Name: 멀티-omic 토양 샘플의 분석을 위한 MPLEx 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 배우세요 토양 샘플에서 대사물질, 단백질, 지질을 동시에 추출하는 MPLEx 프로토콜을 사용한 멀티-오믹스 분석 방법을. 이 기술은 정확성을 높이고 준비 시간을 단축하여 토양 미생물 군집 연구에 효과적입니다.

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작가 네이 선 존슨 수치 준비에 그의 원조에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는 미국 에너지 부의 사무실의 생물학과 환경 연구 (게놈 과학 프로그램), 전환 (민트) 실험실 감독 연구 개발에 Microbiomes에 의해 투자 되는 팬-omics 프로그램에 의해 지원 되었다 퍼시픽 노스 웨스트 국립 연구소, 국가 연구소의 건강 국립 연구소의 환경 건강 과학 (R01 ES022190)에서 이니셔티브와 NIH (P42 ES027704). KEBJ는 R21 HD084788 개발 하 고 새로운 멀티-omic 추출 기법 검증 재정 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에는 W. R. 윌 환경 분자 과학 실험실 (EMSL), 미상 국가 과학적인 사용자 시설 평화로운 북 서 국립 연구소 (PNNL)에서 수행 되었다. PNNL은 Battelle 계약 드-AC06-76RL01830에서 DOE에 대 한 운영 하는 멀티 프로그램 국립 연구소 이다.

