Name: 멀티-omic 토양 샘플의 분석을 위한 MPLEx 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 배우세요 토양 샘플에서 대사물질, 단백질, 지질을 동시에 추출하는 MPLEx 프로토콜을 사용한 멀티-오믹스 분석 방법을. 이 기술은 정확성을 높이고 준비 시간을 단축하여 토양 미생물 군집 연구에 효과적입니다.

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작가 네이 선 존슨 수치 준비에 그의 원조에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는 미국 에너지 부의 사무실의 생물학과 환경 연구 (게놈 과학 프로그램), 전환 (민트) 실험실 감독 연구 개발에 Microbiomes에 의해 투자 되는 팬-omics 프로그램에 의해 지원 되었다 퍼시픽 노스 웨스트 국립 연구소, 국가 연구소의 건강 국립 연구소의 환경 건강 과학 (R01 ES022190)에서 이니셔티브와 NIH (P42 ES027704). KEBJ는 R21 HD084788 개발 하 고 새로운 멀티-omic 추출 기법 검증 재정 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에는 W. R. 윌 환경 분자 과학 실험실 (EMSL), 미상 국가 과학적인 사용자 시설 평화로운 북 서 국립 연구소 (PNNL)에서 수행 되었다. PNNL은 Battelle 계약 드-AC06-76RL01830에서 DOE에 대 한 운영 하는 멀티 프로그램 국립 연구소 이다.

