Name: Vancomycin 치료 로드 칼슘 염 및 뼈 감염의 향상 된 토끼 모델에서 자생 뼈 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 배우세요 토끼 뼈 감염 모델에서 반코마이신 로드 칼슘 염과 자생 뼈를 이용한 치료법을 통한 뼈 재생 메커니즘 연구 방법을. 이 기법은 뼈 감염 병태생리 이해와 골유합증 치료에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81803808, 81873062), 절 강 지방 의료 및 건강 과학 및 기술 기금 (2017KY271)는 과학 및 기술 프로젝트의 강성 (2017C 37181)에 의해 지원 되었다.

현재 연구에 사용 된 토끼는 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 취급 했다. 모든 실험 절차 규칙의 생명 윤리 위원회의 절 강 아카데미의 전통 중국 의학 순 이었다.
1입니다. 세균 현 탁 액의 준비
<ol><li>S. 구 균 동결 분말 (ATCC 6538)와 Luria Bertani 문화 매체의 0.3 mL의 0.5 mg을 디졸브. 완전히 정지를 혼합.</li>
	<li>줄무늬가 tryptic 간장 한 천 격판덮개에 박테리아 중단 하 고 16 h 37 ° C에서 세균성 식민지를 품 어.</li>
	<li>단일 세균성 식민지 형성 단위 (CFU)과 tryptic 간장 국물 관 24 h. 수행 37 ° C에서 약 24 h에 대 한 하위 문화를 선택 하 고 얻을 중반 대 수 성장 단계 박테리아 후 16 ~ 18 h, 광학 밀도 (OD) 값이 600에서 0.6 nm 14.</li>
	<li>원심 분리기 튜브로 박테리아 서 스 펜 션의 1 mL를 전송 합니다. 825 x g 와 4 ° C에서 5 분 동안 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한. Resuspend 및 버퍼링 하는 인산 염 (PBS);의 100 µ L로 박테리아를 씻어 3 번이이 단계를 반복 합니다. 마지막으로, PBS의 3 mL와 박테리아 resuspend.</li>
	<li>
맥 팔 랜드의 turbidimetry15를 사용 하 여 박테리아 농도 견적 한다.
	<ol>
<li>탁도 0.5 맥 팔 랜드 표준에 해당 될 때까지 100 ~ 500 µ L 세균 현 탁 액의 색도계 튜브를 전송 합니다.</li>
		<li>박테리아의 콘텐츠는 약 10에 도달 하면 0.5 맥 팔 랜드에 시각적인 비교 하 여 탁도 평가8 CFU/mL. 참고: 박테리아 서 스 펜 션의 볼륨은 다음 프로토콜에 대 한 충분 한 다는 것을 확인 하십시오. 모든 토끼 박테리아 서 스 펜 션의 볼륨 1 mL 미만입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>한 천 배지 세균 현 탁 액의 0.2 mL를 전송 하 고 그것을 균등 하 게 적용. 박테리아 식민지 박테리아 서 스 펜 션의 CFU를 확인 하려면 16 헤 수 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
</ol>2입니다. 뼈 감염 모델의 준비
<ol><li>남성 뉴질랜드 백색 토끼, 세 공기 제어 조건 (20 ± 1 ° C) 및 12 h/12 h 빛 어두운 조명 사이클에서 개별 장에 3 개월 유지. 일상적인 식단을 제공 하 고 매일 수돗물.</li>
	<li>되도록 수술의 때에 토끼 3 kg 이상의 무게.</li>
	<li>Pentobarbital 나트륨 (체중 100 g 당 3 밀리 그램)와 복 주사로 토끼를 anaesthetize. 토끼는 발 핀치에 응답 하는 실패에 의해 anesthetized 완전히 다는 것을 확인 하십시오. 작업 절차 동안 운영 테이블에 토끼를 수정. 참고: 되도록 모델링 절차 기간은 1 시간 미만.</li>
	<li>머리 성장의 방향에 대 한 전기 면도기를 사용 하 여 근 위 경골 영역을 면도. Povidone-요오드 솔루션을 적용 하 여 피부를 소독.</li>