참고: 매우 젖은 토양 이전 효과에 손해 없이 추출 추출의 lyophilized 수 있습니다. 젖은 토양 또한 사용 될 수 있지만 특정 비율에 시 약을 추가할 때 고려해 야 합니다.
참고:이 좋습니다 추출, 두 50 mL 튜브 (최대 50 mL 튜브 당 10 g 토양) 사이 분할 한다 당 건조 한 토양 중량의 20 g을 사용 하 여. 추출 또는 사용 가능한 샘플에 따라 다름 아래로 확장할 수 있습니다.
참고: 건조 한 토양 샘플 균질 하 고 작은 뿌리와 바위를 제거 하기 위해 3 m m 스크린을 통해 sieved 될 수 있습니다. 샘플 화면에 붙어 얻을 것 이다 젖은 토양 샘플을 체질 하지 마십시오.
1. 토양 세포 세포의 용 해 및 대사, 단백질, 지질 (타이밍 ~ 1 d)의 추출
<ol><li>20 g 토양 샘플 당 메탄올/클로 프롬 호환 되는 두 개의 별도 50 mL 튜브에 10 g를 무게. 조심 선택, 튜브와 함께 클로 프롬 샘플 오염 대부분 플라스틱 거르는 것으로 합니다. 유리를 사용 하 여 언제 든 지 가능한 또는 플라스틱 튜브 폴 리 프로필 렌 또는 소계 (PTFE)에서 만든. 참고: 계속 멋진 얼음 토양 초기 무게 및 균질 단계 동안 가능한.</li>
	<li>각 튜브를 클로 프롬 씻어 스테인레스 스틸과 가닛 구슬의 10 mL를 추가 합니다. 얼음, 차가운 초순의 4 개 mL를 추가 물 (정화 시스템에 대 한 재료의 표 참조) 각 관 (2 개의 관 사이 한 샘플 분할)와 증기 두건으로 얼음 양동이에 샘플을 전송.</li>
	<li>25 mL 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 신속 하 게 얼음 처럼 차가운 2:1 클로 프롬: 메탄올 (v/v) 20 mL를 추가 합니다. 주의: 클로 프롬: 메탄올은 급성 잠재적 건강 영향: 피부 자극, 가능한 화학 화상, 및 호흡 체계에 자극. 그것은 신장, 간, 그리고 심 혼 영향을 미칠 수 있습니다. 적합 한 보호 안경, 의류, 장갑, 착용 하 고 항상 증기 두건에서 작동.</li>
	<li>솔루션으로 뚜껑과 소용돌이 조입니다. 2:1 choloroform:methanol 원핵생물의 세포 벽을 분해 하 고 또한 효소 활동은 합니다.</li>
	<li>50 mL 튜브 소용돌이 첨부 파일 및 수평 냉장고 안에 4 ° C에서 10 분에 대 한 소용돌이를 가능 하면 튜브를 연결 합니다. 다음, 그들을 완전히 진정 위해 ~ 15 분-80 ° C 냉장고 내부 샘플 장소.</li>
	<li>30에 대 한 진폭 60%에서 6 m m (1/4") 프로브 각 샘플을 sonicate 증기 두건 안쪽 프로브 sonicator를 사용 하 여 s 각 얼음에. 주의:이 좋습니다 sonicating 동안 인클로저 및 귀 보호를 감소 시키고 소리를 사용 하 여. 높은 전압은 전원 공급과 높은 주파수 케이블에. 액티브 프로브; 하단 또는 샘플 용기 측면을 만지지 마십시오 그것은 균열 또는 플라스틱을 녹여 수 있습니다.</li>
	<li>많은 열을 생성할 수 있습니다 sonicating 샘플 ~ 15 분,-80 ° C 냉장고에 놓습니다.</li>
	<li>1.5-1.7 단계를 반복 합니다. 참고: 샘플 세포 절차 동안 차가운 체재 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>5 분, 4 ° c.에 대 한 4000 x g에서 샘플을 원심 이 시점에서, 샘플 위 대사 산물 레이어, 단백질 interlayer 낮은 지질 층 (및 나머지 파편 펠 릿)으로 구분 됩니다. 그림 1을 참조 하십시오.</li>
	<li>샘플 얼음 양동이에 얼음에 놓고, 증기 두건 및 10 mL 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 내부 레이어를 제거는 위 대사 산물 2 50 mL 튜브에서 하나의 큰 유리 유리병에. 참고: 피할 피 펫;으로 단백질 층의 발음 필요한 경우 대사 산물의 작은 레이어를 남겨 주세요.</li>
	<li>약간 틸트 되도록 낮은 지질 층에 무료 부동 단백질 interlayer 출시 50 mL 튜브. 특 종 단백질 interlayers의 둘 다 신중 하 게 깨끗 한 스테인리스 플랫 헤드 랩 주걱을 사용 하 고 하나의 새로운 50 mL 튜브에 함께 넣어.</li>
	<li>25 mL 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 하나의 대형 유리 유리병으로 낮은 지질 레이어를 제거 합니다. 참고: 주목 받는 토양 입자;을 피하려고합니다 그러나 일부 토양 파편 및 입자와 함께 갈망 하는, 지질 나중에 제거 됩니다.</li>
	<li>대사 산물 및 지질 위에 숨 막 유리 튜브와 건조까지 진공 집중 장치에 건조 장소 (지질 ~ 4-5 h metabolites 하룻밤).</li>
	<li>단백질 샘플 튜브를 나머지 파편 펠 렛 튜브 각 얼음 메탄올과 소용돌이의 20 mL를 추가 합니다. 이것은 클로 프롬 그것을 던지기 전에 파편의 어떤 가능한 남은 단백질을 solubilize 하려고 하기 전에 씻어 하 파편 펠 릿에 이루어집니다.</li>
	<li>원심 분리기 파편 펠 릿 및 단백질에 5 분, 4 ° C, 4000 x g interlayer 다음 증기 두건 안쪽 유해 폐기물 컨테이너에 메탄올을 가만히 따르다</li>
	<li>액체 질소에 단백질 및 파편 펠 릿을 동결 하 고 (와 함께 수집가 온도-98 ° C의 매우 낮은 어는 점 데 메탄올 때문-105 ° C의) lyophilizer에서 건조 ~ 2 시간. 참고: 않습니다-건조 하지 펠 릿로 그들은 solubilize 더 어려울 것 이다.</li>
	<li>단백질 중간층 튜브 및 파편 펠 릿의 각각에 20 mL의 단백질 가용 화 버퍼 (4 %SDS, 50 mM tris 버퍼, pH 8.0에서에서 100 m m DTT (DL-dithiothreitol); 보십시오 보충 시 설정) 10 mL를 추가 합니다. 주의: SDS 급성 독성 원인과 가연성 이다. 그것은 피부, 눈, 그리고 기도 자극입니다. 장갑, 안전 안경 착용.</li>