참고: 매우 젖은 토양 이전 효과에 손해 없이 추출 추출의 lyophilized 수 있습니다. 젖은 토양 또한 사용 될 수 있지만 특정 비율에 시 약을 추가할 때 고려해 야 합니다.
참고:이 좋습니다 추출, 두 50 mL 튜브 (최대 50 mL 튜브 당 10 g 토양) 사이 분할 한다 당 건조 한 토양 중량의 20 g을 사용 하 여. 추출 또는 사용 가능한 샘플에 따라 다름 아래로 확장할 수 있습니다.
참고: 건조 한 토양 샘플 균질 하 고 작은 뿌리와 바위를 제거 하기 위해 3 m m 스크린을 통해 sieved 될 수 있습니다. 샘플 화면에 붙어 얻을 것 이다 젖은 토양 샘플을 체질 하지 마십시오.
1. 토양 세포 세포의 용 해 및 대사, 단백질, 지질 (타이밍 ~ 1 d)의 추출
<ol><li>20 g 토양 샘플 당 메탄올/클로 프롬 호환 되는 두 개의 별도 50 mL 튜브에 10 g를 무게. 조심 선택, 튜브와 함께 클로 프롬 샘플 오염 대부분 플라스틱 거르는 것으로 합니다. 유리를 사용 하 여 언제 든 지 가능한 또는 플라스틱 튜브 폴 리 프로필 렌 또는 소계 (PTFE)에서 만든. 참고: 계속 멋진 얼음 토양 초기 무게 및 균질 단계 동안 가능한.</li>
	<li>각 튜브를 클로 프롬 씻어 스테인레스 스틸과 가닛 구슬의 10 mL를 추가 합니다. 얼음, 차가운 초순의 4 개 mL를 추가 물 (정화 시스템에 대 한 재료의 표 참조) 각 관 (2 개의 관 사이 한 샘플 분할)와 증기 두건으로 얼음 양동이에 샘플을 전송.</li>
	<li>25 mL 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 신속 하 게 얼음 처럼 차가운 2:1 클로 프롬: 메탄올 (v/v) 20 mL를 추가 합니다. 주의: 클로 프롬: 메탄올은 급성 잠재적 건강 영향: 피부 자극, 가능한 화학 화상, 및 호흡 체계에 자극. 그것은 신장, 간, 그리고 심 혼 영향을 미칠 수 있습니다. 적합 한 보호 안경, 의류, 장갑, 착용 하 고 항상 증기 두건에서 작동.</li>
	<li>솔루션으로 뚜껑과 소용돌이 조입니다. 2:1 choloroform:methanol 원핵생물의 세포 벽을 분해 하 고 또한 효소 활동은 합니다.</li>
	<li>50 mL 튜브 소용돌이 첨부 파일 및 수평 냉장고 안에 4 ° C에서 10 분에 대 한 소용돌이를 가능 하면 튜브를 연결 합니다. 다음, 그들을 완전히 진정 위해 ~ 15 분-80 ° C 냉장고 내부 샘플 장소.</li>
	<li>30에 대 한 진폭 60%에서 6 m m (1/4") 프로브 각 샘플을 sonicate 증기 두건 안쪽 프로브 sonicator를 사용 하 여 s 각 얼음에. 주의:이 좋습니다 sonicating 동안 인클로저 및 귀 보호를 감소 시키고 소리를 사용 하 여. 높은 전압은 전원 공급과 높은 주파수 케이블에. 액티브 프로브; 하단 또는 샘플 용기 측면을 만지지 마십시오 그것은 균열 또는 플라스틱을 녹여 수 있습니다.</li>
	<li>많은 열을 생성할 수 있습니다 sonicating 샘플 ~ 15 분,-80 ° C 냉장고에 놓습니다.</li>
	<li>1.5-1.7 단계를 반복 합니다. 참고: 샘플 세포 절차 동안 차가운 체재 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>5 분, 4 ° c.에 대 한 4000 x g에서 샘플을 원심 이 시점에서, 샘플 위 대사 산물 레이어, 단백질 interlayer 낮은 지질 층 (및 나머지 파편 펠 릿)으로 구분 됩니다. 그림 1을 참조 하십시오.</li>
	<li>샘플 얼음 양동이에 얼음에 놓고, 증기 두건 및 10 mL 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 내부 레이어를 제거는 위 대사 산물 2 50 mL 튜브에서 하나의 큰 유리 유리병에. 참고: 피할 피 펫;으로 단백질 층의 발음 필요한 경우 대사 산물의 작은 레이어를 남겨 주세요.</li>
	<li>약간 틸트 되도록 낮은 지질 층에 무료 부동 단백질 interlayer 출시 50 mL 튜브. 특 종 단백질 interlayers의 둘 다 신중 하 게 깨끗 한 스테인리스 플랫 헤드 랩 주걱을 사용 하 고 하나의 새로운 50 mL 튜브에 함께 넣어.</li>
	<li>25 mL 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 하나의 대형 유리 유리병으로 낮은 지질 레이어를 제거 합니다. 참고: 주목 받는 토양 입자;을 피하려고합니다 그러나 일부 토양 파편 및 입자와 함께 갈망 하는, 지질 나중에 제거 됩니다.</li>
	<li>대사 산물 및 지질 위에 숨 막 유리 튜브와 건조까지 진공 집중 장치에 건조 장소 (지질 ~ 4-5 h metabolites 하룻밤).</li>
	<li>단백질 샘플 튜브를 나머지 파편 펠 렛 튜브 각 얼음 메탄올과 소용돌이의 20 mL를 추가 합니다. 이것은 클로 프롬 그것을 던지기 전에 파편의 어떤 가능한 남은 단백질을 solubilize 하려고 하기 전에 씻어 하 파편 펠 릿에 이루어집니다.</li>
	<li>원심 분리기 파편 펠 릿 및 단백질에 5 분, 4 ° C, 4000 x g interlayer 다음 증기 두건 안쪽 유해 폐기물 컨테이너에 메탄올을 가만히 따르다</li>
	<li>액체 질소에 단백질 및 파편 펠 릿을 동결 하 고 (와 함께 수집가 온도-98 ° C의 매우 낮은 어는 점 데 메탄올 때문-105 ° C의) lyophilizer에서 건조 ~ 2 시간. 참고: 않습니다-건조 하지 펠 릿로 그들은 solubilize 더 어려울 것 이다.</li>
	<li>단백질 중간층 튜브 및 파편 펠 릿의 각각에 20 mL의 단백질 가용 화 버퍼 (4 %SDS, 50 mM tris 버퍼, pH 8.0에서에서 100 m m DTT (DL-dithiothreitol); 보십시오 보충 시 설정) 10 mL를 추가 합니다. 주의: SDS 급성 독성 원인과 가연성 이다. 그것은 피부, 눈, 그리고 기도 자극입니다. 장갑, 안전 안경 착용.</li>
	<li>증기 두건에서 프로브 sonicate 30 20% 진폭에서 샘플 솔루션에 그들을가지고 s. 2 분 동안 소용돌이입니다.</li>
	<li>단백질 중간층 샘플을 solubilize 단백질을 300 rpm, 50 ° C에서 30 분 동안 실험실 관 회전에 넣으십시오.</li>
	<li>가로로 소용돌이 추가 10 분 모든 나머지 그대로 세포를 lyse 파편 샘플 다음 회전 나머지 20 분 단백질 중간층 샘플.</li>
	<li>10 분, 실 온 (RT), 4500 x g에서 샘플의 모든 원심 고 두 50 mL 튜브 각 튜브 샘플 당에서 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>가용 화 10 mL 단백질 중간층 펠 릿에 버퍼 sonicate 그리고 소용돌이 이전과 솔루션 및 원심 분리기에 다시 추가 합니다.</li>
	<li>똑같이 두 50 mL 튜브는 supernatants를 결합 하 고 8000 x g 10 분, 고정된 각도 양동이 터에 4 ° C에서 원심. 참고: 최종 원심 분리는 과도 한 오염 humic 물질을 제거 하는 데 필요한.</li>
	<li>각 30 mL 되도록 두 50 mL 튜브는 supernatants를 가만히 따르다. 그런 다음, 각 튜브를 TCA (trichloroacetic 산)의 7.5 mL를 추가 10 mL 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여. 솔루션으로 소용돌이입니다. 이것은 20 %TCA 각 30ml 샘플에서 (조절), 주의: TCA는 부식성, 독성 및 5 월 피부 화상을 일으킬. 장갑, 안전 안경 착용.</li>
	<li>하룻밤에 2 h-20 ° C 냉동 실에 샘플을 놓습니다. 참고: 단백질 일반적으로 1 시간 이내 침전 됩니다 하지만 왼쪽 하룻밤 (18 h까지) 될 수 있습니다. 참고: TCA 추출 단백질의 가능한 산 성 가수분해 때문 18 h 이상가 게 하지 마십시오. 샘플을 동결 하는 경우 얼음;에 녹여 샘플을 thaw 과거 워밍업 하지 마십시오.</li>
	<li>침전 된 단백질 펠 렛, 원심 4500 x g 10 분, 4 ° C에서 샘플 하 고 폐기물에는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>1 개의 관으로 각 단백질 펠 릿, 소용돌이 및 펠 릿 처럼 조합 100% 얼음 아세톤 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>원심 관 (를 사용 하 여 균형), 결합 된 펠 릿을 포함 하 고 폐기물에는 상쾌한을 가만히 따르다. 주의: 아세톤 호흡기 및 피부와 눈 자극, 발생할 수 있습니다 고 인화성 액체와 증기 이다. 증기 두건에서 작동, 안전 안 경과 장갑과 실험실 외 투를 착용 하십시오.</li>
	<li>두 번 아세톤 2 mL 튜브 5 분 10000 x g에서 마지막 스핀에 대 한 마지막 전송의 1.5 mL를 사용 하 여 펠 릿을 세척.</li>
	<li>폐기물에는 상쾌한 가만히 따르다 고 건조 펠 릿 거꾸로 연기 후드 ~ 20 분 또는 질소 스트림 아래에 종이 지우기에는 펠 릿 약간 균열 시작 될 때까지.</li>
