Name: 사용 하 여 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝-라벨 (TUNEL) 및 Caspase 3/7 Chytridiomycosis와 개구리에 측정 상피 세포 죽음을 분석 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 배우세요 TUNEL 및 Caspase 3/7 분석을 사용하여 개구리 상피 세포에서 키트리디오미코시스 감염에 의한 세포사멸을 정량화하는 방법을. Batrachochytrium dendrobatidis 감염과 세포사멸의 관계를 규명하여 양서류 보전 전략 수립에 기여합니다.

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우리 축산 및 데이터 수집 지원 다음과 같은 사람들에 게 감사: D. Tegtmeier, C. 드 종, J. 호크스, K. Fossen, S. 퍼시벌, M. 맥 윌리엄스, L. Bertola, M., 명 Harney, 스튜어트와 T. Knavel; 그리고 해와 지원에 대 한 M. Merces입니다. 우리 또한 M. 맥 퍼 든, 피 할로 타롱가 동물원 alpina v. L., 양육에 대 한 G. Marantelli P. 코양육에 대 한 감사 하 고 싶습니다. F. Pasmans, A. 마 텔 apoptosis 분석 실험, C. 콘스탄틴, A. Kladnik, R. Webb TUNEL 분석 결과, 지원에 대 한 조언 감사 그리고 T. Emeto와 W. Weßels에 대 한 프로토콜 및 caspase 3/7 분석 결과 대 한 키트 도움이. 이 원고와 프로토콜은 Brannelly 외 2017 피어 J22. 에서 적응

제임스 쿡 대학 승인 응용 프로그램 A1875 P. 코 와 A1897 및 A2171 L. alpina 대동물 윤리.
1. 축산 및 모니터링
<ol><li>적절 한 물, 수 유 및 일정을 청소와 종족에 대 한 적절 한 환경에서 동물을 개별적으로, 집. 매일 동물을 확인 합니다.<ol>
<li>비판적으로 멸종 위기에 놓인된 Pseudophryne 코 의 성인 개인 (TUNEL 분석 결과, 제 4)를 사용 하 고 (Caspase 3/7 분석 결과, 5)에 대 한 위협된 Litoria verreauxii 피나 에서 기증 포로 사육 시설. 이끼에 15-18 ° C에서 동물을 유지 하 고 자갈 기판, 역방향 삼 투 물으로 매일 그들을 안개 창 로드 귀뚜라미와 3 번 매주 피드.</li>
	</ol>
</li>
	<li>매주 각 개인 한 번에 데이터를 수집 합니다. 면봉 Bd 에 대 한 개인 단계 2.1에 설명 된 대로. Neared 0.1 g, 규모를 사용 하 여 각 동물의 무게 하 고 그들의 주 둥이 환기 (SVL) 길이 다이얼 캘리퍼스를 사용 하 여 가장 가까운 0.01 m m를 측정 한다.</li>
	<li>(섹션 3에서 설명)로 접종 후 매일 동물 윤리 지침을 준수 (불규칙 한 피부 슬 라우, inappetence, 다리 빨갛게, 혼 수, 또는 지연된 righting 반사) 감염의 임상 증상에 대 한 동물을 확인 합니다. 임상 증상 및 병 적 동물을 안락사.<ol>
<li>Tricaine methanesulfonate (MS222)의 과다와 안락사 (0.1 %w / v MS222 ~ 세 수도 물에 중 탄산 나트륨으로 pH 6-7). 10 분 후 모든 움직임을 중단 하 고 그들은 자극에 대 한 응답이 표시 MS222에 동물 유지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bd 감염에 대 한 테스트
<ol><li>Bd 를 보라고
	<ol>
<li>새로운 살 균 주 면봉 (동물 당 1 개의 면봉)으로 각 동물 면봉. 다음 swabbing 메서드를 사용 하 여:는 venter에 5 번, 5 번 각 허벅지, 측면, 그리고 다리에. 이것은 45 획의 총 이다.</li>