	<li>증기 두건에서 프로브 sonicate 30 20% 진폭에서 샘플 솔루션에 그들을가지고 s. 2 분 동안 소용돌이입니다.</li>
	<li>단백질 중간층 샘플을 solubilize 단백질을 300 rpm, 50 ° C에서 30 분 동안 실험실 관 회전에 넣으십시오.</li>
	<li>가로로 소용돌이 추가 10 분 모든 나머지 그대로 세포를 lyse 파편 샘플 다음 회전 나머지 20 분 단백질 중간층 샘플.</li>
	<li>10 분, 실 온 (RT), 4500 x g에서 샘플의 모든 원심 고 두 50 mL 튜브 각 튜브 샘플 당에서 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>가용 화 10 mL 단백질 중간층 펠 릿에 버퍼 sonicate 그리고 소용돌이 이전과 솔루션 및 원심 분리기에 다시 추가 합니다.</li>
	<li>똑같이 두 50 mL 튜브는 supernatants를 결합 하 고 8000 x g 10 분, 고정된 각도 양동이 터에 4 ° C에서 원심. 참고: 최종 원심 분리는 과도 한 오염 humic 물질을 제거 하는 데 필요한.</li>
	<li>각 30 mL 되도록 두 50 mL 튜브는 supernatants를 가만히 따르다. 그런 다음, 각 튜브를 TCA (trichloroacetic 산)의 7.5 mL를 추가 10 mL 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여. 솔루션으로 소용돌이입니다. 이것은 20 %TCA 각 30ml 샘플에서 (조절), 주의: TCA는 부식성, 독성 및 5 월 피부 화상을 일으킬. 장갑, 안전 안경 착용.</li>
	<li>하룻밤에 2 h-20 ° C 냉동 실에 샘플을 놓습니다. 참고: 단백질 일반적으로 1 시간 이내 침전 됩니다 하지만 왼쪽 하룻밤 (18 h까지) 될 수 있습니다. 참고: TCA 추출 단백질의 가능한 산 성 가수분해 때문 18 h 이상가 게 하지 마십시오. 샘플을 동결 하는 경우 얼음;에 녹여 샘플을 thaw 과거 워밍업 하지 마십시오.</li>
	<li>침전 된 단백질 펠 렛, 원심 4500 x g 10 분, 4 ° C에서 샘플 하 고 폐기물에는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>1 개의 관으로 각 단백질 펠 릿, 소용돌이 및 펠 릿 처럼 조합 100% 얼음 아세톤 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>원심 관 (를 사용 하 여 균형), 결합 된 펠 릿을 포함 하 고 폐기물에는 상쾌한을 가만히 따르다. 주의: 아세톤 호흡기 및 피부와 눈 자극, 발생할 수 있습니다 고 인화성 액체와 증기 이다. 증기 두건에서 작동, 안전 안 경과 장갑과 실험실 외 투를 착용 하십시오.</li>
	<li>두 번 아세톤 2 mL 튜브 5 분 10000 x g에서 마지막 스핀에 대 한 마지막 전송의 1.5 mL를 사용 하 여 펠 릿을 세척.</li>
	<li>폐기물에는 상쾌한 가만히 따르다 고 건조 펠 릿 거꾸로 연기 후드 ~ 20 분 또는 질소 스트림 아래에 종이 지우기에는 펠 릿 약간 균열 시작 될 때까지.</li>
	<li>펠 릿의 크기에 따라 단백질 가용 화 버퍼의 100-200 µ L를 추가 합니다. 참고: 가능한 샘플에 추가 가용 화 버퍼의 볼륨을 유지. 이후 필터 지원 샘플 준비 (FASP) 열; 당 solubilized 샘플의 50 μ까지 사용할 수 있습니다. 어떤 더 분할할 여러 FASP 열 수 있어야 합니다.</li>
	<li>Sonicate와 소용돌이 솔루션으로 펠 릿. 참고 샘플 humic 물질 후속 원심 분리와 제거 될 것 이다 단백질 함께 계기 인 점도 있을 수 있습니다.</li>
	<li>솔루션으로 단백질을 solubilize 단백질 소화를 진행 하는 샘플 300 rpm, 40 ° C에서 30 분 동안 인큐베이터/셰이 커에 흔들어.</li>
	<li>스냅은 단백질 소화에 대 한 준비까지 액체 질소와-80 ° C 냉동 고가 게에서 샘플을 동결.</li>
</ol>2. 지질 준비 (타이밍 ~ 20 분)
<ol><li>지질 샘플 건조 되 면, 추가 솔루션으로 소용돌이 및 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 유리병을 2:1 클로 프롬: 메탄올의 200 μ 유리에 추가 200 μ 추가 유리병, 소용돌이 나머지 지질 플라스틱 튜브에 전송.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 12000 x g에서 샘플에서 파편을 원심</li>
	<li>LC-MS/MS 분석 (LC-MS/MS 보충 방법에 대 한 추가 정보)까지 상쾌한 유리 지질 유리병-20 ° C에서 저장소로 전송 합니다.</li>
	<li>샘플 준비 후 즉시 분석 될 수 없습니다, 경우 지질 산화와 저하를 방지 하기 위해-20 ° C에서 용 매에 저장 될 필요가 있다.</li>
</ol>3. 대사 산물 준비 및 Derivatization (타이밍 ~ 5 h)
<ol><li>추출 다음 날 속도 Vac에서 대사 산물 샘플을 제거 하 고 derivatization 및 GC 분석에 대 한 준비까지-20 ° C에서 건조 저장 합니다. 그렇지 않다면 다음 악기에 대 한 적절 한 프로토콜을 사용 하 여 준비를 GC에는 대사 산물을 실행.</li>
	<li>GC 분석에 대 한 대사 산물을 derivatizing, 직전 양도할 대형 유리 튜브에서 메탄올, vortexing 및 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 추가 200 μ를 추가 하 여. 한 번 반복 합니다.</li>
	<li>12000 x g 10 분, 4 ° c.에 관을 원심 작은 유리 튜브에는 상쾌한 전송, 추가 숨 막 상단에 속도 Vac에서 완전히 건조.</li>
	<li>샘플 유리병 및 30에 대 한 소용돌이에 methoxyamine 솔루션의 20 µ L을 추가 하 여 metabolites derivatize 중간 속도로 vortexer에 s. 주의: Methoxyamine 염 심한 화상과 눈에 심각한 손상의 원인, 과민성 피부 접촉에 의해 발생할 수 있습니다. 안전 안경, 장갑, 실험실 외 투를 착용 하 고 증기 두건에서 작동.</li>
