Name: 발기인 캡처 안녕-c: 고해상도, 게놈 넓은 발기인 상호 작용의 프로 파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 Promoter Capture Hi-C를 활용하여 게놈 아키텍처가 유전자 발현을 조절하는 메커니즘을 규명하는 방법을. 이 기술은 비암호화 질병 변이체를 표적 유전자와 연결하여 치료적 통찰을 제공합니다.

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우리는 원고 및 그림 1 전문가 도움의 중요 한 독서에 대 한 Valeriya Malysheva 감사합니다. 이 작품은 의료 연구 위원회, 영국 (미스터/L007150/1)와 영국 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회, 영국 (BB/J004480/1)에 의해 지원 되었다.

저자는 공개 없다.

모듈형 디자인의 발기인 캡처 안녕-C
발기인 캡처 안녕-C는 구체적으로 발기인을 포함 하는 상호 작용에 대 한이 C 라이브러리를 풍부 하 게 설계 되었습니다. 이러한 상호 작용만이 C 라이브러리에 결 찰 제품의 하위 집합으로 구성 됩니다.
캡처 안녕-C 쉽게 캡처 시스템을 변경 하 여 모든 게놈 지역 또는 관심 영역에 대 한이 C 라이브러리를 풍부 하 게 수정할 수 있습니다. 캡쳐 영역 연속 게놈 세그먼트44,45,,4648, 강화 된 수 나 지나치게 사이트49 PCHi-C (' 리버스 캡처 안녕-C'35), 또는 DNase에서 확인 . 실험 범위에 따라 캡처 시스템의 크기를 조정할 수 있습니다. 예를 들어 드 라이덴은 외. 유 방 암44와 관련 된 3 개의 유전자 사막에서 519 미끼 조각을 대상. 마틴 외캡처 시스템. 두 연속 게놈 세그먼트를 대상 (' 지역 캡처 ': 총에서 211 게놈 영역; 2,131 제한 조각) 발기인 (3,857 유전자 발기인)45를 선택.
SureSelect 라이브러리는 다양 한 크기 범위에서 사용할 수: 499 kb (5190-4,806) 2.9 메가바이트 (5190-4,816), 500 킬로바이트 1 kb와 3 5.9 mb (5190-4,831). 각 개별 캡처 biotin RNA 120 뉴클레오티드 긴으로, 이러한 캡처 시스템 4,158의 최대 수용, 24,166 및 49,166 개별 캡처 프로브, 각각. 이 각각 2,079, 12,083, 및 24,583 대상된 제한 조각에 해당 (참고 제한 조각에 대 한 숫자는 경계값 모든 제한에 대 한 두 개의 개별 캡처 프로브를 디자인 될 수 있다 가정에 따라 조각-반복 시퀀스 인해 현실에서이 되지 것입니다 모든 제한 경우 조각 ( 그림 1B, C참조), 대상 제한 조각 일정 수가 사용 가능한 캡처 프로브에 대 한 높은 수 인 ).
여기에 설명 된 프로토콜을 장거리 상호 작용을 밝히기 위해서 6 bp 인식 사이트와 제한 효소의 사용을 기반으로 합니다. 4 혈압 인식 사이트와 더 인접 상호 작용의 높은 해상도 대 한 제한 효소를 사용 하 여 가능한40,49또한 이다.
PCHi C의 한계
모든 염색체 구조 붙 잡음 분석 실험의 한 제한을입니다 해상도 라이브러리 생성을 위해 사용 하는 제한 효소에 의해 결정 됩니다. 동일한 제한 조각에 있는 DNA 요소 간에 발생 하는 상호 작용 ' C 형 ' 분석에 표시 되지 않습니다. 또한, PCHi-c, 어떤 경우에 더 이상의 전사 시작 사이트 동일한 발기인에 포함 된 제한 부분에 있을 수 있습니다 및 일부 경우에서 Pir 항구 모두 적극적이 고 억압 적인 히스톤 부호 어렵게 그것을 정확 하 게 규정 요소는 상호 작용을 중재 발기인 상호 작용의 규정 출력을 예측 하 고. 4 혈압 인식 사이트와 제한 효소를 사용 하 여이 문제를 완화 하지만 대폭 증가 C 라이브러리 복잡성의 비용 (4 혈압 인식 사이트 제한 효소 생성이 C 라이브러리는이 C 보다 적어도 100 배는 더 복잡 한 6 혈압 인식 사이트 제한 효소를 사용 하 여 생성 하는 라이브러리의 경우) 다음 세대 시퀀싱 관련 비용.
또 다른 한계는 현재 PCHi C 프로토콜 자료, 희귀 종류 상호 작용 발기인의 분석 제외를 시작으로 세포의 수백만 요구. 100000 10000 셀 (예를 들어 초기 배아 개발 또는 조 혈 줄기 세포)와 세포 인구에서 발기인 연락처의 심문 수 있도록 PCHi C의 수정된 된 버전 캡처에 귀중 한 추가 될 것 이다 안녕하세요 C 도구 상자입니다.
마지막으로, 포름알데히드 고정에 사용 하는 방법에 대 한 모든, 같은 PCHi C만 기록 '냉동' 상호 작용의 고정 시간 시점에서. 따라서, 공부 하 고 활동 및 발기인 상호 작용의 역동성, 슈퍼 해상도 라이브 셀 현미경 같은 방법 필요 PCHi C와 함께
높은 해상도에서 공간 염색체 조직 해 부 방법
염색체 상호 작용 라이브러리의 광대 한 복잡 통계적 의미와 두 가지 특정 제한 조각 사이 상호 작용 제품의 신뢰할 수 있는 식별을 금지합니다. 이 문제를 회피, 시퀀스 캡처 안녕 C33,34,,4044 또는 특정 상호 작용에 대 한 3 C50,51 라이브러리를 풍부 하 게 사용 되었습니다. 농축 단계에 대 한이 C 라이브러리 이상 3 C 라이브러리를 사용 하 여의 주요 장점은 그이-C, 3 C, 달리 포함 정품 결 찰 제품에 대 한 농축 단계입니다. 결과적으로, PCHi C 라이브러리에서 유효한 읽기 비율 약 10 배 보다 높습니다 캡처-c에서 라이브러리50을 포함 약 5-8% 유효한 HiCUP 필터링 후 읽습니다. Sahlen 외. 직접 HiCap PCHi c 3 C 라이브러리를 사용 하 여 캡처-C 달리 캡처 농축이 C 라이브러리를 사용 하는 캡처-C를 비교 했습니다. 우리의 결과와 일치, 그들은 캡처 C 라이브러리는 주로 유엔 합자 조각40이루어진 발견. 또한, HiCap 라이브러리 캡처 C 라이브러리40보다 높은 복잡을 했다.