	<li>펜 및 통치자 S. 구 균 (경골의 위쪽 끝 까지의 거리는 1.5 cm)로 분사에 대 한 드릴링 구멍 위치와 경골의 위쪽 끝을 표시 합니다. 드릴링 구멍 위치는 tibial 고원 중간 수평 다는 것을 확인 (그림 1A).</li>
	<li>11 호 메스를 사용 하 여 경골 피부를 잘라내어 (그림 1B, C)과에 1 cm 절 개를 하 게. 전기 뼈 드릴 단위 (그림 1D)를 사용 하 여 경골에 2 m m 직경 구멍 펀치.</li>
	<li>2mm 직경 및 높이 2 m m (그림 1E)의 뼈 왁 스의 실린더와 tibial 고원에서 2 m m 직경 구멍을 누릅니다. (그림 1F) tibial 고원의 수평 평면 여분의 뼈 왁 스를 제거 합니다. 2 m m 구멍 뼈 왁 스 (그림 1G)의 가득 차 있는지 확인 합니다. 참고: 또는 혈액 오버플로 없이 구멍을 선택 하 여 구멍 뼈 왁 스의 전체 인지 확인 합니다.</li>
	<li>과을 꿰 매십시오와 씹는 봉합 (그림 1H)에서 동물을 방지 하기 위해 수직 매트리스 봉합에 흡수 되기 쉬운 외과 봉합 사를 피부.</li>
	<li>(그림 1나) 1 mL 무 균 상태 인젝터와 1 x 108 미 균 솔루션 (체중 100 g 당 30 µ L)의 CFU/mL를 주사. 바늘 뼈 왁 스를 관통 하 고 주입 S. 구 균 솔루션 골 천천히 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>모델링 후 열 손실을 피하기 위해 따뜻하고 깨끗 한 상황에서 동물을 유지. 호흡 속도 심장 박동을 모니터링 합니다. 일어나, 후 음식과 물에 대 한 무료 액세스와 개별 장에 토끼 집.</li>
</ol>3입니다. 뼈 감염 모델의 평가
<ol><li>7, 14, 21, 감염 후 28 일, 토끼 토끼 위해 머리와 귀를 위해 밖으로 장소.</li>
	<li>
Dipotassium ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA-K2) 항 응 혈 약 혈액 용기에 귀의 정 맥에서 혈액의 2 개 mL를 그립니다. 혈액 용기에 혈관에서 혈액의 1 mL를 그립니다. 실 온에서 651 x g 의 속도와 10 분 동안 혈 청 원심
	<ol>
<li>C-반응성 단백질 (CRP)에 의해 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 방법16및 혈액 생화학 분석기를 사용 하 여 전체 혈액에서 백혈구 (WBC)을 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>7, 14, 21, 감염 후 28 일, 한 모델 토끼 pentobarbital 나트륨 100 g 체중 당 3 밀리 그램의 복용량에서 anaesthetize. 11 호 메스를 사용 하 여 경골 피부 고과 (그림 2A)에서 2 cm 절 개를 하 게.</li>
	<li>본 왁 스 청소. 전기 뼈 드릴 단위 (그림 2B)를 사용 하 여 두 개의 인접 한 4.8 m m 직경 구멍을 펀칭으로 회 저 성 뼈를 debride. Debride 회 저 성 골 수 및 알갱이 만듦 조직 뼈 숟가락 (그림 2C)를 사용 하 여. 참고: 골 수에 남아 있는 뼈 조직을 피하려고 debridement 동안 뼈 조직을 청소.</li>
	<li>긁 고 두 구멍 (그림 2D) 사이의 뼈 조직의 청소.</li>
	<li>양 혈액 한 천 배지 위에 골의 1 mL를 확산. 37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어 30-300 식민지의 접시를 선택 하 고 식민지의 수를 계산 합니다.</li>
	<li>감염 후 28 하루의 끝에, 무릎 및 발목 관절의 가장자리를 따라 경골 표본 추출. 수정 24 h. Decalcify에 대 한 4 %paraformaldehyde 경골 표본 경골 표본 10 %EDTA 8 주 동안.</li>
	<li>에탄올 희석의 등급된 시리즈에 경골 표본 탈수 하 고 후 파라핀 왁 스에 포함. 코로나 비행기에서 4 연속 5 µ m 단면을 잘라. 섹션 장비로 hematoxylin과 오신 (H & E) 얼룩 얼룩.</li>