	<li>목욕 sonicator를 사용 하 여 샘플 완전히 용 해 되도록.</li>
	<li>결로 예방 뚜껑 1000 rpm 떨고 1 h 30 분 동안 37 ° C에서 유지는 인큐베이터에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>반전 유리병 뚜껑 표면에 응축 된 방울과 샘플을 섞어 한 번. 1 분, 실시간 1000 x g에 아래로 샘플을 회전</li>
	<li>(주사기를 사용 하 여) 하는 80 µ L n 추가 하 여 수행 하는 silylation-메 틸-N-(trimethylsilyl) 1 %trimethylchlorosilane trifluoroacetamide. 10 초에 대 한 소용돌이입니다. 주의: MSTFA + 1 %TMCS 피부 부식, 심각한 눈 손상, 및 특정 표적 장기 독성을 일으킬 수 있습니다 고 인화성 액체와 증기 이다. 안전 안경, 장갑, 실험실 외 투를 착용 하 고 증기 두건에서 작동.</li>
	<li>30 분 동안 37 ° C에서 흔들어 1000 rpm 유지 응축 방지 뚜껑 인큐베이터에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>반전 유리병 뚜껑 표면에 응축 된 방울과 샘플을 섞어 한 번.</li>
	<li>2000 x g, 실시간에 5 분 동안 아래로 샘플을 회전</li>
	<li>GC-MS 분석에 대 한 적절 한 튜브에 반작용된 솔루션을 전송 합니다.</li>
</ol>4. 단백질 소화 (타이밍 ~ 1 d)
<ol><li>5 분, RT, 작은 어떤 파편 든 지를 위한 15000 x g에서 샘플 원심</li>
	<li>필터 원조 샘플 준비 (FASP) 수행 FASP를 사용 하 여 소화 키트 ( 재료의 표참조) 다음 제조 업체의 지침31,32수정:<ol>
<li>8 M 요소 버퍼의 400 μ FASP 열 (500 μ 30 K MWCO 스핀 필터)에 추가 합니다.</li>
		<li>샘플 centrifuging 완료 되 면, 상쾌한 (삭제는 펠 릿)에서 플라스틱 고 8 M 요소는 열에서의 400 μ에 샘플의 최대 50 μ를 추가 합니다. 참고: 추가 열 당 샘플의 최대 50 μ. 50 μ 샘플의 경우 여러 열을 사용 하 고 소화 후에 펩 티 드 결합. 이 볼륨을 가능한 한 낮게 떠날 것이 좋습니다 (30 µ L 이상적 이다)는 FASP를 보장 하기 위해 열 것입니다 모두 제거 SDS 극적으로 질량 spec 분석을 방해할 수 있습니다.</li>
		<li>열 포함된 1.5 mL 튜브에 놓고 30 분, 실시간 14000 x g에서 샘플을 원심</li>
		<li>낭비로 통해 흐름 제거 하 고 열에 8m 우 레 아의 400 μ를 추가 하 고 다시 원심.</li>
		<li>한 번 더 3 요소 린스의 총에 대 한 이전 단계를 반복 합니다. 참고: 샘플은 열에 건조 가까이 있는지 확인 하십시오 어떤 경우 보다 더 ~ 각 스핀 후 필터에 남아 있는 30 µ L centrifuging 계속.</li>
		<li>20 분 14000 x g에서 50mm NH4HCO3 와 원심 분리기의 400 μ를 추가 하 고 폐기물을 버리고 한 번 반복.</li>
		<li>깨끗 한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 열을 전송.</li>
		<li>트립 신 소화 버퍼의 75 μ는 열을 추가 하 고 750 rpm에서 결로 방지 뚜껑 인큐베이터에서 3 h 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>열에 50mm NH4HCO3 40 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>14000 x g 15 분 열 위에 높은 분자량 오염 물질을 유지 하면서 튜브에는 펩 티 드를 수집에서 샘플 원심</li>
		<li>열 및 원심 분리기를 50mm NH4HCO3 40 μ를 다시 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>열, 튜브 ~ 30 µ L, 및 BCA 분석 결과 (Bicinchoninic 산 성 단백질 분석 실험 키트, 참조 테이블의 자료) 속도 Vac에 펩 티 드 다운 건조는 펩 티 드.</li>
	<li>SDS 오염 (보이는 거품)33의심 되는 경우 필요에 따라 정리 단계를 수행 합니다. 고체 상 추출이이 옵션을 선택 하는 경우에 이후에 수행 되어야 합니다. 이 정리 방법에 대 한 자세한 내용은 보충 방법에서 이용하실 수 있습니다.</li>
	<li>MS 분석을 위한 샘플을 희석 하거나 선택적으로 HPLC 분류 (다음 두 단계)에.
</li>
	<li>충분치, 10 m m 염화 편대 버퍼 (pH 10.0) 400 µ L의 볼륨 샘플을 희석.</li>
	<li>C18 열에 해결 ( 재료의 표참조) 0.5 mL/min HPLC 시스템을 사용 하 여 모바일 단계 (A) 10 mM 암모늄 편대, pH 10.0와 (B)에서 10 m m 염화 편대, pH 10.0/이기 (10:90)을 구분 하 여.<ol>
<li>최소 10 ~ 70, 65 %A 분 70 ~ 85, 30 %A 분 85 ~ 95 이상에서 유지 이상 30 %A 통해 100% A 95 %A 처음 10 분, 95 %A 65 %A 그라디언트를 조정 합니다.</li>
		<li>다시 분 95 105 이상 100% A equilibrate 누르고 100 %A 120 분까지 있습니다.</li>
		<li>분수 모든 1.25 분 (96 분수 전체 그라데이션 이상의)를 수집 하 고 마지막으로 12 샘플 또는 24 샘플에 대 한 다른 모든 행의 총에 대 한 모든 행을 결합 (각각 n = 8 또는 n = 4 분수 풀링된).</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 분수 진공에서 건조 하 고 LC-MS/MS 분석까지-20 ° C에서 스토리지에 대 한 각 초순의 15 µ L를 추가 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