		<li>부드럽게 돌려 면봉 중 DNA의 효과적인 캡처 되도록 선 사이의. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 면봉 끝을 끊다 고 추출까지-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA 추출 및 정량 분석 결과<ol>
<li>0.5 m m 실리 카 구슬의 30-40 mg와 상용 DNA 추출 시 약의 50 µ L을 추가 하 여 면봉에서 게놈 DNA를 추출 합니다. 구슬 구슬 때리는 셀 disrupter 2 분에 대 한 최대 속도에서 샘플을 이길. 비드 때리는 단계 1 분에 2000 x g에서 샘플 원심.</li>
		<li>10 분, 100 ° C에서 샘플을 품 어과 냉각 수 있습니다. 3 분, 5000 x g에서 샘플 원심 다음 개별 1.5 mL 마이크로 원심 관에는 상쾌한을 전송 하 고 정량까지-20 ° C에서 저장.</li>
		<li>사용 양이 많은 PCR (정량) 다음 보일 외. 200418 감염 부하 분석을 합니다. 사용 하 여 다음과 같은 수정:<ol>
<li>DNA 추출 샘플 6:100 이중 이온을 제거 된 물으로 희석. 각 잘 PCR 저해 방지를 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 0.7 µ L를 추가 합니다. Singlicate에서 각 샘플을 실행 합니다. 각 접시에 네거티브 (템플릿) 제어 및 긍정적인 통제 희석 기준의 시리즈를 사용 zoospore (감염) 부하 추정.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 접종
<ol><li>문화 Bd
	<ol>
<li>Tryptone의 16 g, 젤라틴의 2 세대 및 4g 유 (TGHL)의 이온을 제거 된 물 1 L에 추가 하 여 문화 국물을 준비 합니다. 오토 클레이 브 (40 분 동안 121 ° C) 냉각 국물을 허용.</li>
		<li>(이 경우, 뉴 사우스 웨일즈 격리, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, 통로 번호 11에서에서 분리)에 Bd 분리 접종 TGHL 국물에 23 ° C에서 7 d에 대 한 성장 그리고 TGHL 한 천 배지를 국물 문화를 전송.</li>
		<li>접시, 추가 tryptone의 16 g, 젤라틴의 2 세대, 유 당 (TGHL)의 4 g와 세균 agar의 10 g의 이온을 제거 된 물, 고압 (40 분 동안 121 ° C) 1 l. 일단 혼합물은 충분히 멋진 터치, 하지만 그것은 고형화 하기 전에 TGHL agar에 붓고 92 m m 직경 문화 접시 그래서 그들은 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 1/4 ~ 1/3 가득.</li>
		<li>때는 한 천 경화가 고 완전히 냉각, 각 접시 액체 국물에서 Bd 의 0.5 mL를 접종 하 고 균등 하 게 확산. 약 1 시간에 대 한 접시에 건조 하 고 다음 플라스틱 파라핀 영화와 번호판 봉인 Bd 국물 혼합물을 허용 한다. 5-7 d 23 ° C에서 내려 접시 한 쪽을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>홍수 zoospore 접종 솔루션에 대 한 번호판<ol>
<li>접종 전에 매일 생존을 보장 하기 위해 거꾸로 가벼운 현미경 zoospore 운동 성을 확인 합니다. Zoospore 릴리스는 높은, 많은 zoospores는 sporangia 외부 수영으로 때 문화는 접종에 대 한 준비.</li>
		<li>접시에 물을 붓는 하 고 물으로 출시 zoospores 수 있도록 10 분 동안 실 온에서 배양 하 여 각 접시 세 수도 물 또는 인공 연못 물 3 mL를 홍수. 인큐베이션 기간이 지난 후 새로운 멸 균 용기에 zoospore 현 탁 액을 가만히 따르다.</li>