	<li>현미경을 사용 하 여 스테인드 섹션 보기와 기록 표준 소프트웨어로 가벼운 이미지를 전송.</li>
</ol>4입니다. VCS 구슬의 준비
<ol><li>의료 학년 칼슘 염의 9.5 g vancomycin 염 산 염 분말 1 g을 추가 하 고 혼합된 힘에 정상적인 염 분의 3 mL를 추가 합니다. 믹스 그들을 철저 하 게 30-45에 대 한 주걱으로 s.</li>
	<li>유연한 실리 카 젤 금형 (4.8 m m 직경 4.8 m m 높이의 실린더), 혼합된 제품을 놓고 금형을 flexing 하 여 VCS 비즈를 제거 하는 15 분 동안 실 온에서 건조 합니다.</li>
</ol>5. 항생제 치료 및 자생 뼈의 이식
<ol><li>감염 후 28일 하루에 체중 100 g 당 3 밀리 그램의 복용량에서 pentobarbital 나트륨과 모델 토끼를 anaesthetize. 면도 전기 면도기를 사용 하 여 근 위 경골 지역. Povidone-요오드 솔루션을 적용 하 여 피부를 소독. 참고: 모델링 절차 1 시간 미만 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>면도 전기 면도기를 사용 하 여 꼬리 영역 고 povidone-요오드 솔루션을 적용 하 여 꼬리를 소독.</li>
	<li>수술가 위를 사용 하 여 꼬리를 줄이려고. 11 호 메스를 사용 하 여 꼬리 피부를 잘라내어 꼬리 뼈를 공개. 흡수 수술 봉합은 봉합을 씹는에서 동물을 방지 하기 위해 수직 매트리스 봉합 꼬리 지역에서 피부를 바느질.</li>
	<li>모든 근육, 연 조직 및과 제거 합니다. 각 합동에 꼬리 뼈를 분리 하 고 메 마른 염 분을 포함 하는 100 m m 플라스틱 접시 뼈 조각을 전송.</li>
	<li>곡선된 핀셋 (그림 2E)를 사용 하 여 골 수 구멍에 VCS 구슬 (4.8 m m 직경 및 높이 4.8 m m, 구슬의 조각 당 1.25 mg vancomycin의 실린더)의 4 개를 이식.</li>
	<li>뼈 결함을 채우기 자생 뼈의 8 조각으로 핀셋 (그림 2E) 곡선 (2 mm 직경 및 각 작품 당 4 m m 높이의 실린더)를 사용 하 여.</li>
	<li>과을 꿰 매십시오와 매트리스 봉합 방식 (그림 2F) 흡수 수술 봉합 피부. 참고: 수술 하는 동안 25 ° C에 온도 유지.</li>
	<li>수술 후 열 손실을 피하기 위해 따뜻하고 깨끗 한 상황에서 동물을 유지. 호흡 속도 심장 박동을 모니터링 합니다. 일어나, 후 음식과 물에 대 한 무료 액세스와 개별 장에 토끼 집.</li>
</ol>6입니다. 항생제 활동의 평가
<ol><li>토끼 해결사에 토끼를 넣고 2, 4, 6, 8 주 치료 후에 머리와 귀를 위해 외부 장소.</li>
	<li>K2 EDTA 항 응 혈 약 혈관과 귀의 정 맥에서 혈액을 그립니다. 혈액 용기에 혈관에서 혈액의 1 mL를 그립니다. 실 온에서 651 x g 의 속도와 10 분 동안 혈 청 원심</li>
	<li>ELISA 방법16혈액 생화학 분석기와 C-반응성 단백질 (CRP)를 사용 하 여 전체 혈액에는 백혈구 (WBC)를 결정 합니다.</li>
</ol>7입니다. 뼈 재생의 평가
<ol><li>이상으로 주입 하 여 토끼를 안락사 pentobarbital 나트륨, 8 또는 12 주 치료 후의 끝의 복용량.</li>
	<li>무릎과 발목 관절의 가장자리를 따라 경골 표본 추출. 근육과 fascial 레이어 debride.</li>
	<li>마이크로 계산 된 단층 촬영 (마이크로 CT)를 사용 하 여 경골의 구조를 분석 합니다. 선택 타원형 지역 4.8 m m 직경 9.6 m m 만큼 관심 (ROI)의 지역. 비트맵 데이터를 사용 하 여 3D 모델 이미지를 재구성 합니다.</li>
	<li>뼈 볼륨/조직 볼륨 (BV/TV), 배수 두께 (Tb.Th)의 비율의 점수를 선택 trabecula 번호 (Tb.N)와 배수 분리 (뼈 재생을 평가 하기 위해 Tb.Sp)from the3D 모델.</li>
</ol>