	<li>펠 릿의 크기에 따라 단백질 가용 화 버퍼의 100-200 µ L를 추가 합니다. 참고: 가능한 샘플에 추가 가용 화 버퍼의 볼륨을 유지. 이후 필터 지원 샘플 준비 (FASP) 열; 당 solubilized 샘플의 50 μ까지 사용할 수 있습니다. 어떤 더 분할할 여러 FASP 열 수 있어야 합니다.</li>
	<li>Sonicate와 소용돌이 솔루션으로 펠 릿. 참고 샘플 humic 물질 후속 원심 분리와 제거 될 것 이다 단백질 함께 계기 인 점도 있을 수 있습니다.</li>
	<li>솔루션으로 단백질을 solubilize 단백질 소화를 진행 하는 샘플 300 rpm, 40 ° C에서 30 분 동안 인큐베이터/셰이 커에 흔들어.</li>
	<li>스냅은 단백질 소화에 대 한 준비까지 액체 질소와-80 ° C 냉동 고가 게에서 샘플을 동결.</li>
</ol>2. 지질 준비 (타이밍 ~ 20 분)
<ol><li>지질 샘플 건조 되 면, 추가 솔루션으로 소용돌이 및 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 유리병을 2:1 클로 프롬: 메탄올의 200 μ 유리에 추가 200 μ 추가 유리병, 소용돌이 나머지 지질 플라스틱 튜브에 전송.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 12000 x g에서 샘플에서 파편을 원심</li>
	<li>LC-MS/MS 분석 (LC-MS/MS 보충 방법에 대 한 추가 정보)까지 상쾌한 유리 지질 유리병-20 ° C에서 저장소로 전송 합니다.</li>
	<li>샘플 준비 후 즉시 분석 될 수 없습니다, 경우 지질 산화와 저하를 방지 하기 위해-20 ° C에서 용 매에 저장 될 필요가 있다.</li>
</ol>3. 대사 산물 준비 및 Derivatization (타이밍 ~ 5 h)
<ol><li>추출 다음 날 속도 Vac에서 대사 산물 샘플을 제거 하 고 derivatization 및 GC 분석에 대 한 준비까지-20 ° C에서 건조 저장 합니다. 그렇지 않다면 다음 악기에 대 한 적절 한 프로토콜을 사용 하 여 준비를 GC에는 대사 산물을 실행.</li>
	<li>GC 분석에 대 한 대사 산물을 derivatizing, 직전 양도할 대형 유리 튜브에서 메탄올, vortexing 및 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 추가 200 μ를 추가 하 여. 한 번 반복 합니다.</li>
	<li>12000 x g 10 분, 4 ° c.에 관을 원심 작은 유리 튜브에는 상쾌한 전송, 추가 숨 막 상단에 속도 Vac에서 완전히 건조.</li>
	<li>샘플 유리병 및 30에 대 한 소용돌이에 methoxyamine 솔루션의 20 µ L을 추가 하 여 metabolites derivatize 중간 속도로 vortexer에 s. 주의: Methoxyamine 염 심한 화상과 눈에 심각한 손상의 원인, 과민성 피부 접촉에 의해 발생할 수 있습니다. 안전 안경, 장갑, 실험실 외 투를 착용 하 고 증기 두건에서 작동.</li>
	<li>목욕 sonicator를 사용 하 여 샘플 완전히 용 해 되도록.</li>
	<li>결로 예방 뚜껑 1000 rpm 떨고 1 h 30 분 동안 37 ° C에서 유지는 인큐베이터에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>반전 유리병 뚜껑 표면에 응축 된 방울과 샘플을 섞어 한 번. 1 분, 실시간 1000 x g에 아래로 샘플을 회전</li>
	<li>(주사기를 사용 하 여) 하는 80 µ L n 추가 하 여 수행 하는 silylation-메 틸-N-(trimethylsilyl) 1 %trimethylchlorosilane trifluoroacetamide. 10 초에 대 한 소용돌이입니다. 주의: MSTFA + 1 %TMCS 피부 부식, 심각한 눈 손상, 및 특정 표적 장기 독성을 일으킬 수 있습니다 고 인화성 액체와 증기 이다. 안전 안경, 장갑, 실험실 외 투를 착용 하 고 증기 두건에서 작동.</li>
	<li>30 분 동안 37 ° C에서 흔들어 1000 rpm 유지 응축 방지 뚜껑 인큐베이터에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>반전 유리병 뚜껑 표면에 응축 된 방울과 샘플을 섞어 한 번.</li>
	<li>2000 x g, 실시간에 5 분 동안 아래로 샘플을 회전</li>
	<li>GC-MS 분석에 대 한 적절 한 튜브에 반작용된 솔루션을 전송 합니다.</li>
</ol>4. 단백질 소화 (타이밍 ~ 1 d)
<ol><li>5 분, RT, 작은 어떤 파편 든 지를 위한 15000 x g에서 샘플 원심</li>
	<li>필터 원조 샘플 준비 (FASP) 수행 FASP를 사용 하 여 소화 키트 ( 재료의 표참조) 다음 제조 업체의 지침31,32수정:<ol>
<li>8 M 요소 버퍼의 400 μ FASP 열 (500 μ 30 K MWCO 스핀 필터)에 추가 합니다.</li>
		<li>샘플 centrifuging 완료 되 면, 상쾌한 (삭제는 펠 릿)에서 플라스틱 고 8 M 요소는 열에서의 400 μ에 샘플의 최대 50 μ를 추가 합니다. 참고: 추가 열 당 샘플의 최대 50 μ. 50 μ 샘플의 경우 여러 열을 사용 하 고 소화 후에 펩 티 드 결합. 이 볼륨을 가능한 한 낮게 떠날 것이 좋습니다 (30 µ L 이상적 이다)는 FASP를 보장 하기 위해 열 것입니다 모두 제거 SDS 극적으로 질량 spec 분석을 방해할 수 있습니다.</li>
		<li>열 포함된 1.5 mL 튜브에 놓고 30 분, 실시간 14000 x g에서 샘플을 원심</li>
		<li>낭비로 통해 흐름 제거 하 고 열에 8m 우 레 아의 400 μ를 추가 하 고 다시 원심.</li>
		<li>한 번 더 3 요소 린스의 총에 대 한 이전 단계를 반복 합니다. 참고: 샘플은 열에 건조 가까이 있는지 확인 하십시오 어떤 경우 보다 더 ~ 각 스핀 후 필터에 남아 있는 30 µ L centrifuging 계속.</li>
		<li>20 분 14000 x g에서 50mm NH4HCO3 와 원심 분리기의 400 μ를 추가 하 고 폐기물을 버리고 한 번 반복.</li>
		<li>깨끗 한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 열을 전송.</li>
		<li>트립 신 소화 버퍼의 75 μ는 열을 추가 하 고 750 rpm에서 결로 방지 뚜껑 인큐베이터에서 3 h 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>열에 50mm NH4HCO3 40 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>14000 x g 15 분 열 위에 높은 분자량 오염 물질을 유지 하면서 튜브에는 펩 티 드를 수집에서 샘플 원심</li>
		<li>열 및 원심 분리기를 50mm NH4HCO3 40 μ를 다시 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>열, 튜브 ~ 30 µ L, 및 BCA 분석 결과 (Bicinchoninic 산 성 단백질 분석 실험 키트, 참조 테이블의 자료) 속도 Vac에 펩 티 드 다운 건조는 펩 티 드.</li>
	<li>SDS 오염 (보이는 거품)33의심 되는 경우 필요에 따라 정리 단계를 수행 합니다. 고체 상 추출이이 옵션을 선택 하는 경우에 이후에 수행 되어야 합니다. 이 정리 방법에 대 한 자세한 내용은 보충 방법에서 이용하실 수 있습니다.</li>
	<li>MS 분석을 위한 샘플을 희석 하거나 선택적으로 HPLC 분류 (다음 두 단계)에.
</li>
	<li>충분치, 10 m m 염화 편대 버퍼 (pH 10.0) 400 µ L의 볼륨 샘플을 희석.</li>
	<li>C18 열에 해결 ( 재료의 표참조) 0.5 mL/min HPLC 시스템을 사용 하 여 모바일 단계 (A) 10 mM 암모늄 편대, pH 10.0와 (B)에서 10 m m 염화 편대, pH 10.0/이기 (10:90)을 구분 하 여.<ol>
<li>최소 10 ~ 70, 65 %A 분 70 ~ 85, 30 %A 분 85 ~ 95 이상에서 유지 이상 30 %A 통해 100% A 95 %A 처음 10 분, 95 %A 65 %A 그라디언트를 조정 합니다.</li>
		<li>다시 분 95 105 이상 100% A equilibrate 누르고 100 %A 120 분까지 있습니다.</li>
		<li>분수 모든 1.25 분 (96 분수 전체 그라데이션 이상의)를 수집 하 고 마지막으로 12 샘플 또는 24 샘플에 대 한 다른 모든 행의 총에 대 한 모든 행을 결합 (각각 n = 8 또는 n = 4 분수 풀링된).</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 분수 진공에서 건조 하 고 LC-MS/MS 분석까지-20 ° C에서 스토리지에 대 한 각 초순의 15 µ L를 추가 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

