CXC Chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 CXC Chemokine Ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 Cytometry 기반 시험

세포 기반 분석의 전반적인 목표는 G 단백질 결합 수용체에 결합하는 분자를 식별하는 것입니다. 수용체에 결합하기 위해 형광 표지된 리간드와 경쟁할 수 있는 능력을 기반으로 합니다. 경쟁 결합 분석은 G-단백질 결합 수용체 약물 발견을 지원할 수 있습니다.

케모카인 수용체인 CXC4에 대한 이 프로토콜로 입증할 것입니다. 이 방법의 주요 장점은 기억 준비 대신 살아있는 세포를 사용하여 수용 결합을 분석한다는 것입니다. 그리고 방사능 라벨 프로브의 사용을 피합니다.

이 방법은 초기에 케모카인 수용체 CXCR4에 대한 결합을 연구하기 위해 설정되었지만, 형광 표지 리간드가 존재하는 다른 GPCR에 대해서도 개발할 수 있습니다. 시작하려면 사전 정의된 실험 레이아웃에 따라 100마이크로리터의 화합물 용액을 투명한 96개의 잘 둥근 바닥 플레이트에 분배합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 시약 저장소에서 50마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 추가합니다.

어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 유사한 시약 저장소에서 96 웰 플레이트의 웰에 50마이크로리터의 형광 표지된 100나노그램 CXCL12를 추가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 96웰 플레이트를 실온에서 5분 동안 400배 중력으로 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 펠릿화된 세포에서 상등액을 제거합니다. 티슈에 접시를 말리십시오.

다중 채널 피펫을 사용하여 시약 저장소에서 200마이크로리터의 새로운 SA 완충액을 웰로 추가합니다. 즉시 실온에서 중력의 400배에서 5분 동안 플레이트를 다시 원심분리하십시오. 다시 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거한 다음 티슈에서 건조시킵니다.

마지막으로, PBS에 용해된 200%파라포름알데히드 1마이크로리터에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 이 단계는 셀을 수정합니다. 유세포 분석으로 샘플을 분석하려면 장치를 시작하고 해당 소프트웨어를 엽니다.

시각화할 세포 파라미터를 도트 블록 형식으로, 전방 산란 영역, 측면 산란 영역, 히스토그램 보기에서는 fluoro four 검출 채널로 선택합니다. 하나의 샘플을 선택합니다. 예를 들어, negative control sample은 forward scatter 및 side scatter 매개변수를 기반으로 정의된 동질적인 세포 집단의 게이팅을 수행합니다.

세포를 유세포 분석 장치에 로드하기 위한 설정을 조정합니다. 주입 전에 세 가지 혼합물을 선택합니다. 100마이크로리터의 고정 셀의 자동 주입을 선택하고 초당 1.5마이크로리터의 샘플 유속을 사용합니다.

데이터 획득을 선택하여 샘플을 실행합니다. 이 샘플에 대한 전방 산란 및 측면 산란 매개변수와 fluoro four 검출이 이제 화면에 나타납니다. 이제 소프트웨어 게이팅 도구를 선택하십시오.

전방 산란 및 측면 산란 점도 시각화를 기반으로 게이팅을 통해 균질하고 생존 가능한 세포 집단을 미리 정의합니다. 샘플당 20, 000개의 이벤트를 분석하려면 선택합니다. 이것은 각 샘플에 대해 사전 정의된 게이트 내에 있는 20, 000개의 세포가 결국 분석된다는 것을 의미합니다.

데이터 수집은 이 이벤트 수에 도달할 때까지 계속됩니다. 먼저 분석할 웰을 선택하여 실행을 시작합니다. 그런 다음 런 웰을 선택합니다.

유세포 분석 장치는 이제 각 샘플의 평균 형광 강도를 기록하여 이러한 샘플을 하나씩 분석합니다. 사전 정의된 게이트 내에 있는 20, 000개의 세포에서 평균 형광 신호에 해당합니다. 마지막으로 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 수행합니다.

고농도의 AMD3100, 확립되지 않은 특이적 CXCR4 길항제를 가진 jurkat 세포의 사전 배양 후. 표지된 CXCL12의 결합을 반영하는 평균 형광 강도는 거의 완전히 배경 수준으로 감소합니다. 이는 jurkat 세포에서 발현된 CXCR4에 대한 CXCL12의 매우 특이적인 결합을 보여줍니다.

CCR5 길항제 Maraviroc과 같이 CXCR4 수용체에서 결합하기 위해 표지된 CXCL12와 경쟁할 수 없는 화합물은 평균 형광 강도에 영향을 미치지 않습니다. 대조적으로, 고활성 화합물은 용량 의존적 방식으로 이를 수행합니다. 동영상을 시청한 후에는 살아있는 세포와 유세포 분석을 사용하여 경쟁 수용 결합 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.