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</ol>

저자는이 작품에 관심의 없습니다 충돌 보고합니다.

이전 연구에서 다양 한 종류의 동물 모델 둘 다 급성과 만성 뼈 감염; 공부 건설 되었다 그러나, 이상적인 모델에 대 한 검색은 여전히17,18을 지속합니다. 또한, 이상적인 뼈 감염 모델 예상 시뮬레이션 모델링 기간 동안 임상 설정에서 뼈 감염의 병 적인 특성, 유지 수행 하기 쉽고 저렴 한 비용. 지금까지, 토끼 뼈 감염 모델은 염증 성 뼈 질병 연구에 가장 일반적인 모델으로 토끼 사용할 수 있고, 가능한 저렴 한. 우리의 이전 연구에서 우리는 사망률 및 다양 한 몸 무게와 토끼의 감염 속도 비교. 체중 3 kg 이상; 해야 했다 결과 그렇지 않으면, 있을 것입니다 높은 사망률 또는 haematosepsis 및 더 높은 사망 율의 발생률이 높은 수술 후.
이전 연구와는 달리 토끼 뼈 감염 모델 및 우리의 연구에서 항생제 치료는 인간의 질병과 수술 치료의 병 적인 특성으로 ...

뼈 감염 세균 이나 다른 미생물 침입 후 외상, 뼈 골절, 또는 다른 뼈 질환1에서 일반적으로 유래한 다. 뼈 감염 염증 및 뼈 조직 파괴의 높은 수준의 유도 수 있습니다. 클리닉, 황색 포도상구균 (S. 구 균)에서는 뼈 감염2,3의 주된 원인이 에이전트입니다. 뼈 감염 고통, 쇠 약, 그리고 종종 매우4치료 하기 어려운 만성 과정을 걸립니다. 현재, 회 저 성 직물의 debridement 그리고 vancomycin 로드 칼슘 (VCS) 구슬의 이식 로컬 감염5,6를 제어 하기 위한 효율적인 전략으로 확인 되었습니다 있다. 그러나, 10% ~ 15%의 환자는 항 감염 치료7후 장기간된 뼈 복구 프로세스, 지연된 연합, 또는 비-연합을 경험. 뼈의 결함의 큰 세그먼트는 정형 외과 대 한 가장 어려운 문제입니다. 자가 뼈 이식 뼈 비 조합 치료8,9에 최적의 뼈 대체를 간주 됩니다.
날짜 하려면, 뼈에 대 한 연구의 대부분 감염 및 자가 뼈 이식 동물 모델, 쥐, 토끼, 개, 돼지 및 양10,11의 다양 한 종류에서 실시 되었습니다. 토끼 모델으로 뼈 감염 연구, 가장 많이 사용 되 첫번째 197012,13Norden와 케네디에 의해 수행. 우리의 이전 연구에서 우리 Norden의 방법을, 토끼 모델을 사용 하 고 우리는 S. 구 균 골 수 주입의 수량 수 없습니다 측정할 수 정확 하 게,로 골 수에서 혈액 새 박테리아 솔루션 오버플로 발견.
이 문서에 토끼 뼈 감염 유도 대 한 향상 된 수술 방법을 제공 합니다. 프로시저의 끝에, 혈액 생화학 검사, 세균 검사 및 조직 검사는 뼈 감염 모델을 확인 하려면 수행 했다. 그리고, VCS, 감염을 억제 하기 위해 이식 했다 자생 뼈 뼈 재생 촉진 이식 했다.