그것은 특정 방법, 예를 들어 세포 단계, 적응 시킬 수 있다 그래서 모든 실험실 같은 사용 가능한 장비 해야한다 참고 해야 합니다. 그러나 여기 우리 사용 vortexing sonicating, 큰 50 mL 비드 때리는 사용 하 여 작동 합니다. Lyophilizer-105 ° C의 온도 수집기와 사용할 수 없는 경우 샘플 질소 스트림 아래 건조 수 있습니다. 또한 토양 유형을 크게 다르며 모래, 갯벌, 찰 흙,이 탄, 및 옥 토 (등), 포함 될 수 있습니다 그리고 그들은 또한 pH, 염 분, 유기 물 풍부에 따라 달라질 수 있습니다. 유연 하 고 필요할 때 조정 하는 것이 중요 하다 그래서 각 이러한 차이 프로토콜에 영향을 가질 수 있습니다. 그러나 그것은 중요 한,, 그 비율 및 백분율 동일 하 게 유지입니다.
MPLEx 프로토콜 수많은 생물 및 환경 시스템 및 토양 미생물 지역 사회의 멀티-omic 분석을 활성화 하는 기능에서 응용 프로그램에 대 한 큰...

토양 미생물 지역 사회 평가 탄소 순환, 기후 변화를 이해 하기 위한 중요 한 의미를 갖는다. 그러나 최근 연구는 어려움을, 다양 한 토양 유형 microbiota에 대 한 시퀀스 게놈의 부족 및 감지 하는 단백질의 많은 것의 알 수 없는 기능 등을 강조 했다. 이러한 도전 결과1,,23현재까지 알려진 가장 복잡 한 미생물 지역 사회 토양 때문. 멀티-omic 분석, metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic 연구에서 결과 결합 하는 최근 미생물 존재, 동안에 더 큰 이해를 얻기 위해 수많은 토양 연구에서 구현 되었습니다. 때문에 환경 섭1,,45분자 변화에 대 한 포괄적인 정보를 얻는. 멀티-omic 연구와 함께 한 가지 문제는 질량 분석 (MS)-기반으로 metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic 측정은 일반적으로 각 omic MS 호환6,7 에 대 한 특정 추출 과정 필요 , 8 , 9.이 정확한 절차 확인의 구현을 매우 어렵거나 불가능 한 때 샘플의 한정 된 수량만 사용할 수. 이러한 과제는 우리 동시 대사 산물, 단백질 및 지질 추출 (MPLEx) 방법 작은 샘플 볼륨 또는 대 중을 사용 하 여 정확도 개선 하 고 제공 하는 모든 3 개의 분석에 대 한 빠른 샘플 준비 조사를 자극합니다 10. 데이트 하 고, 이러한 목표를 모두 달성할 수 있는 대체 토양 추출 절차가 필요 하지 않습니다.
글로벌 멀티-omic 단일 토양 샘플의 분석을 사용 하려면 클로 프롬, 메탄올, 물 분판 기반으로 하는 유기 용 매 추출 프로토콜 사용된10이었다. 이 메서드는 원래 총 지질 기사9,11 에 대 한 개발 및 최근에 단일 샘플12,13 에서에서 대사 산물, 단백질과 지질 동시 추출에 대 한 개정 했다 14,15,16,17,18,19,20,,2122, 23,,2425,26,27,28,29,30, 적은 샘플 수량을 사용 하 고 실험적 변화10. MPLEx 프로토콜에서 클로 프롬은 별개 조각으로 샘플 성분의 triphasic 화학 별거를 위한 기초를 제공 하는 물과 혼합할 수 있는. 최고 수성 단계 따라서 친수성 대사, 단백질 디스크 그리고 지질 층 하단 클로 프롬 단계 (그림 1)에서 다음을 포함 합니다. MPLEx 대부분 토양에 적용 될 때 미 립 자 파편 샘플링 튜브의 맨 아래에 축적 하 고 모든 레이어는 수집 된 후 삭제 될 수 있습니다. 그러나 각 토양 유형 다를 수,, 및이 탄 등 높은 유기 토양, 토양 파편 중간 계층에 샘플링 튜브의 바닥에 떨어지지 않습니다. MPLEx 1) 작은 샘플 양이 멀티-omic 분석, 2) 멀티-omic 기사 같은 샘플 감소에서 사용 될 수 있습니다와 같은 동일한 샘플에서 유형 여러 분자를 분리 하면 몇 가지 장점이 제공 전반적인 실험 가변성, 그리고 샘플의 3) 큰 숫자 높은 처리량 연구10훨씬 더 빨리 준비 될 수 있습니다. 함께 이러한 혜택은 토양 샘플 및 그들의 복잡 한 미생물 지역 사회를 평가 하기 위한 더 나은 측정 기능을 제공 하기 위한 중요 합니다.

