멀티-omic 토양 샘플의 분석을 위한 MPLEx 프로토콜

이 방법은 단백질체학, 대사체학 및 지질체학 분야에서 사용되며, 환경 교란으로 인해 토양 관련 미생물 군집에서 발생하는 분자 변화에 대한 포괄적인 정보를 얻는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 토양 샘플에서 여러 분석물을 얻을 수 있어 정밀도와 정확도가 높아지는 동시에 샘플 준비 시간과 노력이 줄어든다는 것입니다. 먼저 각 20g의 토양 샘플에 대해 10g의 무게를 두 개의 별도 50ml 메탄올/클로로포름 호환 튜브에 넣습니다.

클로로포름은 대부분의 플라스틱을 침출시켜 샘플을 오염시키므로 PTFE로 만든 플라스틱 튜브를 사용하십시오. 각 튜브에 약 10ml의 클로로포름 세척 스테인리스 스틸과 석류석 구슬을 추가합니다. 그런 다음 얼음 위에서 각 튜브에 4ml의 차가운 초순수를 넣고 얼음 양동이에 담긴 샘플을 흄 후드로 옮깁니다.

25ml 유리 혈청학 피펫을 사용하여 20ml의 얼음처럼 차가운 2:1 클로로포름을 튜브에 메탄올 부피/부피에 빠르게 첨가합니다. 뚜껑을 조이고 토양 혼합물을 용액으로 와류로 만듭니다. 클로로포름-메탄올은 원핵생물의 세포벽을 파괴하는 데 도움이 되며 효소 활동도 비활성화합니다.

다음으로, 튜브를 50밀리리터 튜브 와류 부착물에 부착하고 가능하면 냉장고 내부에서 섭씨 4도에서 10분 동안 수평으로 와류를 사용합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 80도의 영하 냉동고에 약 15분 동안 넣어 완전히 식힙니다. 그런 다음 흄 후드 내부의 프로브 초음파 발생기를 사용하여 얼음 위에서 30초 동안 60% 진폭의 6mm 1/4인치 프로브로 각 샘플을 초음파 처리합니다.

초음파 처리 후 초음파 처리는 많은 열을 발생시킬 수 있으므로 샘플을 섭씨 80도의 음의 냉동고에 넣습니다. 수평한 와류, 초음파 처리 및 어는 단계를 반복한 후에, 5 분 동안 4의, 000배 중력 및 4 섭씨 온도에 표본을 분리기. 이 시점에서 샘플은 상부 대사산물층, 단백질 중간층 및 하부 지질층으로 분리됩니다.

샘플을 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 흄 후드 내부에서 10ml 유리 혈청학 피펫을 사용하여 두 개의 50ml 튜브에서 하나의 큰 유리 바이알로 상부 대사 산물 층을 옮깁니다. 이제 50ml 튜브를 약간 기울여 단백질 중간층을 방출하여 하부 지질층에서 자유롭게 떠다니도록 합니다.

그런 다음 깨끗한 스테인리스 스틸 플랫 헤드 실험실 주걱을 사용하여 두 단백질 중간층을 조심스럽게 떠서 하나의 새로운 50ml 튜브에 함께 넣습니다. 25ml 유리 혈청학 피펫을 사용하여 하부 지질층을 하나의 큰 유리 바이알로 옮깁니다. 파편이 있는 두 개의 튜브와 단백질 중간층이 있는 하나의 튜브에 얼음처럼 차가운 메탄올 20ml를 추가합니다.

짧게 와류를 일으키고, 5 분 동안 4의, 000배 중력 및 4 섭씨 온도에 파편 펠릿 및 단백질 interlayer를 분리기화하십시오. 그런 다음 메탄올을 흄 후드 내부의 유해 폐기물 용기에 넣습니다. 단백질과 파편 알갱이를 액체 질소로 얼리고 동결 건조기에서 약 2시간 동안 건조시킵니다.

각 파편 펠릿에 50밀리몰 트리스 완충액, pH 8.0에 20ml의 단백질 가용화 완충액을 추가하고 단백질 중간층 튜브에 10ml를 추가합니다. 흄 후드에서 프로브는 30초 동안 20% 진폭으로 샘플을 초음파 처리하여 용액으로 가져옵니다. 2분 동안 샘플을 소용돌이칩니다.

그런 다음 단백질 중간층 샘플을 섭씨 50도의 실험실 튜브 회전기에 30분 동안 넣어 단백질을 용해시킵니다. 잔해 샘플을 추가로 10분 동안 수평으로 와류로 회전시켜 남아 있는 손상되지 않은 세포를 용해합니다. 그런 다음 나머지 20분 동안 단백질 중간층 샘플로 회전합니다.