캡처-C, 다음-세대 캡처 C52 (NG 캡처-C) 라는 변종 PCHi C33,34, 겹치는 원본에 사용 되는 프로브 대신에 이전 설립 제한 조각 끝 당 하나 올리고 사용 캡처-C 프로토콜50. 이 겸손, 캡처-C를 비교 하는 유효한 읽기의 비율을 증가 하지만 NG 캡처-C 사용 하 여 캡처 농축의 두 순차 라운드 및 주기 PCR의 상대적으로 높은 수 (총, 20 ~ 24 사이클에 비해 11 주기 일반적으로 PCHi-c)는 필연적으로 결과 시퀀스 중복 및 낮은 라이브러리 복잡성의 높은 숫자에. 그러나 우리 고유 (즉, 중복)의 비율 쌍만 약 15% 이었다 19 PCR 주기 사용 했을 때 읽기 발견 PCHi C의 최적화 하는 동안 평가 실험, (13 사이클 미리 캡처 + 6 주기 후 캡처; 데이터 표시 되지 않음), PCR 주기, 낮은 수를 최적화 일반적으로 75-90% 고유 읽기 쌍 생성 합니다. 따라서, 실질적으로 PCR 사이클의 수를 줄이고 유익한 시퀀스 데이터 양을 증가 합니다.
최근 방법 안녕-C (HiChIP53)의 특정 단백질에 의해 중재 염색체 상호 작용에 초점을 가진 칩을 결합 합니다. ChIA 애완 동물54, 유사한 이론적 기반에 비해 HiChIP 데이터 정보 순서 읽기,53를 호출 하는 높은 신뢰 상호 작용에 대 한 허용 더 높은 수가 포함 되어 있습니다. 그것은 매우 직접 해당 HiChIP를 비교 하는 흥미로운 되며 안녕-C를 캡처 데이터 세트 한 번 그들이 사용할 수 있게 (예: HiChIP cohesin 단위 Smc1a에 대 한 항 체를 사용 하 여53 와 캡처 안녕-C 모든 Smc1a에 대 한 바인딩 제한 파편) 나란히입니다. 이러한 두 방법의 고유의 차이입니다 캡처 안녕-C chromatin immunoprecipitation에 의존 하지 않는 및 따라서 염색체 상호 작용 단백질 인에 관계 없이 질문은. 특정 요소 바인딩, PRC1 마우스 ESC 공간 게놈 건축7의 키 레 귤 레이 터로 식별 하는 데 사용 되었습니다가의 유무에서 3D 게놈 조직의 비교 수 있습니다.
PCHi C와 GWAS
그 보다 큰 95%의 질병-관련 된 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS) 밝혀졌다 시퀀스 변종 단백질 코딩 유전자55먼 거리에서 종종 게놈의 비 코딩 영역에 있습니다. GWAS 변종 들은 근접 DNase 나 지나치게 사이트 발견, 시퀀스를 잠재적인 규제 활동의 특징은. PCHi C와 캡처 안녕-C 링크 발기인 GWAS 위험 loci 유 방 암44,48대 장 암 및 자가 면역 질환35,,4546에 연루를 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다. PCHi C 종류 발견 자가 면역 질환과 관련 된 Snp 림프 세포에서 Pir에 농축 된 시퀀스 변종 혈소판 및 적혈구 특정 특색과 관련 된 했다에서 주로 발견 되지만 17 다른 인간의 조 혈 세포에 관한 연구 대 식 세포 그리고 erythroblasts, 각각35,56. 따라서, PCHi-C에 의해 발견 하는 interactomes 비 코딩 질병 관련의 기능을 이해를 도움이 될 수 하는 조직 형 특정 발기인 이체 순서 하 고 치료 적 개입에 대 한 새로운 잠재적인 질병 유전자를 식별 합니다.
발기인 상호 작용 영역의 특성
여러 줄 증거의 발기인 interactomes 유전자 식 제어 링크. 첫째, 여러 PCHi C 학문은 게놈 영역 (높은) 표현한 유전자의 발기인 상호 작용 H3K27 acetylation 등 p300 바인딩33,34 증강 활동과 관련 된 표시에 농축은 설명 했다 , 37. 우리 진 식 수준 상호 작용 강화, 강화 결과 증가 유전자 발현에서의 첨가제 효과34,35레벨 제안 수 사이 긍정적인 상관 관계를 발견. 둘째, 자연스럽 게 식 양적 특성 loci (eQTLs) 누구의 식 eQTLs35에 의해 영향을 같은 유전자에 연결 되어 있는 Pir에서 풍성 하 게 발생 합니다. 셋째, 여행57 및 PCHi C 데이터 통합, 케언즈 연구진이 발견 그 여행 리포터 유전자 마우스 ESCs에서 Pir를 보여 강한 기자 통합 사이트에서 리포터 유전자 보다 유전자 발현 발기인 상호 작용 영역에서 58, Pir transcriptional 규제 활동 소유를 나타내는. 함께, 이러한 결과 다양 한 마우스 및 인간의 세포 유형 PCHi-C에 의해 발견 하는 발기인 interactomes 유전자 식 컨트롤에 대 한 주요 규제 모듈 포함 것이 좋습니다.
그것은 PCHi C33,34에 의해 발견 하는 모든 Pir의 강화만 작은 분수 (~ 20%)을 나타내는 지적 가치가 있다. 다른 Pir 직접 transcriptional 규정 하는 기능 보다는 오히려 구조 또는 토폴로지 역할 있다. 그러나, 증거가 PCHi C 클래식 증강 마크 항구 하지 않는 규제 기능을 가진 DNA 요소를 밝히기 수 있습니다 또한 있다. 인간 림프 세포 라인에서 BRD7 발기인 보유 취재 원 유전자 분석 실험33증강 활동 표시 했다 증강 마크 없는 지역 상호 작용 발견 됐다. 유사한 특성을 가진 규제 요소는 현재 감사 보다 더 풍부한 있을 수 있습니다. 예를 들어 CRISPR 기반 화면 요소에 대 한 규제 DNA 요소 식별 표시 규제 (UREs) 유전자 발현을 제어 하지만 증강 없는59를표시 합니다.
다른 경우에, Pir chromatin 마크 transcriptional 억제와 관련 된 항구 표시 되었습니다. Pir 및 상호 작용 발기인 PRC1 마우스 ESCs에 의해 구속에 종사 했다 억압된 유전자 베어링의 광범위 한 공간 네트워크는 억압 적인 표시 H3K27me37. 인간의 lymphoblastoid 세포에서 BCL6 발기인 상호 작용 요소를 먼 transgene 기자 진 식33, 네이티브 컨텍스트에서 BCL6 전사를 억 누르기 위해 작동 수 있습니다 제안을 억 눌렀다.
Pir 농축 대 인 인간의 ESCs와 자문위37 chromatin 절연체 단백질 CTCF의 Pir의 또 다른 클래스를 나타낼 수 있습니다. 샨 다, 이러한 결과 Pir 유전자 기능 특징을 아직 규제 활동의 컬렉션 항구 것이 좋습니다.