<table><tbody><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>650498</td><td>-20°C에 보관됩니다. C ! 주의: 클로로포름은 급성 잠재적인 건강 영향, 피부 자극 및 가능한 화학적 화상, 호흡기 계통 자극, 신장, 간, 심장에 영향을 미칠 수 있습니다. 적절한 보호 안경, 의복 및 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td>은 <td>-20°C에 보관됩니다. C ! 주의: 메탄올은 호흡기, 피부 및 눈 자극을 유발할 수 있으며 신경, 신장 및 간을 손상시킬 수 있습니다. 적절한 보호 안경, 의복 및 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>Millipore</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>정수 시스템의</td> 정제수.</tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>L6026</td><td>! 주의: SDS는 급성 독성을 일으키며 가연성입니다. 피부, 눈 및 기도에 자극을 줍니다. 장갑과 보안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>토양 단백질 추출 키트</td><td>MoBio, NoviPure 토양 단백질 추출 키트, Qiagen</td><td>30000-20</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>1M Trizma HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2694</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td>! 주의: TCA는 부식성, 독성이 있으며 피부 화상을 유발할 수 있습니다. 장갑과 보안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마-알드리치</td><td>650501</td><td>-20°C에 보관됩니다. C ! 주의: 아세톤은 호흡기와 피부 및 눈 자극을 유발할 수 있습니다. 가연성 액체 및 증기. 보안경, 장갑, 실험복을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>우레아</td><td>시그마-알드리치</td><td>208884</td><td>! 주의: 요소는 눈과 피부에 자극을 주므로, 장갑과 안전 안경을 사용하십시오</td></tr>. <tr><td>암모늄 바이카보네이</td>트 <td>플루카</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>프로메가</td><td>V528A</td><td>20&마이크로; g 바이알</td></tr><tr><td>, Bicinchoninic acid protein assay kit</td><td>, Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr>, <tr><td>Ammonium Formate</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>09735</td><td></td></tr>, <tr><td>Acetonitrile</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td>! 주의: 아세토니트릴은 피부와 눈을 자극합니다. 가연성이 높습니다. 장갑과 보안경을 착용하십시오. 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>트리 플루오로 아세트산</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>T6508</td><td>! 주의: TFA는 피부 접촉, 눈 접촉, 섭취 및 흡입 시 매우 위험합니다. 특히 눈, 입 그리고 기도의 점막에 조직 손상을 일으킬 수 있습니다. 피부에 닿으면 화상을 입을 수 있습니다. 장갑, 실험복, 보안경을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>메톡시아민 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>226904</td><td>! 주의: 메톡시아민 염산염은 심한 화상과 눈에 심각한 손상을 일으키며 피부 접촉에 의해 과민성을 유발할 수 있습니다. 보안경, 장갑 및 실험복을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>피리딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>270970</td><td>! 주의: 피리딘은 피부와 눈에 자극을 일으키고 중추 신경계를 억제할 수 있습니다. 증기는 섬광을 일으킬 수 있습니다. 보안경, 장갑 및 실험복을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>N-메틸-N-(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드와 1% 트리메틸클로로실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>69478</td><td>! 주의: MSTFA + 1% TMCS는 피부 부식, 심각한 눈 손상 및 특정 표적 장기 독성을 유발할 수 있습니다. 가연성 액체 및 증기. 보안경, 장갑 및 실험복을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 정수 시스템</td><td>Millipore</td><td></td><td>모델 MPGP04001</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex Genie 2</td></tr><tr><td>프로브 초음파 발생기</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>모델 FB505</td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>모델 5810R</td></tr><tr><td>50mL 튜브 스윙 버킷 로터</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td>50mL 고정각 로터</td><td>Eppendorf</td><td>FA-45-6-30</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>OHAUS</td><td></td><td>모델 V22PWE150IT</td></tr><tr><td>혈청학 피펫 컨트롤러</td><td>Eppendorf</td><td>12-654-100</td><td></td></tr><tr><td>10mL, 25mL 유리 혈청학 피펫</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-27F, 13-678-36D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer Thermotop</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015 포함, 5308000003</td><td></td></tr><tr><td>0.9 &ndash; 2.0 mm 블렌드 스테인리스 스틸 비드</td><td>NextAdvance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>0.15 mm 가넷 비드</td><td>MoBio</td><td>13122-500</td><td></td></tr><tr><td>자석 교반 플레이트</td><td>FisherBrand</td><td>11-100-16SH</td><td></td></tr><tr><td>자석 교반 바</td><td>FisherBrand</td><td>14512130</td><td></td></tr><tr><td>pH 종이 스트립, pH 범위 0&ndash; 14</td><td>FisherBrand</td><td>M95903</td><td></td></tr><tr><td>15mL, 50mL 원추형 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103 21-108</td><td>클로로포름 호환</td></tr><tr><td>50mL 와류 부착</td>물 <td>MoBio</td><td>13000-V1-50</td><td></td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>FisherBrand</td><td>02-591-44</td><td></td></tr><tr><td>27.25x70mm 유리 바이알</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>호흡 더 쉬운 플레이트 멤브레인</td><td>Midwest Scientific</td><td>BERM-2000</td><td></td></tr><tr><td>알코올 와이프</td><td>Diversified Biotech</td><td>BPWP-1000</td><td></td></tr><tr><td>히터 셰이커 인큐베이터</td><td>벤치 마크, Incu-Shaker 미니</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아날로그 로티 세리 튜브 로테이터</td><td>SoCal BioMed, LLC</td><td>82422001</td><td></td></tr><tr><td>필터 지원 샘플 준비 키트</td><td>FASP; Expedeon</td><td>44250</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>Biotek, EPOCH-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>섭씨 20도 냉동고</td><td>Fisher</td><td>13986149-80</td><td></td></tr>도 <tr><td>섭씨 냉동고</td><td>스털링 초저온</td><td>SU78OUE</td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive 이온 트랩 질량 분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7890A 기체 크로마토그래프와 단일 사중극자 결합 5975C 질량분석기</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velo</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters NanoEquityTM UPLC 시스템</td><td>Millford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250mL 미디어 병</td><td>FisherBrand</td><td>1395-250</td><td></td></tr><tr><td>Waters 바이알</td><td>Waters</td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>Glass MS 시료 바이알 및 인서트</td><td>MicroSolv</td><td>9502S-WCV, 9502S-02ND</td><td></td></tr><tr><td>Glass HPLC 바이알 및 스냅 캡</td><td>MicroSolv</td><td>9512C-0DCV, 9502C-10C-B</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 96웰 플레이트</td><td>Agilent</td><td>5042-6454</td><td></td></tr><tr><td>대형 유리 바이알 27.25x70mm</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>동결건조기</td><td>Labconco</td><td>7934021</td><td></td></tr><tr><td>광택 스테인리스강 납작머리 주걱</td><td>Spoonula; FisherBrand</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>Kim 와이프</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34721</td><td></td></tr><tr><td>XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 &mu; M with 4.6x20 mm guard column</td><td>Waters</td><td>186003117, 186003064</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1380-90000</td><td></td></tr><tr><td>1.7mL 원심분리기 튜브</td><td>Sorenson</td><td>11700</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 유리 주사기, 5mL, 50&micro; L 및 250&micro; L</td><td>Hamilton</td><td>81517, 80975, 81175</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 전구</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z111597</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Branson 1800 초음파 세척기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 원심 분리기</td><td>Labconco Centrivap 내산성 농축기 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin 컬럼, C18 실리카</td><td>둥지 그룹</td><td>SEM SS18V</td><td></td></tr></tbody></table>

