 데이터 유형의 그림은 묘사 그림 1B을 가능한 접시 레이아웃을 수행 하 96 잘 접시 형태로 분석 결과 그림 1C에서 주어진 다. Endogenously 익스프레스 chemokine 수용 체 CXCR4 Jurkat 세포의 외피 (즉, 이 분석 결과에 대 한 관심의 GPCR), 붙일 레이블된 CXCL12 양의 증가 함께 (즉, CXCL12AF647)으로 발생 증가 형광 (그림 2), ligand 바인딩 CXCR4의...

한 흐름 cytometry 기반 셀룰러 바인딩 분석 결과 설명 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)에 붙일 레이블된 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)의 바인딩을 억제 하는 화합물을 식별 하는 검사 도구로 주로 사용 되는.

CXC Chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 CXC Chemokine Ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 Cytometry 기반 시험

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

세포 기반 분석의 전반적인 목표는 G 단백질 결합 수용체에 결합하는 분자를 식별하는 것입니다. 수용체에 결합하기 위해 형광 표지된 리간드와 경쟁할 수 있는 능력을 기반으로 합니다. 경쟁 결합 분석은 G-단백질 결합 수용체 약물 발견을 지원할 수 있습니다.케모카인 수용체인 CXC4에 대한 이 프로토콜로 입증할 것입니다. 이 방법의 주요 장점은 기억 준비 대신 살아있는 세포를 사용하여 수용 결합을 분석한다는 것입니다. 그리고 방사능 라벨 프로브의 사용을 피합니다.이 방법은 초기에 케모카인 수용체 CXCR4에 대한 결합을 연구하기 위해 설정되었지만, 형광 표지 리간드가 존재하는 다른 GPCR에 대해서도 개발할 수 있습니다. 시작하려면 사전 정의된 실험 레이아웃에 따라 100마이크로리터의 화합물 용액을 투명한 96개의 잘 둥근 바닥 플레이트에 분배합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 시약 저장소에서 50마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 추가합니다.어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 유사한 시약 저장소에서 96 웰 플레이트의 웰에 50마이크로리터의 형광 표지된 100나노그램 CXCL12를 추가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.다음으로, 96웰 플레이트를 실온에서 5분 동안 400배 중력으로 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 펠릿화된 세포에서 상등액을 제거합니다. 티슈에 접시를 말리십시오.다중 채널 피펫을 사용하여 시약 저장소에서 200마이크로리터의 새로운 SA 완충액을 웰로 추가합니다. 즉시 실온에서 중력의 400배에서 5분 동안 플레이트를 다시 원심분리하십시오. 다시 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거한 다음 티슈에서 건조시킵니다.마지막으로, PBS에 용해된 200%파라포름알데히드 1마이크로리터에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 이 단계는 셀을 수정합니다. 유세포 분석으로 샘플을 분석하려면 장치를 시작하고 해당 소프트웨어를 엽니다.시각화할 세포 파라미터를 도트 블록 형식으로, 전방 산란 영역, 측면 산란 영역, 히스토그램 보기에서는 fluoro four 검출 채널로 선택합니다. 하나의 샘플을 선택합니다. 예를 들어, negative control sample은 forward scatter 및 side scatter 매개변수를 기반으로 정의된 동질적인 세포 집단의 게이팅을 수행합니다.세포를 유세포 분석 장치에 로드하기 위한 설정을 조정합니다. 주입 전에 세 가지 혼합물을 선택합니다. 100마이크로리터의 고정 셀의 자동 주입을 선택하고 초당 1.5마이크로리터의 샘플 유속을 사용합니다.데이터 획득을 선택하여 샘플을 실행합니다. 이 샘플에 대한 전방 산란 및 측면 산란 매개변수와 fluoro four 검출이 이제 화면에 나타납니다. 이제 소프트웨어 게이팅 도구를 선택하십시오.전방 산란 및 측면 산란 점도 시각화를 기반으로 게이팅을 통해 균질하고 생존 가능한 세포 집단을 미리 정의합니다. 샘플당 20, 000개의 이벤트를 분석하려면 선택합니다. 이것은 각 샘플에 대해 사전 정의된 게이트 내에 있는 20, 000개의 세포가 결국 분석된다는 것을 의미합니다.데이터 수집은 이 이벤트 수에 도달할 때까지 계속됩니다. 먼저 분석할 웰을 선택하여 실행을 시작합니다. 그런 다음 런 웰을 선택합니다.유세포 분석 장치는 이제 각 샘플의 평균 형광 강도를 기록하여 이러한 샘플을 하나씩 분석합니다. 사전 정의된 게이트 내에 있는 20, 000개의 세포에서 평균 형광 신호에 해당합니다. 마지막으로 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 수행합니다.고농도의 AMD3100, 확립되지 않은 특이적 CXCR4 길항제를 가진 jurkat 세포의 사전 배양 후. 표지된 CXCL12의 결합을 반영하는 평균 형광 강도는 거의 완전히 배경 수준으로 감소합니다. 이는 jurkat 세포에서 발현된 CXCR4에 대한 CXCL12의 매우 특이적인 결합을 보여줍니다.CCR5 길항제 Maraviroc과 같이 CXCR4 수용체에서 결합하기 위해 표지된 CXCL12와 경쟁할 수 없는 화합물은 평균 형광 강도에 영향을 미치지 않습니다. 대조적으로, 고활성 화합물은 용량 의존적 방식으로 이를 수행합니다. 동영상을 시청한 후에는 살아있는 세포와 유세포 분석을 사용하여 경쟁 수용 결합 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