<table><tbody><tr><td>흡수성 외과 봉합사</td><td>Jinghuan</td><td>18S0604A</td><td></td></tr><tr><td>무균 인젝터</td><td>Jinglong</td><td>20170501</td><td></td></tr><tr><td>뼈 왁스</td><td>ETHICON</td><td>JH5CQLM</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>올림푸스</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-K2 항응고제 혈관</td><td>XINGE</td><td>20170802</td><td></td></tr><tr><td>전기 뼈 드릴 유닛</td><td>Bao Kang</td><td>BKZ-1</td><td></td></tr><tr><td>전기 면도기</td><td>Codos</td><td>3800</td><td></td></tr><tr><td>유연한 실리카 겔 몰드&nbsp;</td><td>WRIGHT</td><td>1527745</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin 및 Eosin 염색 키트</td><td>Beyotime</td><td>20170523</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani 배양 매체</td><td>Baisi Biothchnology</td><td>20170306</td><td></td></tr><tr><td>의료용 칼슘 황산염</td><td>WRIGHT</td><td>1527745</td><td></td></tr><tr><td>마이크로컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT)</td><td>Bruker</td><td>SkyScan 1172&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>CX41</td><td></td></tr><tr><td>뉴질랜드 흰 토끼</td><td>Zhejiang Experimental Animal Center&nbsp;</td><td>SCXK 2014-0047</td><td></td></tr><tr><td>No. 11 메스&nbsp;</td><td>Yuanlikang</td><td>20170604</td><td></td></tr><tr><td>생리식염수</td><td>Mingsheng</td><td>20170903</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PBS TBD(Jingyi)</td><td>20170703-0592</td><td></td></tr><tr><td>펜토바르비탈 나트륨</td><td>Merk</td><td>2070124</td><td></td></tr><tr><td>포비돈-요오드 용액</td><td>Lierkang</td><td>20170114</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus 동결 건조 분말</td><td>중국 일반 미생물 문화 수집 센터</td><td>ATCC 6538</td><td></td></tr><tr><td>양 혈액 한천</td><td>HuanKai 미생물 3103210</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트립 간장 한천 플레이트</td><td>HuanKai 미생물</td><td>3105697</td><td></td></tr><tr><td>트립 콩 국물 튜브</td><td>HuanKai 미생물</td><td>3104260</td><td></td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td>Lilly</td><td>C599180</td><td></td></tr></tbody></table>