멀티-omic 토양 샘플의 분석을 위한 mplex 프로토콜

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

질량 분석 (MS)-기반된 통합된 metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic (멀티-omic) 연구 우리의 능력을 이해 하 고 환경 및 생물 학적 시스템에서 미생물 지역 사회 특성을 변형 시키고 있다. 이러한 측정도 가장 복잡 한 토양 미생물 커뮤니티의 향상 된 분석 사용 하 고 있습니다 현재까지 알려진 복잡 한 미생물 시스템. 그러나 멀티-omic 분석,, 있다 샘플 준비 과제, 별도 기사는 일반적으로 매우 준비 시간과 필요한 샘플의 양을 증폭 각 omic 연구를 위해 필요 하기 때문. 이 한계를 해결 하기 위해 3-에서-1 방법 같은 토양 샘플에서 대사, 단백질, 지질 (MPLEx)의 동시 추출 용 매 기반 접근을 적응 하 여 만들었습니다. 이 MPLEx 프로토콜은 모두 간단 하 고 많은 샘플 유형에 대 한 강력한 복잡 한 토양 샘플의 한정 된 수량에 대 한 활용 하는 경우에 입증 되었습니다. MPLEx 메서드는 또한 크게 생물학과 환경 물결 따라 변화를 평가 하는 동안 각 미생물 커뮤니티의 구성원의 더 나은 이해를 얻기 위하여 필요한 급속 한 멀티-omic 측정을 사용할 수 있습니다.

MPLEx 프로토콜은 캔자스 네이티브 대초원 토양 (Mollisol 토양)에서 분자를 추출 하는 데 사용 됩니다, triplicate 분석 3376 펩 티 드, 105 지질 및 102 극 대사 (모든 고유 식별)에 대 한 결과 제공. 반면 MPLEx 프로토콜 지질과 대사 산물12,13,14,15,,1617,18의 일반적인 추출 잘 설립 되었습니다 ,19,<sup class="x...

프로토콜은 동시에 하나의 토양 샘플에서 대사 산물, 단백질과 지질을 추출, 감소 샘플 준비 시간 허용 및 한정 된 수량으로 샘플의 멀티-omic 질량 분석 분석을 활성화에 대 한 제공 됩니다.