게놈의 3 차원 조직 유전자 활성화1,2,3,4 억압을 포함 하 여 핵 프로세스의 범위에는 중요 한 기능 역할을 담당 하는 것을 제안 증거를 축적 ,,56,7,8, 재결합9,10, DNA 복구11, DNA 복제12,13, 그리고 세포 노화14. 먼 강화 그들은 적절 한 spatio 시간적 유전자 식 컨트롤에 대 한 필수적인15,,1617, 규제는 발기인에 공간 근접에서 발견 된다. 증강 삭제 표시 원심 강화 대상 유전자 전사18,19,20,,2122, 그리고 'chromatin 반복 강제'에 대 한 필수적입니다. 설계는 증강 및 Hbb 로커 스에서 그 대상 발기인 사이 tethering transcriptional 활성화23드라이브 충분 한지 보여 줍니다. 또한, 소성 증강의 통제 유전자를가지고 게놈 재배열 부적절 한 유전자 활성화 및 질병24,,2526발생할 수 있습니다. 함께, 이러한 예는 발기인 증강 상호 작용 유전자 제어에 필수적인 고 적절 한 유전자 발현 되도록 꽉 규제를 필요로 보여 줍니다. 인간의 마우스 genomes 각각 약 1 백만 강화 항구 추정. 이 강화의 대부분에 대 한 대상 유전자, 고 ' 교전 규칙 ' 발기인과 증강 사이 제대로 이해. 그들의 표적 유전자를 transcriptional 강화를 할당에 따라서 포유류 유전자 식 제어 해독에 큰 도전 남아 있다.
3 차원 게놈 아키텍처에 대 한 우리의 이해 3 C27 (염색체 구조 붙 잡음)의 소개 및 그것의 이체28,29,,3031 혁명 되었습니다. . 이러한 기법, 안녕-C (높은 처리량 염색체 구조 붙 잡음)의 가장 강력한는 세포 인구 내 염색체 상호 작용의 전체 앙상블을 식별 하도록 설계 되었습니다. 안녕하세요 C 라이브러리, 일반적으로 수백만의 세포에서에서 생성 되는 인간 게놈32~ 4 kb 조각 사이 약 1011 독립 결 찰 제품 매우 복잡 합니다. 결과, 개별 제한 간의 상호 작용의 안정적이 고 재현 가능한 식별 (예: 발기인 또는 증강 인자 포함)에서 조각으로 C 데이터 가능 하지 않습니다 하지 않는 한이 C 라이브러리 매우 깊은 시퀀싱을 복종 된다 정기적으로 C 라이브러리를 준비 하는 실험실에 대 한 경제적으로 실행 가능한 해결책 아니다. 이 단점을 우회 하 우리 발기인 캡처 안녕-C를 구체적으로 풍부이 C 라이브러리에서 결 찰 제품 발기인을 포함 하는 개발. 우리는 두 가지 이유로 발기인에 집중 했다. 첫째, 수많은 연구에서 (참조 위), 적절 한 유전자 식 수준에 대 한 중요 한 발기인-증강 연락처 표시 되었습니다 하 고 둘째, 발기인은 크게 변형 세포 유형 사이, 동일한 캡처 미끼 시스템 사용할 수 있습니다가 여러 세포 유형 및 조건에서 전기는 규제 회로 우리의 접근 방식은 수만 biotinylated RNA 120mers 발기인을 포함 하이-C 결 찰 제품 및 후속 캡처 streptavidin 입히는 자성 구슬에 보완이 C 라이브러리의 교 잡에서 솔루션에 의존합니다. PCHi C 라이브러리에이 결과 훨씬 상당히 높은 주파수에서 발기인에 출혈 조각의 식별에만 초점을 맞추고 원래이 C 라이브러리에 비해 복잡성 감소.
우리 인간의 숫자와 마우스 세포 유형 잠복 장거리 원심 발기인 상호 작용 영역 상 상속 규제 기능, 유전자 식 컨트롤의 더 나은 이해에 기여 하 PCHi C 뿐만 아니라 비 무작위 사용 핵의 3 차원 공간에서 발기인-발기인 연락처. 연구에서 수많은 셀 종류33,34,35,36,,3738, 발기인 증강 연락처의 수천 수백 매핑한 39, 식별 마우스 배아 줄기 세포7Polycomb 억압 적인 복잡 한 중재 공간 게놈 조직, 세포질 감 별 법37, 중 발기인 interactomes의 대규모 rewiring 시연 38 , 39, 그리고 연결 된 비 코딩 질병 관련 유전자 발기인35변종 시퀀스.
PCHi C DNA 순서 발기인 상호 작용의 게놈 넓은 앙상블을 지도 하는 이상적으로 적합 한 방법 이다. 관련된 접근, 같은 캡처 안녕-C를 연속 게놈 영역 ( 내용참조)의 고해상도 상호 작용 선택된 게놈 영역에 대 한 프로 파일을 얻기 위해 선택의 방법입니다. PCHi C와 캡처 안녕-C는 실험적인 관점 (유일한 차이점은 캡처 시스템의 선택)에서 매우 유사 하 있도록 조언과 지침을 제공 하는 우리 두 방법 모두에 적용 됩니다. 여기, 선물이 PCHi c.에 대 한 자세한 설명 우리 근거와 PCHi C 실험의 디자인, 단계별 PCHi C 라이브러리 생성 프로토콜을 제공 하 고 어떻게 PCHi C 라이브러리의 품질 높은-품질 데이터를 프로토콜의 다양 한 단계에서 모니터링할 수 있습니다 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>16% (vol/vol) 파라포름알데히드 용액</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>저잔류 필터 팁&nbsp;</td><td>Starlab</td><td>S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 및 S1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학 등급 물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>24740-011</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 (EDTA-free)&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>제한 버퍼 2 (10x NEBuffer 2)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 튜브, 1.5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tube, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>20% (wt/vol) SDS&nbsp; &nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>20% (vol/vol) Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>HindIII, 100 U/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dCTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18253-013</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>Life Technologies</td><td>18254-011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18255-018</td><td></td></tr><tr><td>0.4 mM Biotin-14-dATP</td><td>Life Technologies</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>DNA 중합효소 I 대형 (Klenow) 단편 5000 단위/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA 리가제 반응 완충액&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>100x 10mg/ml 소 세럼 알부민&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제, 1 U/&mu; 엘&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, 재조합, PCR 등급&nbsp;</td><td>로슈</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>20 000&times; g 50 ml 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>525-0156</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>페놀 pH 8.0&nbsp;</td><td>시그마</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>페놀: 클로로포름: 이소아밀 알코올 25:24:1&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 pH 5.2&nbsp;</td><td>시그마</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>제한 버퍼 2.1 (10x NEBuffer 2.1)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202</td><td></td></tr><tr><td>NheI, 100U/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131</td><td></td></tr><tr><td>Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6x16mm vials& 주의;</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>초음파 처리 SPRI</td></tr><tr><td>비드 (Agencourt AMPure XP)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 비즈&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20&nbsp;</td><td>시그마</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dATP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18252-015</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소 3000 단위/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK 10000 단위/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Klenow 엑소 마이너스 5000 단위/mL&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td></td></tr><tr><td>빠른 결찰 반응 완충액&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B6058</td><td></td></tr><tr><td>NEB DNA 빠른 리가제&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>PE 어댑터 1.0 (5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC AGGAATGCCGAG-3')</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE 어댑터 2.0 (5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3')</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB Phusion PCR 키트&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PE PCR 프라이머 1.0 (5'-AATGATACGGCGACCGA GATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT-3')</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE PCR 프라이머 2.0 (5'-CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGA GATCGGTCTCTCCT GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3')&nbsp;</td><td>일루미나</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 스트립&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>410022 및 401425</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect SSEL TE 시약 ILM PE 전체 어댑터 키트&nbsp;</td><td>Ginger Technologies</td><td>931108</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect 맞춤형 3-5.9Mb 라이브러리&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-4831</td><td>맞춤형 디자인 마우스 또는 인간 PCHi-C 시스템</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 비즈&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>E220&nbsp; 고성능 집속 초음파 발생기</td><td>Corvaris</td><td>E220</td><td></td></tr></tbody></table>