		<li>견적 zoospore 농도 haemocytometer를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라. Zoospore 현 탁 액의 농도가 되 면, 세 꼭지 물 3 mL 당 1 x 106 zoospores의 농도에 정지 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동물 접종<ol>
<li>개별 50 mL 용기에서의 벤 터19 위로 쏟아지는 3 mL inoculum 혼합물에 의해 각 동물 접종. 초과 inoculum 접종 컨테이너의 자료로 수집을 허용 합니다. 감염, 되도록 24 h에 대 한 개별 접종 컨테이너에 각 동물을 두고 고 24 h 접종 후 소독된 terrarium을 각각 반환 합니다.<ol>
<li>울림 13% 볼륨/볼륨 (v/v) 상업적인 표 백제 솔루션20를 사용 하 여 소독, 두 번 이상 물으로 씻어 다음 보다 24 h 동안 건조를 허용 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bd에 대 한-컨트롤을 부정, 모의 3.2 3.3와 동일한 방법을 사용 하 여 동물 접종 하지만 Bd홍수- Bd 의 세 수돗물의 5 mL와 함께 무료 한 천 배지 대신는 한 천 배지를 주사.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. TUNEL 분석 결과
<ol><li>1.3.1, 단계 및 Bd의 동등한 수에서 설명한 대로 chytridiomycosis의 임상 증상을 보이고 있다 동물 안락사-부정적인 제어 동물.</li>
	<li>피부를 해 부 (등, 복 부, 그리고 허벅지) 각 동물에서 샘플. 4 %v / v 인산 염 버퍼 포름알데히드에 2 h의 피부 샘플을 수정. 짧은 하 고 일관 된 시간을 고정 수 있습니다 완벽 하 게 고정, 조직 뿐만 아니라 효과적이 고 정확한 immunohistochemistry 얼룩에 대 한 수 있습니다. 다음 단면에 대 한 포함까지 80% 에탄올으로 전송 합니다.</li>
	<li>다음과 같은 표준 메서드21조직학 준비를 위한 파라핀 왁 스에 피부를 포함 합니다. 간단히, 프로토콜은 다음과 같습니다.<ol>
<li>에탄올의 등급된 시리즈에 조직을 탈수 하 고 에탄올 크 실 렌을 취소 합니다. 파라핀 왁 스에 조직을 포함 하 고 한 파라핀 블록에 각각에 대 한 모든 세 가지 피부 샘플을 배치.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 표준 조직학 준비21톰을 사용 하 여 섹션 피부. 섹션 5 µ m에서 순차적으로 조직 하 고 친수성 유리 슬라이드에 부착. 피부 타입 슬라이드 당 당 4 개의 직렬 histosections 장소. 직렬 피부 섹션 개인 당 세 개의 슬라이드, 각 슬라이드 각 조직 부착의 4 개의 단면도 기억.</li>
	<li>다음과 같은 순서로 슬라이드를 얼룩:<ol>
<li>되며 (H & E) counterstaining 오신 다음으로 첫 번째 슬라이드를 얼룩. 이 슬라이드는 Bd sporangia 피부 내에서 위치를 시각화 하는 것입니다.</li>
		<li>조직학 준비에 대 한 상용 TUNEL 분석 결과 다음 두 번째 슬라이드를 얼룩 하 고 아래 설명 된 제조업체의 지침을 따르십시오.<ol>
<li>첫째, 세척, 당 5 분 크 실 렌의 3 개의 변경 슬라이드를 세척 하 여 coplin jar에서 조직 섹션 deparaffinize와 5 분 동안 100% 에탄올의 변화 2 함께 각 세척 하십시오. 5 분에 대 한 PBS의 한 세척과 95% 에탄올 3 분 그리고 3 분 마무리에 대 한 70% 에탄올의 한 세척을 따르십시오.</li>
			<li>갓 희석 단백질 소화 효소 (가수분해는 PBS에 희석 20 μ g/mL의 농도에서 K), 조직 pretreat을 슬라이드에 직접 추가 합니다. 15 분 세척 2 분 coplin jar에 PBS의 두 가지 변화에 대 한 알을 품을 수 있습니다.</li>