멀티-omic 토양 샘플의 분석을 위한 MPLEx 프로토콜

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

이 방법은 단백질체학, 대사체학 및 지질체학 분야에서 사용되며, 환경 교란으로 인해 토양 관련 미생물 군집에서 발생하는 분자 변화에 대한 포괄적인 정보를 얻는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 토양 샘플에서 여러 분석물을 얻을 수 있어 정밀도와 정확도가 높아지는 동시에 샘플 준비 시간과 노력이 줄어든다는 것입니다. 먼저 각 20g의 토양 샘플에 대해 10g의 무게를 두 개의 별도 50ml 메탄올/클로로포름 호환 튜브에 넣습니다.클로로포름은 대부분의 플라스틱을 침출시켜 샘플을 오염시키므로 PTFE로 만든 플라스틱 튜브를 사용하십시오. 각 튜브에 약 10ml의 클로로포름 세척 스테인리스 스틸과 석류석 구슬을 추가합니다. 그런 다음 얼음 위에서 각 튜브에 4ml의 차가운 초순수를 넣고 얼음 양동이에 담긴 샘플을 흄 후드로 옮깁니다.25ml 유리 혈청학 피펫을 사용하여 20ml의 얼음처럼 차가운 2:1 클로로포름을 튜브에 메탄올 부피/부피에 빠르게 첨가합니다. 뚜껑을 조이고 토양 혼합물을 용액으로 와류로 만듭니다. 클로로포름-메탄올은 원핵생물의 세포벽을 파괴하는 데 도움이 되며 효소 활동도 비활성화합니다.다음으로, 튜브를 50밀리리터 튜브 와류 부착물에 부착하고 가능하면 냉장고 내부에서 섭씨 4도에서 10분 동안 수평으로 와류를 사용합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 80도의 영하 냉동고에 약 15분 동안 넣어 완전히 식힙니다. 그런 다음 흄 후드 내부의 프로브 초음파 발생기를 사용하여 얼음 위에서 30초 동안 60% 진폭의 6mm 1/4인치 프로브로 각 샘플을 초음파 처리합니다.초음파 처리 후 초음파 처리는 많은 열을 발생시킬 수 있으므로 샘플을 섭씨 80도의 음의 냉동고에 넣습니다. 수평한 와류, 초음파 처리 및 어는 단계를 반복한 후에, 5 분 동안 4의, 000배 중력 및 4 섭씨 온도에 표본을 분리기. 이 시점에서 샘플은 상부 대사산물층, 단백질 중간층 및 하부 지질층으로 분리됩니다.샘플을 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 흄 후드 내부에서 10ml 유리 혈청학 피펫을 사용하여 두 개의 50ml 튜브에서 하나의 큰 유리 바이알로 상부 대사 산물 층을 옮깁니다. 이제 50ml 튜브를 약간 기울여 단백질 중간층을 방출하여 하부 지질층에서 자유롭게 떠다니도록 합니다.그런 다음 깨끗한 스테인리스 스틸 플랫 헤드 실험실 주걱을 사용하여 두 단백질 중간층을 조심스럽게 떠서 하나의 새로운 50ml 튜브에 함께 넣습니다. 25ml 유리 혈청학 피펫을 사용하여 하부 지질층을 하나의 큰 유리 바이알로 옮깁니다. 파편이 있는 두 개의 튜브와 단백질 중간층이 있는 하나의 튜브에 얼음처럼 차가운 메탄올 20ml를 추가합니다.짧게 와류를 일으키고, 5 분 동안 4의, 000배 중력 및 4 섭씨 온도에 파편 펠릿 및 단백질 interlayer를 분리기화하십시오. 그런 다음 메탄올을 흄 후드 내부의 유해 폐기물 용기에 넣습니다. 단백질과 파편 알갱이를 액체 질소로 얼리고 동결 건조기에서 약 2시간 동안 건조시킵니다.각 파편 펠릿에 50밀리몰 트리스 완충액, pH 8.0에 20ml의 단백질 가용화 완충액을 추가하고 단백질 중간층 튜브에 10ml를 추가합니다. 흄 후드에서 프로브는 30초 동안 20% 진폭으로 샘플을 초음파 처리하여 용액으로 가져옵니다. 2분 동안 샘플을 소용돌이칩니다.그런 다음 단백질 중간층 샘플을 섭씨 50도의 실험실 튜브 회전기에 30분 동안 넣어 단백질을 용해시킵니다. 잔해 샘플을 추가로 10분 동안 수평으로 와류로 회전시켜 남아 있는 손상되지 않은 세포를 용해합니다. 그런 다음 나머지 20분 동안 단백질 중간층 샘플로 회전합니다.10 분 동안 실온에서 4, 500 배 중력으로 모든 샘플을 원심 분리하고 샘플 당 각 튜브에서 상등액을 두 개의 50 밀리리터 튜브로 수집합니다. 단백질 중간층 펠릿에 10ml의 가용화 완충액을 추가합니다. 그런 다음 펠릿을 용액으로 다시 초음파 처리하고 와류로 만듭니다.분리기 다음, 동등하게 파편 펠릿 상등액을 가진 2개의 50 밀리리터 관으로 상층액을 결합하고, 어떤 잔여 파편든지 펠릿 펠릿 하기 위하여 10 분 동안 8, 000 시간 중력 그리고 4 섭씨 온도에 조정 각 물통 회전자에 있는 관을 분리기로 만드십시오. 상등액을 두 개의 50ml 튜브로 나눕니다. 그런 다음 10ml 유리 혈청학 피펫을 사용하여 각 튜브에 7.5ml의 TCA를 추가합니다.샘플을 용액으로 와류로 만듭니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 20도의 음의 냉동고에 2시간에서 하룻밤 동안 넣습니다. 침전된 단백질을 펠릿으로 만들기 위하여는, 10 분 동안 4, 500배 중력 및 4 섭씨 온도에 표본을 원심 분리하고, 폐기물로 상등액을 경사로 기울입니다.각 단백질 펠릿에 100% 얼음처럼 차가운 아세톤 10ml를 첨가합니다. 튜브를 소용돌이치고 펠릿처럼 하나의 튜브로 결합하십시오. 원심분리기를 사용한 다음 아세톤을 디캔팅합니다.더 적은 양의 아세톤을 사용하여 펠릿을 두 번 세척하고 최종 회전을 위해 서스펜션을 1.5 또는 2밀리리터 튜브로 옮깁니다. 상층액을 폐기물로 디캔팅하고 펠릿을 흄 후드의 종이 닦음에 거꾸로 건조시켜 약 20분 동안 기다립니다. 펠릿의 크기에 따라 단백질 가용화 완충액 100-200 마이크로 리터를 첨가하십시오.펠릿을 용액으로 초음파 처리하고 와류로 만듭니다. 샘플은 단백질과 함께 침전되는 부식 물질로 인해 점성이 있을 수 있으며, 이는 후속 원심분리로 제거됩니다. 마지막으로, 인큐베이터 또는 셰이커에서 30분 동안 300rpm 및 40°C의 온도에서 샘플을 흔들어 단백질을 용액으로 용해시킨 후 단백질 분해를 진행하거나 향후 처리를 위해 급속 동결합니다.이 비디오에서 시연된 MPLEx 프로토콜을 사용하여 캔자스 천연 대초원 토양에서 3, 376개의 펩타이드, 105개의 지질 및 102개의 극성 대사 산물을 추출했으며, 프로토콜의 단백질 추출을 역상 LC-MS/MS를 사용한 단백질 추출 키트 및 SDS 추출과 비교합니다. 상업적인 단백질 적출 장비 및 SDS 방법의 3개의 반복을 처음에 비교할 때, 단지 펩티드의 12%만이 2개의 기술 사이에서 겹쳤으며, 이는 미생물 군집의 복잡성과 다른 추출 효과를 보여주었습니다. MPLEx를 상용 단백질 추출 키트 및 SDS 추출물과 비교한 결과, MPLEx 방법을 사용하여 관찰된 펩타이드의 약 38%가 SDS 및/또는 상용 키트 추출을 사용할 때도 검출되었습니다.캔자스 토양 박테리아 군집의 종 수와 메타게놈을 고려할 때 펩타이드 식별의 중복은 합리적입니다. 여기에서 볼 수 있듯이 MPLEx 접근법의 광범위한 적용 가능성은 이전에 고세균 S.acidocaldarius, unicyanobacterial 컨소시엄, 마우스 뇌 피질 조직, 인간 소변 및 A.thaliana의 잎을 사용하여 평가되었습니다. 모든 경우에서 MPLEx 분석법에서 관찰된 단백질의 수는 대조군의 수와 유사했으며, 이는 다양한 샘플 유형에 대한 유용성을 나타냅니다.이 동영상을 시청한 후에는 단일 토양 샘플에서 단백질, 대사 산물 및 지질을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 토양 유형이 다르기 때문에 유연하게 대처하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 단백질 중간층의 크기는 토양에 존재하는 토양 바이오매스와 부식질 물질에 따라 달라집니다.클로로포름으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 시도하는 동안 항상 흄 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