발기인 캡처 안녕-c: 고해상도, 게놈 넓은 발기인 상호 작용의 프로 파일링

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

게놈의 3 차원 조직 기능에 연결 된다. 예를 들어 transcriptional 강화 등 규제 요소 제어 신체 접촉, 종종 상당한 (경우에 따라 수백 kilobases의) 게놈 거리 브리징 및 우회를 통해 그들의 표적 유전자의 spatio 시간적 표현 근처는 유전자 인간 게놈 항구는 약된 1 백만 강화의 대다수는 알 수 없는 유전자 목표. 그들의 표적 유전자를 원심 규제 영역을 지정 하는 것은 따라서 유전자 식 제어를 이해 하는 중요 한 합니다. 우리는 단일 실험에서 모든 발기인에 대 한 발기인 캡처 안녕-C (PCHi-C) 원심 발기인-상호 작용 영역 (Pir)의 게놈 넓은 탐지를 사용 하도록 개발. PCHi-c, 매우 복잡 한이 C 라이브러리는 수천 biotinylated RNA baits 모든 발기인에 포함 된 금지 파편의 끝에 보완 솔루션에서 하이브리드 선택을 통해 발기인 시퀀스에 대 한 구체적으로 농축 된다. 목표를 다음 풀 다운 발기인 순서 및 그들의 빈번한 상호 작용 파트너 강화 등 다른 잠재적인 규제 요소입니다. 높은 처리량 쌍-엔드 시퀀싱, 후 통계 시험 제한 조각 수준에서 상당한 Pir를 식별 하기 위해 각 발기인 출혈 제한 부분에 적용 됩니다. 우리 인간의의 마우스 세포 유형 장거리 발기인 상호 작용의 아틀라스 생성 PCHi-C를 이용 했다. 이 발기인 위하여 지도 그들의 표적 유전자를 putative 규제 지역 지정 및 우대 공간 발기인-발기인 상호 작용 네트워크를 공개 하 여 포유류 유전자 식 컨트롤의 더 큰 이해에 공헌 했다. 이 정보는 또한 비 코딩 질병 관련 된 연결 하 여 잠재적인 질병 유전자의 식별 인간의 유전자 질환을 이해 하 고 관련성이 있다 변종에 또는 근처에 그들의 표적 유전자를 제어 시퀀스 시퀀스.