그것은 특정 방법, 예를 들어 세포 단계, 적응 시킬 수 있다 그래서 모든 실험실 같은 사용 가능한 장비 해야한다 참고 해야 합니다. 그러나 여기 우리 사용 vortexing sonicating, 큰 50 mL 비드 때리는 사용 하 여 작동 합니다. Lyophilizer-105 ° C의 온도 수집기와 사용할 수 없는 경우 샘플 질소 스트림 아래 건조 수 있습니다. 또한 토양 유형을 크게 다르며 모래, 갯벌, 찰 흙,이 탄, 및 옥 토 (등), 포함 될 수 있습니다 그리고 그들은 또한 pH, 염 분, 유기 물 풍부에 따라 달라질 수 있습니다. 유연 하 고 필요할 때 조정 하는 것이 중요 하다 그래서 각 이러한 차이 프로토콜에 영향을 가질 수 있습니다. 그러나 그것은 중요 한,, 그 비율 및 백분율 동일 하 게 유지입니다.
MPLEx 프로토콜 수많은 생물 및 환경 시스템 및 토양 미생물 지역 사회의 멀티-omic 분석을 활성화 하는 기능에서 응용 프로그램에 대 한 큰...

토양 미생물 지역 사회 평가 탄소 순환, 기후 변화를 이해 하기 위한 중요 한 의미를 갖는다. 그러나 최근 연구는 어려움을, 다양 한 토양 유형 microbiota에 대 한 시퀀스 게놈의 부족 및 감지 하는 단백질의 많은 것의 알 수 없는 기능 등을 강조 했다. 이러한 도전 결과1,,23현재까지 알려진 가장 복잡 한 미생물 지역 사회 토양 때문. 멀티-omic 분석, metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic 연구에서 결과 결합 하는 최근 미생물 존재, 동안에 더 큰 이해를 얻기 위해 수많은 토양 연구에서 구현 되었습니다. 때문에 환경 섭1,,45분자 변화에 대 한 포괄적인 정보를 얻는. 멀티-omic 연구와 함께 한 가지 문제는 질량 분석 (MS)-기반으로 metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic 측정은 일반적으로 각 omic MS 호환6,7 에 대 한 특정 추출 과정 필요 , 8 , 9.이 정확한 절차 확인의 구현을 매우 어렵거나 불가능 한 때 샘플의 한정 된 수량만 사용할 수. 이러한 과제는 우리 동시 대사 산물, 단백질 및 지질 추출 (MPLEx) 방법 작은 샘플 볼륨 또는 대 중을 사용 하 여 정확도 개선 하 고 제공 하는 모든 3 개의 분석에 대 한 빠른 샘플 준비 조사를 자극합니다 10. 데이트 하 고, 이러한 목표를 모두 달성할 수 있는 대체 토양 추출 절차가 필요 하지 않습니다.
글로벌 멀티-omic 단일 토양 샘플의 분석을 사용 하려면 클로 프롬, 메탄올, 물 분판 기반으로 하는 유기 용 매 추출 프로토콜 사용된10이었다. 이 메서드는 원래 총 지질 기사9,11 에 대 한 개발 및 최근에 단일 샘플12,13 에서에서 대사 산물, 단백질과 지질 동시 추출에 대 한 개정 했다 14,15,16,17,18,19,20,,2122, 23,,2425,26,27,28,29,30, 적은 샘플 수량을 사용 하 고 실험적 변화10. MPLEx 프로토콜에서 클로 프롬은 별개 조각으로 샘플 성분의 triphasic 화학 별거를 위한 기초를 제공 하는 물과 혼합할 수 있는. 최고 수성 단계 따라서 친수성 대사, 단백질 디스크 그리고 지질 층 하단 클로 프롬 단계 (그림 1)에서 다음을 포함 합니다. MPLEx 대부분 토양에 적용 될 때 미 립 자 파편 샘플링 튜브의 맨 아래에 축적 하 고 모든 레이어는 수집 된 후 삭제 될 수 있습니다. 그러나 각 토양 유형 다를 수,, 및이 탄 등 높은 유기 토양, 토양 파편 중간 계층에 샘플링 튜브의 바닥에 떨어지지 않습니다. MPLEx 1) 작은 샘플 양이 멀티-omic 분석, 2) 멀티-omic 기사 같은 샘플 감소에서 사용 될 수 있습니다와 같은 동일한 샘플에서 유형 여러 분자를 분리 하면 몇 가지 장점이 제공 전반적인 실험 가변성, 그리고 샘플의 3) 큰 숫자 높은 처리량 연구10훨씬 더 빨리 준비 될 수 있습니다. 함께 이러한 혜택은 토양 샘플 및 그들의 복잡 한 미생물 지역 사회를 평가 하기 위한 더 나은 측정 기능을 제공 하기 위한 중요 합니다.