우리는 oligonucleotide 결합 형광 구슬을 사용하여 샘​​플 내에 미생물의 검출을위한 다양한 방법을 설명합니다. 샘플 내의 모든 생물에서 Amplicon는 프로브 결합 구슬의 패널에 hybridized입니다. Luminex 또는 바이오 플렉스 악기는 비드 타입과 하이브 리다이 제이션 신호를 각 비드를 쿼리하는 데 사용됩니다.

Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

인지질의 지방산 토양 미생물 커뮤니티의 구조에 대한 정보를 제공한다. 우리는 단상 클로로포름 혼합물을 고체상 추출 칼럼을 사용하여 추출한 지질의 분류 및 모세관 가스 크로마토 그래피로 분석 지방산 메틸 에스테르를 생성하기 위해 메탄과 토양 시료로부터 추출하기위한 방법을 제시한다.

추출 및 토양의 미생물 인지질 지방산의 분석

이 연구는 지하 수문, 지구 화학 및 토양 모형 매립의 미생물 학적 이질성을 조사하기위한 굴착 방법을 제시한다. 모형 매립은 균일 한 상태에서 처음이었고, 18 개월 기간에 관개의 팔 사이클을 통해 물을 약 5,000mm에 실시한 인공 hillslope을 시뮬레이션합니다.

결합 문학, 지구 화학 및 미생물 조사를위한 토양 모형 매립 발굴

이 논문은 많은 샘플을 가진 연구에서 토양 미생물 군집 구조를 결정하기 위해 총 지질과 지표 지질의 상대적 양을 특성화하는데 사용하기 위해 미생물의 세포막으로부터 지질 추출을위한 노력과 정확성을 균형있게 유지하면서 처리량을 증가시키는 방법을 기술한다.

많은 샘플을 이용한 실험에서 토양 미생물을 특성화하기위한 지질 추출 및 분석 방법

Nanopore 시퀀싱 생체에 대 한 기술, 생명 과학, 병원 균, 식품 안전 모니터링, 게놈 분석, metagenomic 환경 모니터링 및 박테리아의 특성의 식별을 포함 하 여 넓은 응용 프로그램에 항 생 저항입니다. 이 문서에서는, metagenomic 토양 DNA 연속 nanopore 시퀀싱 기술을 사용 하 여 종 식별을 위한 절차는 보여 줍니다.

Metagenomic 토양 분석 Nanopore DNA 시퀀싱

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

복잡 한 인간의 질병에 기여 하는 유전 이체의 소설 메커니즘을 식별 수 있습니다. 여기, 후보 유전자 또는 유전자 통로 분석 낮은 비용 범위를 극대화 하 고 코 호트 기반 연구 의무가 멀티플렉스 유전형 접근 방식을 설명 합니다.

후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트

필드에서 식물 뿌리의 발굴 뿐만 아니라 endosphere, rhizosphere, 및 토양 샘플의 처리는 DNA 추출 및 데이터 분석 방법 등 자세하게에서 설명 되어 있습니다. 이 문서는 토양, endosphere, rhizosphere microbiomes의 연구에 대 한 이러한 기법을 사용 하 여 다른 실험실을 사용 하도록 설계 되었습니다.

절연 및 토양, Rhizosphere, 및 다년생 잔디 실험에 뿌리에서 미생물 커뮤니티의 분석

이 프로토콜 자연 유기 물질과 다른 생태계에서 미생물 단백질의 완전 한 쌍 특성에 culminating 보완 분석 및 omics 기술에 대 한 단일 처리량을 설명 합니다. 이 이렇게 강력한 비교 대사 경로 및 변환을 설명 하는 온실 가스 생산 및 환경 변화에 대 한 응답을 예측에 대 한 중요 한 식별 수 있습니다.

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

이 프로토콜은 7 일 이내에 대규모 토양 샘플 세트에서 효모와 곰팡이 Aspergillus fumigatus를 배양하는 효과적이고 신속한 방법입니다. 이 방법은 실험에 필요한 다양한 인큐베이션 배지 및 온도를 수용하도록 쉽게 변형 될 수 있습니다.

곰팡이 개체군 구조를 조사하기 위해 토양에서 배양 가능한 효모와 곰팡이를 분리합니다.

배우세요 토양 샘플에서 대사물질, 단백질, 지질을 동시에 추출하는 MPLEx 프로토콜을 사용한 멀티-오믹스 분석 방법을. 이 기술은 정확성을 높이고 준비 시간을 단축하여 토양 미생물 군집 연구에 효과적입니다.

멀티-omic 토양 샘플의 분석을 위한 MPLEx 프로토콜

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