발기인 캡처 안녕-C 마우스7,34,,3639 및 인간의33,35,37,38 이 C 라이브러리를 풍부 하 게 사용 되었습니다. 발기인의 상호 유사한 프로토콜 (HiCap 라는) 샌드 그룹40에 의해 설명 하고있다. 그림 1A 보여주는 도식 워크플로 위한 발기인 캡처 안녕. 여기에 설명 된 프로토콜에서이 C 라이브러리에 핵 결 찰41, 스 퓨 리 어스 결 찰 제품42의 상당히 감소 번호에 어떤 결과 사용 하 여 생성 됩니다. PCHi-C에 대 한 매우 복잡 한 마우스 또는 인간의 C 라이브러리 솔루션에서 교 잡을 복종 되 고 39,021 biotinylated RNAs 22,225 마우스 발기인에 포함 된 HindIII 제한 조각을, 보완 또는 37,608 biotinylated RNAs를 사용 하 여 캡처 타겟팅 22,076 인간의 발기인에 포함 된 HindIII 제한 파편, 각각. 개별 biotinylated RNAs (그림 1B)에 의해 중 하나 또는 둘 다 끝에 금지 파편을 포함 하는 발기인을 대상 수 있습니다. 우리는 예상 대로 둘 다의 캡처의 개별 발기인 (그림 1C, 원시 시퀀스 읽기) 거의 2 배 향상 된 범위를 종료 발견. 따라서, 언제 든 지 가능한 (즉, 비-반복 영역에), 우리를 사용 하 여 biotinylated RNAs 제한 조각의 양쪽을 보완 수 조언.
라이브러리 준비 하는 동안 초기 단계에서 PCHi C 라이브러리 품질을 평가, 우리 DNA 결 찰 및 정화, 앞에서 설명한31후 두 개의 컨트롤을 수행 합니다. 첫 번째 사용 하는 특정 뇌관 쌍 3 C27에서 결 찰 제품을 증폭입니다. 뇌관 쌍 (표 1)를 사용 하 여 셀 형 고정 장거리 결 찰 제품을 증폭 하는 우리, 같은: Myc 유전자와 그것의 알려진된 강화 약 2mb 거리 (그림 2A) 또는 Hist1 소재 시 (유전자 사이 구분 하 여 1.5 m b), 그리고 선형 근접 ('단거리 컨트롤')에 위치한 2 개의 지구 사이.
두 번째 품질 관리 biotin dATP와 제한 사이트 돌출부의 Klenow 중재 채우기 동안 biotin 결합의 효율성을 결정 하기 위해 수행 됩니다. 성공적인 Klenow 채우기 및 새로운 NheI 인식 사이트 (그림 2B 의 형성에서 DNA 분자의 결 찰 제품 및 HindIII의 경우 사이 원래 제한 사이트의 실종에서 이후 무뚝뚝한 끝 결 찰 결과 ). NheI 소화 결 찰 제품을 HindIII의 비율은 biotin 결합 효율의 직접 판독 합니다. 반면에 높은-품질 라이브러리는 결 찰 제품 (그림 2B)의 가까운 완전 한 NheI 소화 품질이 C 라이브러리 HindIII 소화의 높은 수준의 표시 됩니다.
준비 후에 C 라이브러리 (즉, biotin streptavidin 풀 다운 안녕 C 결 찰 제품 크기 선택, 어댑터 결 찰 및 캡처 전 PCR 후),이 C 라이브러리의 무결성 및 크기 분포는 Bioanalyzer (그림에 의해 평가 2 C). 동일한 컨트롤 PCHi C 라이브러리 준비 (즉, 결 찰 제품 발기인을 포함 하 고 포스트 캡처 PCR의 교 잡 캡처 후)의 끝에서 수행 됩니다. 안녕-C와 PCHi C Bioanalyzer 프로필의 비교 표시 예상 대로,이 C 라이브러리는 해당 PCHi C 라이브러리 보다 훨씬 더 집중 하지만 라이브러리의 크기 분포는 매우 유사한 캡처 단계에 있음을 나타내는 PCHi C 크기 바이어스 (그림 2C, D)를 도입 하지 않습니다.
짝-엔드 시퀀싱, 후 PCHi C 읽기 매핑됩니다, 그리고 품질 제어 및 HiCUP 파이프라인43을 사용 하 여 필터링. 70-90% '유효한 쌍' 사이 포함 하는 높은-품질 PCHi C 라이브러리 (즉, 결합 하 여 최종 시퀀스 선형 게놈 지도;에 인접 하지 두 제한 조각 사이 읽습니다 그림 3A, B). 핵 결 찰 프로토콜41,42를 사용 하 여 트랜스 의 백분율 쌍 (즉, 결합 하 여 최종 시퀀스 다른 염색체에 있는 2 개의 제한 파편 사이 읽습니다)는 일반적으로 낮은 읽기 5와 사이 25%, 염색체 영토의 존재를 반영 하 고 품질 좋은 라이브러리를 나타내는. '유효한 쌍'이 C 라이브러리와 그들의 해당 PCHi C 라이브러리35사이 비율의 직접적인 비교, 쇼를 모든 경우에 유효한 쌍의 비율 (그림 3B) PCHi C 라이브러리에서 높은 수준 이다. 이 유효 하지 않은 '같은 조각 내부' 읽기 PCHi-c (그림 3C)의 비율에 있는 감소를 동반 된다. 이것은 예상, 캡처 단계 발기인 포함 된 결 찰 제품을 풍요롭게 하는 뿐만 아니라 또한 제한 조각 끝에 대 한 제한에 캡처 oligos의 위치 때문에 조각 ( 그림 1B를참조).
HiCUP 필터링, 후 우리는 캡처 효율을 결정 합니다. PCHi C 라이브러리 세 가지 유형의 HiCUP 필터링 후 유효한 시퀀스 읽기 포함: 1.) 발기인: 게놈 읽습니다 (캡처된 발기인 조각 및 게놈에서 발기인이 아닌 HindIII 제한 조각 사이즉, 읽기) 2.) 발기인: 발기인 읽습니다 (2 개의 캡처된 발기인 파편 사이 읽기) 3.) 게놈: 게놈 (배경 안녕 C 결 찰 제품 결 찰 제품 파트너의 캡처된 발기인 매핑됩니다)를 읽습니다. 이 다운스트림 분석 전에 삭제 됩니다.
높은-품질 PCHi C 라이브러리는 캡처 효율성 (카테고리 1과 2의 합) (그림 3D) 65-90% 사이. 이 C 라이브러리를 직접 비교를 보여줍니다 PCHi C에 결과 ~ 15 농축 제품에 대 한 발기인-포함 된 결 찰 (그림 3D), 일부의 경우 17-fold. 이 가상 최대 가깝습니다 (19.6-fold) PCHi-c, 게놈 금지 파편의 비율에 따라 농축 캡처 시스템에 의해 보호. 더 농축 캡처 시스템 적은 제한 조각44,,4546를 대상으로 디자인 하 여 구현할 수 있습니다.
발기인 interactomes의 분석 세포 유형 및 혈통 특이성33,34,35, 세포질 감 별 법37,38,39 동안 발음 변화를 보여줍니다. . 그림 4 와 5 특정 발기인에 혈통 특이성 및 차별화 역학의 예를 표시합니다. 예를 들어 ALAD 는 constitutively 모든 셀에 표현 이지만 그 표현 upregulated erythroblasts47. ALAD 발기인 모든 조 혈 모 세포에서 여러 말 초 조각와 erythroblasts (그림 4)에 구체적으로 추가 상호 작용에 종사 합니다. IL-8 B 세포, T 세포, monocytes, 중 성구 및 없으며 (셀 타입 특정 상호 작용을 포함 하 여, 골수성 계보의 세포에서 상호 작용의 수십에서 거의 상호 작용에 아무 통계적으로 중요 한 상호 작용을 보여줍니다. 그림 5)입니다. 이러한 예 PCHi-C를 사용 하 여 셀 형식을 특정 interactomes를 푸는 규제 가능성으로 발기인 상호 작용 영역을 식별 하는 방법을 보여 줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig1.jpg"> 그림 1 : 발기인 캡처 안녕-C 근거 및 캡처 미끼 디자인. (A) 회로도 워크플로 PCHi-c 핵 결 찰이 C41,42 (I) 뒤에 biotinylated RNA 미끼 (II)와 교 잡에서 솔루션 대상의 모든 인간의 제한 조각 (여기 묘사) 또는 마우스 유전자 발기인 (III). ((B)) 미끼 디자인 PCHi-c Biotinylated RNA 캡처 미끼 (빨간 곡선)는 발기인에 포함 된 제한 조각 (회색, 발기인 순서 (빨간색) 스스로 타겟으로하는 RNA 캡처 미끼에 의해 제한에 위치 하는 경우 노트의 끝에 대 한 설계 되었습니다. 조각 끝)입니다. 결 찰 발기인에 포함 된 제한 조각 (회색) 및 그들의 상호 작용 제한 조각 (황색 및 녹색)의 구성 된 제품은 미끼 RNA와 DNA 대상 간의 교 잡 시퀀스 complementarity 통해 격리 및 후속 biotin streptavidin 풀 다운, 발기인에 포함 된 제한 조각에 대 한 대답 (C) 비교 PCHi-C의 캡처 효율와 같이 대상 한 RNA 미끼 캡처 프로브 vs 두 RNA 미끼 캡처 프로브 (b에서 회로도 참조). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig2.jpg"> 그림 2 : PCHi C 사전 시퀀싱 품질 컨트롤. (A) 왼쪽, 발기인 및 PIR, 발기인에 포함 된 제한 조각 (회색, 빨간색으로 발기인 순서) 및 PIR 제한 조각 (황색)의 구성 된이 C 결 찰 제품 결과 사이 공간 나란히의 도식. 오른쪽, DNA 젤 전기 이동 법이 C 결 찰 제품 (로 왼쪽에 도식에 묘사 된) 특정 뇌관 쌍을 사용 하 여 증폭의 예를 보여주는. 안녕하세요 C 결 찰 제품 (PCR 제품 A에 표시 된)의 HindIII, NheI 및 HindIII/NheI 제한 다이제스트의 ((B)) 왼쪽, 대표적인 예. 바로, DNA의 설계도 C 결 찰 실패 다음 (위)에 후 시퀀스 또는 제한 접합 및 이후 결 찰의 성공 (아래) dNTP Klenow 채우기. (C) 대표가 C 라이브러리 bioanalyzer 프로 파일 (1/5 희석). (D) 대표 PCHi C 라이브러리 bioanalyzer 프로 파일 (희석). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig3.jpg"> 그림 3 : PCHi C 후 시퀀싱 품질 컨트롤. (A) 비율 유효한 시퀀스의 비교 HiCUP43 PCHi C vs이 C 라이브러리 (하비에르 외에서 데이터, 201635) 해당 처리 후 쌍을 읽기. (B) 대표 HiCUP PCHi-C 결과 유효한 보여주는 쌍, 및 다운스트림 분석 (하비에르 외에서 데이터, 201635) 전에 삭제는 다른 시퀀스 범주 읽기. (C) 비율 '같은 조각 내부'의 비교가 읽습니다 HiCUP 후 PCHi C vs이 C 라이브러리 (하비에르 외에서 데이터, 201635) 해당 처리. (D) 비율 시퀀스의 비교 PCHi C vs이 C 라이브러리 (하비에르 외., 201635에서 데이터)에 해당 관련 된 baited 발기인 조각 (캡처 효율)를 읽습니다. <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig4.jpg"> 그림 4: ALAD 인간 조 혈 모 세포 프로 파일 PCHi C. 골수성 세포 유형의 상호 작용 발기인 블루 아치로 표시 되 고 림프 세포 유형의 상호 작용 발기인 보라색 아치로 표시 됩니다. Erythroblast-특정 상호 작용 (하비에르 외에서 데이터, 201635) 빨간색 화살표로 표시 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig5.jpg"> 그림 5 : IL8 인간 조 혈 모 세포 프로 파일 PCHi C. 골수성 세포 유형의 상호 작용 발기인 블루 아치로 표시 되 고 림프 세포 유형의 상호 작용 발기인 보라색 아치로 표시 됩니다. Monocyte 특정 상호 작용 녹색 화살표로 표시 됩니다, neutrophil 특정 상호 작용 빨간색 화살표로 표시 됩니다 그리고 megakaryocyte 특정 상호 작용을 (하비에르 외에서 데이터, 201635) 갈색 화살표로 표시 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="9">인간의</td>
		</tr>
<tr>
<td>이름</td>
			<td colspan="3">시퀀스</td>
			<td>염색체</td>
			<td>스트랜드</td>
			<td>시작 GRCh38/hg38</td>
			<td>끝 GRCh38/hg38</td>
			<td>3 C 상호 작용 및 biotin 합동 테스트 뇌관 조합</td>
		</tr>
<tr>
<td>hs AHF64 데커</td>
			<td colspan="3">GCATGCATTAGCCTCTGCTGTTCTCTGAAATC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116803960</td>
			<td>116803991</td>
			<td>hs AHF66 데커와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td>hs AHF66 데커</td>
			<td colspan="3">CTGTCCAAGTACATTCCTGTTCACAAACCC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116810219</td>
			<td>116810248</td>
			<td>hs AHF64 데커와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td>hs MYC 로커 스</td>
			<td colspan="3">GGAGAACCGGTAATGGCAAA</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127733814</td>
			<td>127733833</td>
			<td>hs MYC +1820와 함께 사용 하 여 hs MYC-538</td>
		</tr>
<tr>
<td>hs MYC +1820</td>
			<td colspan="3">AAAATGCCCATTTCCTTCTCC</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>129554527</td>
			<td>129554547</td>
			<td>hs MYC 로커 스와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td>hs MYC-538</td>
			<td colspan="3">TGCCTGATGGATAGTGCTTTC</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127195696</td>
			<td>127195716</td>
			<td>hs MYC 로커 스와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td>hs HIST1 F</td>
			<td colspan="3">AAGCAGGAAAAGGCATAGCA</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>26207174</td>
			<td>26207193</td>
			<td>hs HIST1 R와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td>hs HIST1 R</td>
			<td colspan="3">TCTTGGGTTGTGGGACTTTC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>27771575</td>
			<td>27771594</td>
			<td>hs HIST1 F와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="9">마우스</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">시퀀스</td>
			<td>염색체</td>
			<td>스트랜드</td>
			<td>시작 GRCm38/mm10</td>
			<td>끝 GRCm38/mm10</td>
			<td>3 C 상호 작용 및 biotin 합동 테스트 뇌관 조합</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TCATGAGTTCCCCACATCTTTG</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84841090</td>
			<td>84841111</td>
			<td>mm Calr2와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CTGTGGGCACCAGATGTGTAAAT</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84848519</td>
			<td>84848541</td>
			<td>mm Calr1와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TATCAAGGGTGCCCGTCACCTTCAGC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163098</td>
			<td>125163123</td>
			<td>Gapdh4 데커와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGCTTTTATAGCACGGTTATAAAGT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163774</td>
			<td>125163799</td>
			<td>Gapdh3 데커와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGAGGAGGGAAAAGGAGTGATT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>52212829</td>
			<td>52212850</td>
			<td>mm Hoxa13와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CAGGCATTATTTGCTGAGAACG</td>
			<td>6</td>
			<td>-</td>
			<td>52253490</td>
			<td>52253511</td>
			<td>mm Hoxa7와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTAATGGTGTCACTAACTGG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23571284</td>
			<td>23571305</td>
			<td>m Hist1h3e m 또는 mm Hist1h4i와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTTTGATGAGTTGGTGAAG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23566541</td>
			<td>23566561</td>
			<td>mm Hist1h2ae와 함께 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TTGGGCCAAAGCCTATATGA</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>22043085</td>
			<td>22043104</td>
			<td>mm Hist1h2ae와 함께 사용</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 인간의 품질 관리에 대 한 입문 시퀀스 및 마우스가 C 라이브러리.