a-flow-cytometry-based-assay-to-identify-compounds-that-disrupt

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유전 공학 또는 큰 샘플 크기를 요구하지 않고, 고유의 단백질 - 단백질 상호 작용의 구분, 강력하고, 생화학 평가를 허용하는 IP - FCM 방식은 제공됩니다.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

이 비디오에서는 CXCR4를 표적으로 하는 소분자가 존재할 때 CXC Chemokine Receptor 4(CXCR4)와 형광 표지된 천연 리간드 CXC Chemokine Ligand 12(CXCL12) 사이의 상호 작용을 검출하기 위한 유세포 분석 기반 경쟁 결합 분석에 대해 설명합니다. 더 낮은 소분자 농도를 가진 CXCR4 발현 세포를 배양하는 것은 소분자 농도에 있는 점차적인 증가에 점차적으로 감소하는 CXCR4-CXCL12 결합을 어느 정도 허용합니다.

수용체-리간드 상호작용을 방해하는 화합물을 식별하기 위한 경쟁력 있는 결합 분석

이 비디오는 CXCR4 케모카인 수용체를 발현하는 교모세포종 세포와 관련된 세포 분석을 보여줍니다. 이 분석은 칼슘에 민감한 염료를 사용하여 제제 상호 작용에 따른 형광 변화를 측정하여 세포 신호 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.

CXCR4 상호 작용 제제의 식별을 위한 세포 분석

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

설명된 세포 분석 결과 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 식별을 위해 설계 되었습니다-상호 작용 하거나 에이전트는 억제 자극, 경쟁적으로 또는 allosterically, 세포내 캘리포니아2 + 릴리스 CXCR4 활성화에 의해 시작.

운동 형광 기반 Ca2 + 동원 분석 결과 G 단백질 결합 된 수용 체 주 작동 근, 길 항 근, 그리고 Allosteric 변조기를 식별 하

Cytometry 이미징 개인과 populational 수준에서 세포의 형태학 적 및 기능적 변경 감지 하는 이상적인 접근을 제공 합니다. 오염 물질에 노출 된 인간의 수지상 세포에 지질 항 원 프레 젠 테이 션에 대 한 방해 endocytic 기능 유전자 발현 및 단백질 매매의 형태학 데모의 프로 파일링 결합된 transcriptomic 시연 했다.

통합 이미징 Cytometry Transcriptomic 변경된 Endocytic CD1d 매매 평가 하 프로 파일링

이 종이 저 해제 및 T 세포 수용 체 신호에 영향을 주는 그들의 목표의 확인에 대 한 화학 억제제의 스크린 라이브러리에 교류 cytometry 기반 분석 결과 사용 합니다. 여기서 설명 하는 방법 또한 높은 처리량 검사에 대 한 확장할 수 있습니다.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

항암 앱타머 개발에 필요한 단계는 표적에 대한 결합을 테스트하는 것입니다. 우리는 이 결합을 연구하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 시연하며, 특정 단백질에 대해 음성 대조군 압타머와 양성 또는 음성 암세포를 포함하는 것의 중요성을 강조합니다.

항암 압타머의 선택성 및 특이성을 평가하기 위한 유세포분석 기반 세포 표면 단백질 결합 분석

이 프로토콜은 인간 호중구에서 β2 인테그린 활성화를 억제하는 저분자 약물을 식별하기 위한 유세포 분석 기반의 고처리량 스크리닝 방법을 설명합니다.

인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

배우세요 CXCL12와 CXCR4 결합을 억제하는 화합물을 식별하는 유세포 분석 기반 세포 결합 분석법을 활용한 G단백질 연결 수용체 약물 발굴 방법을. 방사성 표지 없이 살아있는 세포를 사용하여 정확한 수용체 결합 분석이 가능합니다.

CXC Chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 CXC Chemokine Ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 Cytometry 기반 시험

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