10 분 동안 실온에서 4, 500 배 중력으로 모든 샘플을 원심 분리하고 샘플 당 각 튜브에서 상등액을 두 개의 50 밀리리터 튜브로 수집합니다. 단백질 중간층 펠릿에 10ml의 가용화 완충액을 추가합니다. 그런 다음 펠릿을 용액으로 다시 초음파 처리하고 와류로 만듭니다.

분리기 다음, 동등하게 파편 펠릿 상등액을 가진 2개의 50 밀리리터 관으로 상층액을 결합하고, 어떤 잔여 파편든지 펠릿 펠릿 하기 위하여 10 분 동안 8, 000 시간 중력 그리고 4 섭씨 온도에 조정 각 물통 회전자에 있는 관을 분리기로 만드십시오. 상등액을 두 개의 50ml 튜브로 나눕니다. 그런 다음 10ml 유리 혈청학 피펫을 사용하여 각 튜브에 7.5ml의 TCA를 추가합니다.

샘플을 용액으로 와류로 만듭니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 20도의 음의 냉동고에 2시간에서 하룻밤 동안 넣습니다. 침전된 단백질을 펠릿으로 만들기 위하여는, 10 분 동안 4, 500배 중력 및 4 섭씨 온도에 표본을 원심 분리하고, 폐기물로 상등액을 경사로 기울입니다.

각 단백질 펠릿에 100% 얼음처럼 차가운 아세톤 10ml를 첨가합니다. 튜브를 소용돌이치고 펠릿처럼 하나의 튜브로 결합하십시오. 원심분리기를 사용한 다음 아세톤을 디캔팅합니다.

더 적은 양의 아세톤을 사용하여 펠릿을 두 번 세척하고 최종 회전을 위해 서스펜션을 1.5 또는 2밀리리터 튜브로 옮깁니다. 상층액을 폐기물로 디캔팅하고 펠릿을 흄 후드의 종이 닦음에 거꾸로 건조시켜 약 20분 동안 기다립니다. 펠릿의 크기에 따라 단백질 가용화 완충액 100-200 마이크로 리터를 첨가하십시오.

펠릿을 용액으로 초음파 처리하고 와류로 만듭니다. 샘플은 단백질과 함께 침전되는 부식 물질로 인해 점성이 있을 수 있으며, 이는 후속 원심분리로 제거됩니다. 마지막으로, 인큐베이터 또는 셰이커에서 30분 동안 300rpm 및 40°C의 온도에서 샘플을 흔들어 단백질을 용액으로 용해시킨 후 단백질 분해를 진행하거나 향후 처리를 위해 급속 동결합니다.

이 비디오에서 시연된 MPLEx 프로토콜을 사용하여 캔자스 천연 대초원 토양에서 3, 376개의 펩타이드, 105개의 지질 및 102개의 극성 대사 산물을 추출했으며, 프로토콜의 단백질 추출을 역상 LC-MS/MS를 사용한 단백질 추출 키트 및 SDS 추출과 비교합니다. 상업적인 단백질 적출 장비 및 SDS 방법의 3개의 반복을 처음에 비교할 때, 단지 펩티드의 12%만이 2개의 기술 사이에서 겹쳤으며, 이는 미생물 군집의 복잡성과 다른 추출 효과를 보여주었습니다. MPLEx를 상용 단백질 추출 키트 및 SDS 추출물과 비교한 결과, MPLEx 방법을 사용하여 관찰된 펩타이드의 약 38%가 SDS 및/또는 상용 키트 추출을 사용할 때도 검출되었습니다.

캔자스 토양 박테리아 군집의 종 수와 메타게놈을 고려할 때 펩타이드 식별의 중복은 합리적입니다. 여기에서 볼 수 있듯이 MPLEx 접근법의 광범위한 적용 가능성은 이전에 고세균 S.acidocaldarius, unicyanobacterial 컨소시엄, 마우스 뇌 피질 조직, 인간 소변 및 A.thaliana의 잎을 사용하여 평가되었습니다. 모든 경우에서 MPLEx 분석법에서 관찰된 단백질의 수는 대조군의 수와 유사했으며, 이는 다양한 샘플 유형에 대한 유용성을 나타냅니다.

이 동영상을 시청한 후에는 단일 토양 샘플에서 단백질, 대사 산물 및 지질을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 토양 유형이 다르기 때문에 유연하게 대처하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 단백질 중간층의 크기는 토양에 존재하는 토양 바이오매스와 부식질 물질에 따라 달라집니다.

클로로포름으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 시도하는 동안 항상 흄 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.