강화, 같은 DNA 규제 요소, 물리적으로 대상 유전자 발기인, 큰 게놈 거리에 걸친 장거리 염색체 상호 작용을 통해 자주 연락 하 여 유전자 발현을 제어 합니다. 발기인 캡처 안녕-C (PCHi-C) 그들의 표적 유전자를 잠재적인 규제 시퀀스의 지정을 활성화 발기인 및 원심 지역 사이 중요 한 상호 작용을 식별 합니다.

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

transcriptional enhancer와 같은 regulatory element는 장거리 염색체 상호작용을 통해 조절하는 target gene로부터 게놈 거리가 멀 수 있기 때문에 Promoter Capture Hi-C의 목표는 유전자 조절 요소를 target gene에 연결하는 것입니다. 이 방법은 게놈의 3차원 구조가 유전자 발현 제어에 미치는 영향과 같은 게놈 구조 및 기능 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 솔루션의 단일 제한인 중요한 프로모터 상호 작용을 감지할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 치료 분야로 확장되는데, 이는 조절 조절 서열 내 또는 조절 제어 서열 내의 비암호화 질병 연관 서열 변이를 표적 유전자에 연결할 수 있기 때문입니다. 실험당 최소 2,000만 개의 세포로 시작합니다. 현탁 세포의 경우 400배 g 및 섭씨 20도에서 3분 동안 세포를 수집하고 원심분리합니다.상층액을 제거하고 실온에서 10% FBS가 있는 30.625밀리리터의 배지에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 4.375 밀리리터의 16 % 메탄올이 없는 파라포름알데히드를 2%의 최종 농도에 첨가하고 로커에서 부드럽게 혼합하면서 실온에서 10분 동안 세포를 고정합니다. 갓 준비한 얼음처럼 차가운 글리신 1몰 5ml를 첨가하여 반응을 억제합니다.실온에서 5분간 부드럽게 흔들어 섞습니다. 그런 다음 얼음 위에서 15분 동안 배양하고 가끔 뒤집어 배양합니다. 다음으로 현탁 전지를 760배 g, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고 세포 펠릿을 50ml의 얼음처럼 차가운 PBS pH 7.4에 다시 현탁시킵니다. 마지막으로 세포를 400 배 g, 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심 분리하고 조심스럽게 상층액을 제거합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 용해 후 세포핵을 1.25x 제한 버퍼 2로 세척합니다.이를 위해 펠릿을 1ml의 얼음 냉각 완충액에 다시 현탁시키고 다시 현탁된 핵을 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 상층액을 제거하기 전에 g과 섭씨 4도의 760배에서 5분 동안 핵을 회전시킵니다. 펠릿을 1790마이크로리터의 1.25x 제한 버퍼 2에 다시 현탁시킵니다.그런 다음 현탁액을 각각 358마이크로리터에 5-1,000만 개의 세포핵을 포함하는 5개의 분취량으로 나눕니다. 분취액당 부피당 SDS의 10%중량 11마이크로리터를 추가하고 써모믹서에서 섭씨 37도에서 30분 동안 분당 950회전으로 흔듭니다. 세포 덩어리가 나타나면 기포가 생성되지 않도록 피펫팅으로 세포를 분리하십시오.다음으로, 분취액당 75마이크로리터의 10%Triton X-100을 넣고 써모믹서에서 950rpm과 37°C에서 15분 동안 흔듭니다. 분취액당 HindIII의 마이크로리터당 100단위의 12마이크로리터를 추가합니다. 써모믹서에서 950rpm으로 흔들면서 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.분해 후 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 정량적 PCR을 수행합니다. 다음으로, 분취액당 60마이크로리터의 비오틴닐화 마스터 믹스를 첨가하고 혼합합니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 분취액을 배양하고 30초마다 5초 동안 700rpm으로 흔듭니다.1시간 후 부분 표본을 얼음 위에 놓습니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 Hi-C 라이브러리를 수행합니다. 500나노그램에서 1마이크로그램의 Hi-C 라이브러리를 새 튜브로 옮긴 다음 진공 농축기에서 샘플이 건조될 때까지 증발시킵니다.3.6 마이크로리터의 분자 생물학 등급 물, 2.5 마이크로리터의 차단제 1, 2.5 마이크로리터의 차단제 2 및 0.6 마이크로리터의 맞춤형 차단제를 추가하여 증발된 Hi-C 라이브러리를 다시 현탁시킵니다. 샘플을 새 PCR 튜브 스트립의 웰로 옮기고 PCR 캡 스트립으로 닫은 다음 샘플을 얼음 위에 놓습니다. Hi-C DNA의 경우 우물을 D로 표시합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 하이브리드화 버퍼를 준비합니다. 버퍼를 온도 혼합기에서 섭씨 65도에서 5분 동안 배양합니다. 완충액을 새 PCR 튜브 스트립의 웰로 옮기고 PCR 캡 스트립으로 닫은 다음 실온에서 유지합니다.우물을 H로 표시하여 hybridization buffer에 대해 알립니다. 새로운 PCR 튜브 스트립의 웰에 마이크로리터당 100나노그램의 비오틴화 RNA 프로브 5개, SRNase B RNase 억제제 0.5마이크로리터 및 분자생물학 등급 물 1.5마이크로리터를 혼합합니다. PCR 캡 스트립으로 PCR 튜브 스트립을 닫고 얼음 위에 놓습니다.RNA의 경우 튜브를 R로 표시합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 PCR 기계를 설정합니다. 샘플 증발을 방지하기 위해 PCR 기계가 작동하는 동안 모든 절차를 수행하는 동안 가능한 한 빨리 진행하십시오.D PCR 튜브 스트립을 PCR 기계에 놓고 PCR 기계 덮개를 닫고 PCR 반응을 시작합니다. PCR 프로그램이 섭씨 65도에 도달하면 PCR 기계 덮개를 열고 H PCR 튜브 스트립을 PCR 기계에 넣습니다. PCR 기계 뚜껑을 닫고 3분 동안 배양합니다.그런 다음 PCR 기계 덮개를 열고 R PCR 튜브 스트립을 PCR 기계에 놓고 PCR 기계를 닫습니다. 2분 후 PCR 기계 뚜껑과 모든 PCR 튜브 스트립을 엽니다. 13마이크로리터의 웰 H를 웰 R로 옮긴 다음 모든 부피의 웰 D를 웰 R.Pipet에 위아래로 세 번 이동하여 반응을 혼합하고 PCR 튜브 스트립을 닫습니다.H 및 D PCR 튜브 스트립을 제거하고 PCR 기계 덮개를 닫습니다. 섭씨 65도에서 24시간 동안 반응을 배양합니다. 60마이크로리터의 스트렙타비딘 결합 마그네틱 비드를 새 튜브에 추가합니다.상층액을 제거하기 전에 튜브를 자기 분리 스탠드에 1분 동안 놓습니다. 200마이크로리터의 1x 바인딩 버퍼로 비드를 다시 매달고 실온에서 3분 동안 회전하고 회전 휠에서 15rpm으로 회전합니다. 탁상용 원심분리기에서 튜브를 2-3초 동안 부드럽게 돌려 샘플을 채취합니다.튜브를 자기 분리 스탠드에 3분 동안 올려 놓은 후 상층액을 제거합니다. 이 세척을 두 번 반복하십시오. 그런 다음 200마이크로리터의 1x 결합 버퍼에 비드를 다시 현탁합니다.PCR 프로그램이 계속 실행되는 동안 PCR 기계와 PCR 튜브 스트립을 열고 마그네틱 비드가 있는 튜브로 혼성화 반응을 전달합니다. 반응물과 비드를 실온에서 30분 동안 3rpm으로 회전하는 휠에서 배양합니다. 자기 분리 스탠드의 비드를 회수하고 투명한 상층액을 제거합니다.500마이크로리터의 세척 완충액 1에 비드를 다시 현탁시킨 후 열혼합기에서 950rpm으로 진탕하면서 섭씨 20도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 다시 비드를 회수하고 투명한 상층액을 제거합니다. 이제 500마이크로리터의 세척 버퍼 2에 비드를 다시 매달아 혼합합니다.써모믹서에서 950rpm으로 진탕하면서 섭씨 65도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 세탁 버퍼 2로 이 세척을 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 샘플을 자기 분리 스탠드에 놓고 투명한 상층액을 제거한 다음 200마이크로리터의 1x 제한 버퍼 2에 비드를 다시 현탁합니다.비드를 회수하고 상층액을 다시 제거한 후 비드를 30마이크로리터의 1x 제한 버퍼 2로 다시 현탁합니다. 이 그림은 17개의 인간 조혈 세포 유형에서 IL8 프로모터에 대한 프로모터 캡처 Hi-C 상호 작용 프로파일을 보여줍니다. 림프 세포 유형의 프로모터 상호 작용은 purplearches로 표시되고 골수성 세포 유형의 promoter 중단은 blue arches로 표시됩니다.단핵구 특이적 상호작용은 녹색 화살표로, 호중구 특이적 상호작용은 빨간색 화살표로, 거핵세포 특이적 상호작용은 갈색 화살표로 표시합니다. 이 절차를 시도하는 동안 가능한 한 정확하게 작업해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 흑마술은 아니지만 긴 프로토콜이므로 작은 실수가 합쳐져 결국 데이터 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.이 절차에 따라 CRISPR/Cas9 genomore epigenome editing과 같은 다른 방법을 수행하여 promoter Capture Hi-C에 의해 밝혀진 promoter 상호 작용 영역의 생물학적 기능을 조사할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후 실험실에서 프로모터 Capture Hi-C를 구현하는 방법을 잘 이해하셨기를 바랍니다.