<table><tbody><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>650498</td><td>-20°C에 보관됩니다. C ! 주의: 클로로포름은 급성 잠재적인 건강 영향, 피부 자극 및 가능한 화학적 화상, 호흡기 계통 자극, 신장, 간, 심장에 영향을 미칠 수 있습니다. 적절한 보호 안경, 의복 및 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td>은 <td>-20°C에 보관됩니다. C ! 주의: 메탄올은 호흡기, 피부 및 눈 자극을 유발할 수 있으며 신경, 신장 및 간을 손상시킬 수 있습니다. 적절한 보호 안경, 의복 및 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>Millipore</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>정수 시스템의</td> 정제수.</tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>L6026</td><td>! 주의: SDS는 급성 독성을 일으키며 가연성입니다. 피부, 눈 및 기도에 자극을 줍니다. 장갑과 보안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>토양 단백질 추출 키트</td><td>MoBio, NoviPure 토양 단백질 추출 키트, Qiagen</td><td>30000-20</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>1M Trizma HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2694</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td>! 주의: TCA는 부식성, 독성이 있으며 피부 화상을 유발할 수 있습니다. 장갑과 보안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마-알드리치</td><td>650501</td><td>-20°C에 보관됩니다. C ! 주의: 아세톤은 호흡기와 피부 및 눈 자극을 유발할 수 있습니다. 가연성 액체 및 증기. 보안경, 장갑, 실험복을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>우레아</td><td>시그마-알드리치</td><td>208884</td><td>! 주의: 요소는 눈과 피부에 자극을 주므로, 장갑과 안전 안경을 사용하십시오</td></tr>. <tr><td>암모늄 바이카보네이</td>트 <td>플루카</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>프로메가</td><td>V528A</td><td>20&마이크로; g 바이알</td></tr><tr><td>, Bicinchoninic acid protein assay kit</td><td>, Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr>, <tr><td>Ammonium Formate</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>09735</td><td></td></tr>, <tr><td>Acetonitrile</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td>! 주의: 아세토니트릴은 피부와 눈을 자극합니다. 가연성이 높습니다. 장갑과 보안경을 착용하십시오. 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>트리 플루오로 아세트산</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>T6508</td><td>! 주의: TFA는 피부 접촉, 눈 접촉, 섭취 및 흡입 시 매우 위험합니다. 특히 눈, 입 그리고 기도의 점막에 조직 손상을 일으킬 수 있습니다. 피부에 닿으면 화상을 입을 수 있습니다. 장갑, 실험복, 보안경을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>메톡시아민 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>226904</td><td>! 주의: 메톡시아민 염산염은 심한 화상과 눈에 심각한 손상을 일으키며 피부 접촉에 의해 과민성을 유발할 수 있습니다. 보안경, 장갑 및 실험복을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>피리딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>270970</td><td>! 주의: 피리딘은 피부와 눈에 자극을 일으키고 중추 신경계를 억제할 수 있습니다. 증기는 섬광을 일으킬 수 있습니다. 보안경, 장갑 및 실험복을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>N-메틸-N-(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드와 1% 트리메틸클로로실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>69478</td><td>! 주의: MSTFA + 1% TMCS는 피부 부식, 심각한 눈 손상 및 특정 표적 장기 독성을 유발할 수 있습니다. 가연성 액체 및 증기. 보안경, 장갑 및 실험복을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 정수 시스템</td><td>Millipore</td><td></td><td>모델 MPGP04001</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex Genie 2</td></tr><tr><td>프로브 초음파 발생기</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>모델 FB505</td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>모델 5810R</td></tr><tr><td>50mL 튜브 스윙 버킷 로터</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td>50mL 고정각 로터</td><td>Eppendorf</td><td>FA-45-6-30</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>OHAUS</td><td></td><td>모델 V22PWE150IT</td></tr><tr><td>혈청학 피펫 컨트롤러</td><td>Eppendorf</td><td>12-654-100</td><td></td></tr><tr><td>10mL, 25mL 유리 혈청학 피펫</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-27F, 13-678-36D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer Thermotop</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015 포함, 5308000003</td><td></td></tr><tr><td>0.9 &ndash; 2.0 mm 블렌드 스테인리스 스틸 비드</td><td>NextAdvance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>0.15 mm 가넷 비드</td><td>MoBio</td><td>13122-500</td><td></td></tr><tr><td>자석 교반 플레이트</td><td>FisherBrand</td><td>11-100-16SH</td><td></td></tr><tr><td>자석 교반 바</td><td>FisherBrand</td><td>14512130</td><td></td></tr><tr><td>pH 종이 스트립, pH 범위 0&ndash; 14</td><td>FisherBrand</td><td>M95903</td><td></td></tr><tr><td>15mL, 50mL 원추형 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103 21-108</td><td>클로로포름 호환</td></tr><tr><td>50mL 와류 부착</td>물 <td>MoBio</td><td>13000-V1-50</td><td></td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>FisherBrand</td><td>02-591-44</td><td></td></tr><tr><td>27.25x70mm 유리 바이알</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>호흡 더 쉬운 플레이트 멤브레인</td><td>Midwest Scientific</td><td>BERM-2000</td><td></td></tr><tr><td>알코올 와이프</td><td>Diversified Biotech</td><td>BPWP-1000</td><td></td></tr><tr><td>히터 셰이커 인큐베이터</td><td>벤치 마크, Incu-Shaker 미니</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아날로그 로티 세리 튜브 로테이터</td><td>SoCal BioMed, LLC</td><td>82422001</td><td></td></tr><tr><td>필터 지원 샘플 준비 키트</td><td>FASP; Expedeon</td><td>44250</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>Biotek, EPOCH-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>섭씨 20도 냉동고</td><td>Fisher</td><td>13986149-80</td><td></td></tr>도 <tr><td>섭씨 냉동고</td><td>스털링 초저온</td><td>SU78OUE</td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive 이온 트랩 질량 분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7890A 기체 크로마토그래프와 단일 사중극자 결합 5975C 질량분석기</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velo</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters NanoEquityTM UPLC 시스템</td><td>Millford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250mL 미디어 병</td><td>FisherBrand</td><td>1395-250</td><td></td></tr><tr><td>Waters 바이알</td><td>Waters</td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>Glass MS 시료 바이알 및 인서트</td><td>MicroSolv</td><td>9502S-WCV, 9502S-02ND</td><td></td></tr><tr><td>Glass HPLC 바이알 및 스냅 캡</td><td>MicroSolv</td><td>9512C-0DCV, 9502C-10C-B</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 96웰 플레이트</td><td>Agilent</td><td>5042-6454</td><td></td></tr><tr><td>대형 유리 바이알 27.25x70mm</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>동결건조기</td><td>Labconco</td><td>7934021</td><td></td></tr><tr><td>광택 스테인리스강 납작머리 주걱</td><td>Spoonula; FisherBrand</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>Kim 와이프</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34721</td><td></td></tr><tr><td>XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 &mu; M with 4.6x20 mm guard column</td><td>Waters</td><td>186003117, 186003064</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1380-90000</td><td></td></tr><tr><td>1.7mL 원심분리기 튜브</td><td>Sorenson</td><td>11700</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 유리 주사기, 5mL, 50&micro; L 및 250&micro; L</td><td>Hamilton</td><td>81517, 80975, 81175</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 전구</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z111597</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Branson 1800 초음파 세척기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 원심 분리기</td><td>Labconco Centrivap 내산성 농축기 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin 컬럼, C18 실리카</td><td>둥지 그룹</td><td>SEM SS18V</td><td></td></tr></tbody></table>