vancomycin 치료 로드 칼슘 염 및 뼈 감염의 향상 된 토끼 모델에서 자생 뼈

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection

뼈 감염 임상, 정형 외과, 외상 외과에 치료 하기가 매우 세균성 내 습에서 유래한 다. 뼈 감염 도왔습니다, 지속적인 염증과 최종 뼈 비 조합 될 수 있습니다. 가능한, 재생 가능한 동물 모델의 설립은 뼈 감염 연구 및 항생제 치료에 중요 합니다. Vivo에서 모델로 서 토끼 모델은 뼈 감염 연구에서 널리 이용 된다. 그러나, 토끼에 대 한 이전 연구 뼈 감염 모델 박테리아의 양을 변수 되면서 감염 상태 일치 하지 했다. 이 연구는 골 수에서 박테리아를 차단 하 여, 토끼에 뼈 감염을 유도 하는 향상 된 수술 방법을 선물 한다. 다음, 다단계 평가 모델링 방법 확인 하 실행 될 수 있습니다.
일반적으로 debriding 괴 사 성 조직 및 vancomycin 로드 칼슘 염 (VCS)의 주입은 항생제 치료에 우세. VCS에 칼슘 염 혜택 크롤링 osteocyte와 새로운 뼈 성장, 비록 대규모 뼈 결함 debriding 후 발생 합니다. 자생 뼈 (AB)은 후에 회 저 성 뼈 debriding 대규모 뼈 결함의 치료에 대 한 뼈 결함을 극복 하는 매력적인 전략 이다.
이 연구에서 우리는 자생 뼈 이식 뼈 결함으로 꼬리 뼈를 사용. 뼈 수리 동물 희생 후 마이크로--단층 촬영 (마이크로 CT) 및 조직학 분석을 사용 하 여 측정 했다. 그 결과, VCS 그룹에서 뼈 비-연합 지속적으로 얻은 했다. 대조적으로, 뼈 결함 영역 VCS AB 그룹에서 크게 감소 했다. 현재 모델링 방법 뼈 감염 모델을 준비 하는 재현, 실현, 안정적인 방법 설명. VCS AB 치료 항생제 치료 후 낮은 뼈 연방 비 비율에 있는 결과. 향상 된 뼈 감염 모델 및 VCS와 자생 뼈의 조합 치료 뼈 감염 뼈 재생 관련 학 정형 응용 프로그램의 기본 메커니즘을 공부 하는 데 도움이 수 있습니다.

뼈 감염 모델의 평가 S. 구 균감염, 후 토끼의 병 적인 발현 클리닉에서 만성 도왔습니다의 대표적인 증상에 유사 했다. 우리의 연구에서 30 토끼 했다 감염, 모델 그룹, 대상 및 10 토끼 제어 동물으로 복종 되었다. 모든 모델 토끼는 sinuses(그림 3)에서 흐름 흰색과 노란색 고름으로 경골 로컬 사이트의 sinuses 감염. H & E 염색의 결과 세균성 집계 모델 그룹에서 죽은 뼈 주위에 있는 정상적인 osteocytes 식별할 수 없는 나타냅니다. CRP와 WBC의 수준을 모델 그룹에서 제어 그룹 (그림 3B) 보다 높다. 회 저 성 골 lysates 모델 그룹에 대 한 식민지의 수를 증가 (그림 3</...

이 연구는 향상 된 토끼 선물 모델 같은 양의 골 수에서 박테리아를 차단 하 여 황색 포도상구균 에 감염. Vancomycin 로드 칼슘 염 및 자생 뼈 항생제와 뼈 복구 처리를 위해 사용 됩니다. 프로토콜 뼈 감염 및 재생을 공부에 대 한 도움이 될 수 있습니다.

Vancomycin 치료 로드 칼슘 염 및 뼈 감염의 향상 된 토끼 모델에서 자생 뼈

Bone infection results from bacterial invasion, which is extremely difficult to treat in clinical, orthopedic, and traumatic surgery. The bone infection ...