promoter-capture-hi-c-high-resolution-genome-wide-profiling-promoter

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

히 - C 방식은 염색질 상호 작용 (1) 편견, 게놈 차원의 식별이 가능합니다. 히 - C의 커플 근접 결합 및 대규모 병렬 시퀀싱합니다. 그 결과 데이터가 여러 스케일에서 게놈 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 : 초기 결과는 같은 염색체 지역, 개방적이고 닫힌 염색질의 분리 및 megabase 규모의 염색질 구조와 같은 기능을 확인.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

이것은 후속 proteomic 분석에 대 한 가교 된 chromatin의 순서 특정 캡처에 의존 하는 특정 대상 loci에 새로운 상호 작용 하는 DNA 단백질을 식별 하는 방법. 잠재적인 바인딩 단백질도 세포 수정에 대 한 사전 지식이 요구 된다. 처음에 효 모에 대 한 개발, 기술은 지금 되었습니다 포유류 세포에 대 한 적응.

교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

유전자와 규제 요소 간의 물리적 상호 작용의 식별 도전 이지만 염색체 구조 캡처 방법에 의해 촉진 되었습니다. 4 C-seq 프로토콜이 수정이 PCR 템플릿-증폭을 최소화 하 여 PCR 바이어스를 완화 하 고 또한 금지 효소 다이제스트 단계를 통합 하 여 읽기의 mappability을 극대화.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

우리는 배아 줄기 세포에서 생성된 배아 체에서 높은 처리량 시퀀싱에 이어 정량적 염색체 형성 캡처의 적용을 보고합니다. 이 기술은 배아 줄기 세포 분화 동안 주어진 유전자의 putative 강화제와 프로모터 영역 사이의 접촉을 식별하고 정량화할 수 있습니다.

정량적 염색체 형성(4C)에 의한 배아체에서 증강-프로모터 접촉 식별

이 프로토콜은 위상 연관 도메인(TAD)의 경계 및 조절 및 기타 DNA 서열 요소 간의 장거리 염색질 상호 작용을 포함하여 고해상도에서 메가 기반 크기의 표적 게놈 영역의 3D 조직을 특성화하는 데 사용되는 Capture Hi-C 방법을 설명합니다.

Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독

ATAC-seq는 과민성 돌연변이 트랜스포자제 Tn5를 사용하여 전사 인자에 의해 매개되는 염색질 접근성의 변화를 매핑하는 DNA 시퀀싱 방법입니다. ATAC-seq는 암세포의 표현형 변화의 기초가되는 분자 메커니즘의 발견을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 암세포를 포함한 상피 세포 유형에서 ATAC-seq에 대한 최적화 절차를 간략하게 설명합니다.

암 후성유전학 연구를 위한 ATAC-Seq 최적화

유전자 발현은 유전자 프로모터와 원위 조절 요소의 상호작용에 의해 조절된다. 여기서는 낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 통해 이전에는 측정할 수 없었던 희귀 세포 유형에서 이러한 상호 작용을 식별할 수 있는 방법을 설명합니다.

희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 구조를 연구하기 위한 통합 워크플로우An Integrated Workflow to Study the promoter-centic spatio-temporal genome architecture in Scarce Cell Populations

생물학자가 브라우저 기반 도구만을 사용하여 조직 특이적 유전자 증강제를 식별할 수 있도록 코딩 없는 워크플로우를 제시합니다. 당사의 프로토콜은 공개 H3K4me1/H3K27ac 히스톤 마크 및 Hi-C 데이터를 활용하여 프로그래밍 전문 지식이 없는 연구자가 관심 유전자와 관련된 잠재적 조절 요소에 액세스, 분석 및 식별할 수 있도록 합니다.

유전자 및 조직 특이적 인핸서를 선택하기 위한 웹 기반 워크플로우

이 프로토콜은 초기 인핸서 전사체를 정량화하기 위한 간소화된 계산 파이프라인을 제공합니다. 염색질 접근성, 염색질 특징 및 전사 데이터를 통합함으로써 복잡한 유전자 내 영역에서 인핸서 활성에 대한 정확한 검출 및 가닥 특이적 분석을 가능하게 하는 동시에 광범위한 생물정보학 교육 없이도 연구자가 접근할 수 있습니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 유전자 간/유전자 내 인핸서 RNA 정량화를 위한 계산 파이프라인

배우세요 Promoter Capture Hi-C를 활용하여 게놈 아키텍처가 유전자 발현을 조절하는 메커니즘을 규명하는 방법을. 이 기술은 비암호화 질병 변이체를 표적 유전자와 연결하여 치료적 통찰을 제공합니다.

발기인 캡처 안녕-c: 고해상도, 게놈 넓은 발기인 상호 작용의 프로 파일링

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