멀티-omic 토양 샘플의 분석을 위한 mplex 프로토콜

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

질량 분석 (MS)-기반된 통합된 metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic (멀티-omic) 연구 우리의 능력을 이해 하 고 환경 및 생물 학적 시스템에서 미생물 지역 사회 특성을 변형 시키고 있다. 이러한 측정도 가장 복잡 한 토양 미생물 커뮤니티의 향상 된 분석 사용 하 고 있습니다 현재까지 알려진 복잡 한 미생물 시스템. 그러나 멀티-omic 분석,, 있다 샘플 준비 과제, 별도 기사는 일반적으로 매우 준비 시간과 필요한 샘플의 양을 증폭 각 omic 연구를 위해 필요 하기 때문. 이 한계를 해결 하기 위해 3-에서-1 방법 같은 토양 샘플에서 대사, 단백질, 지질 (MPLEx)의 동시 추출 용 매 기반 접근을 적응 하 여 만들었습니다. 이 MPLEx 프로토콜은 모두 간단 하 고 많은 샘플 유형에 대 한 강력한 복잡 한 토양 샘플의 한정 된 수량에 대 한 활용 하는 경우에 입증 되었습니다. MPLEx 메서드는 또한 크게 생물학과 환경 물결 따라 변화를 평가 하는 동안 각 미생물 커뮤니티의 구성원의 더 나은 이해를 얻기 위하여 필요한 급속 한 멀티-omic 측정을 사용할 수 있습니다.

MPLEx 프로토콜은 캔자스 네이티브 대초원 토양 (Mollisol 토양)에서 분자를 추출 하는 데 사용 됩니다, triplicate 분석 3376 펩 티 드, 105 지질 및 102 극 대사 (모든 고유 식별)에 대 한 결과 제공. 반면 MPLEx 프로토콜 지질과 대사 산물12,13,14,15,,1617,18의 일반적인 추출 잘 설립 되었습니다 ,19,<sup class="x...

프로토콜은 동시에 하나의 토양 샘플에서 대사 산물, 단백질과 지질을 추출, 감소 샘플 준비 시간 허용 및 한정 된 수량으로 샘플의 멀티-omic 질량 분석 분석을 활성화에 대 한 제공 됩니다.

멀티-omic 토양 샘플의 분석을 위한 MPLEx 프로토콜

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

이 방법은 단백질체학, 대사체학 및 지질체학 분야에서 사용되며, 환경 교란으로 인해 토양 관련 미생물 군집에서 발생하는 분자 변화에 대한 포괄적인 정보를 얻는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 토양 샘플에서 여러 분석물을 얻을 수 있어 정밀도와 정확도가 높아지는 동시에 샘플 준비 시간과 노력이 줄어든다는 것입니다. 먼저 각 20g의 토양 샘플에 대해 10g의 무게를 두 개의 별도 50ml 메탄올/클로로포름 호환 튜브에 넣습니다.클로로포름은 대부분의 플라스틱을 침출시켜 샘플을 오염시키므로 PTFE로 만든 플라스틱 튜브를 사용하십시오. 각 튜브에 약 10ml의 클로로포름 세척 스테인리스 스틸과 석류석 구슬을 추가합니다. 그런 다음 얼음 위에서 각 튜브에 4ml의 차가운 초순수를 넣고 얼음 양동이에 담긴 샘플을 흄 후드로 옮깁니다.25ml 유리 혈청학 피펫을 사용하여 20ml의 얼음처럼 차가운 2:1 클로로포름을 튜브에 메탄올 부피/부피에 빠르게 첨가합니다. 뚜껑을 조이고 토양 혼합물을 용액으로 와류로 만듭니다. 클로로포름-메탄올은 원핵생물의 세포벽을 파괴하는 데 도움이 되며 효소 활동도 비활성화합니다.다음으로, 튜브를 50밀리리터 튜브 와류 부착물에 부착하고 가능하면 냉장고 내부에서 섭씨 4도에서 10분 동안 수평으로 와류를 사용합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 80도의 영하 냉동고에 약 15분 동안 넣어 완전히 식힙니다. 그런 다음 흄 후드 내부의 프로브 초음파 발생기를 사용하여 얼음 위에서 30초 동안 60% 진폭의 6mm 1/4인치 프로브로 각 샘플을 초음파 처리합니다.초음파 처리 후 초음파 처리는 많은 열을 발생시킬 수 있으므로 샘플을 섭씨 80도의 음의 냉동고에 넣습니다. 수평한 와류, 초음파 처리 및 어는 단계를 반복한 후에, 5 분 동안 4의, 000배 중력 및 4 섭씨 온도에 표본을 분리기. 이 시점에서 샘플은 상부 대사산물층, 단백질 중간층 및 하부 지질층으로 분리됩니다.샘플을 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 흄 후드 내부에서 10ml 유리 혈청학 피펫을 사용하여 두 개의 50ml 튜브에서 하나의 큰 유리 바이알로 상부 대사 산물 층을 옮깁니다. 이제 50ml 튜브를 약간 기울여 단백질 중간층을 방출하여 하부 지질층에서 자유롭게 떠다니도록 합니다.그런 다음 깨끗한 스테인리스 스틸 플랫 헤드 실험실 주걱을 사용하여 두 단백질 중간층을 조심스럽게 떠서 하나의 새로운 50ml 튜브에 함께 넣