확률성 동물 모델은 뼈 감염 연구에 매우 중요합니다. 그러나, 현재 감염 상태와 박테리아의 수가 일관되는 토끼 모형이 없습니다. 우리의 뼈 감염 토끼 모델은 일관된 박테리아를 사용하고 반코미신로드 칼슘 황산염과 자가 성 파편에 의해 처리됩니다.기술은 뼈 감염과 뼈 비조합 치료의 진단으로 확장될 수 있고, 뼈 감염의 병신을 이해하는. 이 방법은 쥐, 마우스 및 돼지에 있는 그밖 뼈 감염 모형에 통찰력을 제공할 수 있었습니다. 동일한 양의 세균 현탁액을 골수에 로드하기가 어렵습니다.시각적 데모는 연구원이 중요한 단계를 쉽고 정확하게 수행하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세균 현탁액을 준비하기 위해 먼저 LB 배양 배지의 0.3 밀리리터에 S.aureus 동결 건조 분말의 0.5 밀리그램을 용해하십시오. 서스펜션을 철저히 섞고 박테리아를 트립틱 콩 한천 접시에 37°C에서 16시간 동안 휘어줍니다.다음 아침, 섭씨 37도에서 24시간 동안 트립틱 콩 국물 튜브에서 배양하기 위한 세균성 식민지 형성 유닛 을 선택하십시오. 박테리아가 중간 로고산심 성장 단계에 있을 때, 1.5 밀리리터 튜브로 박테리아의 1 밀리리터를 전송하고, 원심분리에 의해 박테리아를 수집합니다. 이어서, 세균세포 펠릿을 세척당 PBS 100마이크로리터로 3회 세척하여 최종 세척 후 3밀리리터의 신선한 PBS로 박테리아를 재연한다.뼈 감염 금형을 설정하려면 3 개월 된 3 킬로그램 남성 뉴질랜드 흰 토끼에서 발 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하고, 전기 면도기를 사용하여 모발 성장방향에 대한 근위 정골 영역에서 머리카락을 제거합니다. 포비돈 요오드 용액으로 노출된 피부를 소독하고, 펜과 눈자를 사용하여 경골의 상부와 S.Aureus 주입을 위한 드릴링 홀 위치를 표시하여 드릴링 홀 위치가 티비알 고원의 수평 중간에 있다는 것을 주의한다. 다음으로, 숫자 11 메스를 사용하여 피부에 절개를 하고, 회합에서 1센티미터 절개가 있습니다.전기 뼈 드릴 유닛을 사용하여 경골에 직경 2mm의 구멍을 뚫고 2밀리미터 직경의 뼈 왁스 2밀리미터 길이의 실린더로 구멍을 누릅니다. 경골 고원의 수평 평면을 따라 여분의 뼈 왁스를 제거하고 구멍이 뼈 왁스로 가득 있는지 확인합니다. 그런 다음 흡수 성 수술 봉합사를 사용하여 수직 매트리스 봉합사에 periosteum과 피부를 바느질하여 동물이 바늘을 추는 것을 방지하십시오.그리고 1 밀리리터 아셉시스 인젝터를 사용하여 S.Aureus 용액의 밀리리터 당 8개의 콜로니 형성 유닛에 1회 10번 천천히 주입하여 드릴 구멍에 넣습니다. 7일째, 14, 21 및 28일에는 감염된 토끼를 억제제 외부의 머리와 귀가 있는 토끼 제지에 넣고 백혈구 및 C 반응성 단백질 분석을 위해 혈관정맥에서 혈액 샘플을 수집합니다. 마취 후, 센티미터 티비알 피부와 수막 절개를하고 뼈 왁스를 청소하기 위해 숫자 11 메스를 사용합니다.다음으로, 전기 뼈 드릴 유닛을 사용하여 인접한 4.8mm 직경 구멍 두 개를 펀치하여 괴사 뼈를 신부화하고 뼈 숟가락을 사용하여 괴사 골수와 과립 조직을 신부화합니다. 그런 다음 두 구멍 사이에 뼈 조직을 긁어 내고 청소하고, 37°C에서 하룻밤 잠복을 위해 양 혈액 천판에 제거된 골수의 1밀리리터를 퍼뜨리고 닦아냅니다. 다음 아침, 30~300개의 식민지가 있는 판을 선택하고 감염된 동물당 식민지 형성 단위수를 계산합니다.감염 후 28일에는 반코미신 염산염 분말 1그램을 9.5그램의 의학적 등급의 황산칼슘에 넣고 주걱을 사용하여 30~45초 동안 일반 식염수 3밀리리터로 혼합물을 저어줍니다. 혼합 제품을 유연한 실리카 젤 몰드에 넣고 실온에서 15분 동안 건조시 제품을 허용합니다. 이어서, 곰팡이를 구부려 반코미신이 적재한 칼슘 황산염 또는 VCS 비드를 제거한다.항생제 치료 및 자가 뼈의 이식을 위해 먼저, 꼬리 부위를 면도하기 전에 부상당한 경골을 다시 노출하고, 포비돈 요오드 용액으로 노출된 꼬리 피부를 소독한다. 외과 가위를 사용하여 꼬리를 자르고 흡수 가능한 수술 봉합사를 사용하여 수직 매트리스 봉합사에서 피부를 닫아 동물이 바늘을 구치하지 않도록하십시오. 숫자 11 메스를 사용하여 꼬리 피부를 잘라 꼬리 뼈를 드러냅니다.근육, 연조직 및 골막통을 제거하고 각 관절에서 테일본을 분리합니다. 뼈 조각을 멸균 식염수로 함유한 100mm 플라스틱 접시로 옮기습니다. 다음으로 곡선 가위를 사용하여 VCS 비드 4개를 티비어 골수 캐비티에 이식하고 곡선 포셉을 사용하여 8개의 자가성 테일본 조각으로 뼈 결함을 채웁니다.그런 다음, 매트리스 봉합사 방식으로 흡수 가능한 수술 봉합사와 함께 음막과 피부 절개를 닫습니다. C-반응성 단백질과 백혈구 수준은 대조군 동물보다 뼈 감염 모델 그룹에서 더 높다. VCS 또는 VCS 자가 뼈 치료 후 2, 4, 6 및 8 주, C 반응성 단백질 및 백혈구 수준은 현저히 감소된다.2차원 재구성 이미지는 VCS 또는 VCS 및 자가뼈로 치료한 후 12주 동안 뼈 부피가 점진적으로 증가하는 반면, 뼈 손실은 치료되지 않은 뼈 감염 모델 그룹에서 유의하다. 뼈 재생 정량 지수를 분석하기 위해, 3D 모델 이미지는 비트맵 데이터를 사용하여 재구성될 수 있고, 타원형 4.8밀리미터 직경9.6밀리미터 길이의 타원형 영역은 각 뼈에서 선택될 수 있다. 처리되지 않은 뼈 감염 모델 그룹에서 조직 부피에 대한 뼈 부피의 비율은 VCS 및 VCS 자가 뼈 그룹에서 측정된 것보다 현저히 낮습니다.VCS 자가뼈 군의 반반수 및 두께 점수는 치료되지 않은 뼈 감염 모델 및 VCS 동물보다 현저히 높습니다. 더욱이, VCS 자가성 뼈 군의 반비리 분리 점수는 치료되지 않은 뼈 감염 모델 및 VCS 그룹에서 측정된 것보다 현저히 낮습니다. 적절한 체중의 토끼를 선택하십시오.뼈 왁스로 황색 포도상 구균 용액을 차단하십시오. 괴사 뼈를 완전히 데브리크하고 인접한 두 개의 직경 4.8mm 구멍을 펀치. 절차에 따라 초음파, 방사선학 및 컴퓨터 단층 촬영과 같은 다른 진단 측정 방법은 뼈 감염 및 수리의 병리학 적 과정을 모니터링하기 위해 수행 될 수 있습니다.이 향상 된 뼈 감염 모델 및 조합 VCS와 자가 뼈 치료 뼈 감염 및 뼈 재생의 밑줄 메커니즘을 공부에 도움이 될 수 있습니다. 황색포도상구균은 동결 건조 분말이 위험하기 때문에 박테리아 현탁액은 항상 고립 된 박테리아 실험실에서 준비해야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection(뼈 감염의 개선된 토끼 모델에서 반코마이신 적재 황산칼슘 및 자생성 뼈 치료)

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Vancomycin 치료 로드 칼슘 염 및 뼈 감염의 향상 된 토끼 모델에서 자생 뼈

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