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

우리는 oligonucleotide 결합 형광 구슬을 사용하여 샘​​플 내에 미생물의 검출을위한 다양한 방법을 설명합니다. 샘플 내의 모든 생물에서 Amplicon는 프로브 결합 구슬의 패널에 hybridized입니다. Luminex 또는 바이오 플렉스 악기는 비드 타입과 하이브 리다이 제이션 신호를 각 비드를 쿼리하는 데 사용됩니다.

Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

인지질의 지방산 토양 미생물 커뮤니티의 구조에 대한 정보를 제공한다. 우리는 단상 클로로포름 혼합물을 고체상 추출 칼럼을 사용하여 추출한 지질의 분류 및 모세관 가스 크로마토 그래피로 분석 지방산 메틸 에스테르를 생성하기 위해 메탄과 토양 시료로부터 추출하기위한 방법을 제시한다.

추출 및 토양의 미생물 인지질 지방산의 분석

이 연구는 지하 수문, 지구 화학 및 토양 모형 매립의 미생물 학적 이질성을 조사하기위한 굴착 방법을 제시한다. 모형 매립은 균일 한 상태에서 처음이었고, 18 개월 기간에 관개의 팔 사이클을 통해 물을 약 5,000mm에 실시한 인공 hillslope을 시뮬레이션합니다.

결합 문학, 지구 화학 및 미생물 조사를위한 토양 모형 매립 발굴

이 논문은 많은 샘플을 가진 연구에서 토양 미생물 군집 구조를 결정하기 위해 총 지질과 지표 지질의 상대적 양을 특성화하는데 사용하기 위해 미생물의 세포막으로부터 지질 추출을위한 노력과 정확성을 균형있게 유지하면서 처리량을 증가시키는 방법을 기술한다.

많은 샘플을 이용한 실험에서 토양 미생물을 특성화하기위한 지질 추출 및 분석 방법

Nanopore 시퀀싱 생체에 대 한 기술, 생명 과학, 병원 균, 식품 안전 모니터링, 게놈 분석, metagenomic 환경 모니터링 및 박테리아의 특성의 식별을 포함 하 여 넓은 응용 프로그램에 항 생 저항입니다. 이 문서에서는, metagenomic 토양 DNA 연속 nanopore 시퀀싱 기술을 사용 하 여 종 식별을 위한 절차는 보여 줍니다.

Metagenomic 토양 분석 Nanopore DNA 시퀀싱

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

복잡 한 인간의 질병에 기여 하는 유전 이체의 소설 메커니즘을 식별 수 있습니다. 여기, 후보 유전자 또는 유전자 통로 분석 낮은 비용 범위를 극대화 하 고 코 호트 기반 연구 의무가 멀티플렉스 유전형 접근 방식을 설명 합니다.

후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트

필드에서 식물 뿌리의 발굴 뿐만 아니라 endosphere, rhizosphere, 및 토양 샘플의 처리는 DNA 추출 및 데이터 분석 방법 등 자세하게에서 설명 되어 있습니다. 이 문서는 토양, endosphere, rhizosphere microbiomes의 연구에 대 한 이러한 기법을 사용 하 여 다른 실험실을 사용 하도록 설계 되었습니다.

절연 및 토양, Rhizosphere, 및 다년생 잔디 실험에 뿌리에서 미생물 커뮤니티의 분석

이 프로토콜 자연 유기 물질과 다른 생태계에서 미생물 단백질의 완전 한 쌍 특성에 culminating 보완 분석 및 omics 기술에 대 한 단일 처리량을 설명 합니다. 이 이렇게 강력한 비교 대사 경로 및 변환을 설명 하는 온실 가스 생산 및 환경 변화에 대 한 응답을 예측에 대 한 중요 한 식별 수 있습니다.

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

이 프로토콜은 7 일 이내에 대규모 토양 샘플 세트에서 효모와 곰팡이 Aspergillus fumigatus를 배양하는 효과적이고 신속한 방법입니다. 이 방법은 실험에 필요한 다양한 인큐베이션 배지 및 온도를 수용하도록 쉽게 변형 될 수 있습니다.

곰팡이 개체군 구조를 조사하기 위해 토양에서 배양 가능한 효모와 곰팡이를 분리합니다.

배우세요 토양 샘플에서 대사물질, 단백질, 지질을 동시에 추출하는 MPLEx 프로토콜을 사용한 멀티-오믹스 분석 방법을. 이 기술은 정확성을 높이고 준비 시간을 단축하여 토양 미생물 군집 연구에 효과적입니다.

멀티-omic 토양 샘플의 분석을 위한 MPLEx 프로토콜

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