			<li>과잉 액체를 누르고 방 온도에서 2 분 동안 coplin jar에 PBS에 3.0%의 과산화 수소에에서 끄다. 린스 두 번 PBS, 5 분 동안 각 세척 합니다.</li>
			<li>과잉 액체를 누릅니다 다음 슬라이드에는 조직에 직접 평형 버퍼의 75 µ L/5 c m2 을 적용 합니다. 10 미 탭 섹션 주위 초과 액체를 incubate 고 터미널 deoxynucleotidyl tranferase (TdT) 효소의 55 µ L/5 c m2 을 적용 합니다. 37 ° c.에서 1 h 습도 챔버에 품 어</li>
			<li>작업 강도 중지/워시 버퍼, coplin jar에 슬라이드를 넣어 TdT 부 화 후 15 선동 s와 실 온에서 10 분 동안 품 어. 워시 워시 당 1 분에 대 한 PBS의 3 개의 변경 슬라이드. 과잉 액체를 누릅니다.</li>
			<li>안티 digoxigenin 공액 (rhodamine) 조직, 65 µ L/5 c m2에 실내 온도에 예 열을 적용. 온도 실 온에서 30 분 동안 습도 챔버에 incubate 고 빛에 노출 하지 마십시오. 워시 워시 당 2 분에 대 한 PBS의 4 개의 변화. 과잉 액체를 누릅니다.</li>
			<li>0.5-15 µ L 추가 하 여 마무리 역할 카운터 얼룩을 슬라이드에 슬라이드 설치 중간에 1 µ g/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole). 다음 커버 슬립 커버와 매니큐어 또는 고무 시멘트와 함께 인감. 분석 결과 빛에 민감한 어둠을 슬라이드 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>얼룩 세 번째 슬라이드 TUNEL 분석 결과 DAPI counterstain를 사용 하 여 스테인드는 하지만 각 샘플에 대 한 긍정적이 고 부정적인 제어로 사용. 참고: 컨트롤 슬라이드 4 histosections의 첫 번째 2는 긍정적인 제어 복제 되며 지난 2 부정적인 제어 복제.<ol>
<li>단계 4.5.2.2, 대신 긍정적인 컨트롤에 대 한 사전 DN 버퍼 (30 m m trizma, pH 7.2, 4 mM MgCl2, 0.1 m m DDT) 조직 치료 그리고 5 분 동안 실 온에서 품 어. 다음 Dnase I DN에 0.1ug의 최종 농도 대 한 버퍼를 분해 / mL, 슬라이드에 직접 적용. 실 온에서 15 분 동안 품 어.  그런 다음, 씻어 슬라이드 dH2O 5 세척 3 분 동안 각 세척. 과잉 액체를 되 리. 다음 단원의 4.5.2.3 지시 대로 TUNEL 분석 결과 다시 시작 합니다.</li>
			<li>부정적인 컨트롤에 대 한 추가 하지 마십시오 터미널 deoxynucleotidyl tranferase (TdT) 효소 그 샘플에 (섹션에서에서 설명한 대로 4.5.2.4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석 결과의 완료 되 면 즉시 TUNEL 슬라이드를 관찰 합니다.<ol>
<li>받아 사진을 무작위로 각 피부 부분 모두 rhodamine 얼룩, apoptotic 세포를 보여준다는 빨강과 DAPI는 모든 핵을 밝혀 나타나고 파란색 표시에 대 한 필터를 사용 하 여 형광 현미경을 사용 하 여 X 200에 따라 간격을의 오버레이 세포를 생성할 수 있습니다. 적어도 100 셀 샘플 당 피부 섹션 당 사진 확인 합니다. -20 ° c.에 있는 어두운 현미경 상자에 슬라이드 저장</li>
		<li>이미지 당 셀 (블루 DAPI 스테인드)을 계산. 적어도 100 셀 피부 섹션 당 계산 됩니다 확인 합니다. 100 셀에 도달, 이미지 내의 모든 셀을 계산. 적은 다음 100 셀 하나의 이미지에 존재 하는 경우 적어도 100 셀은 피부 섹션 동물 당 당에 도달할 때까지 또 다른 이미지를 계산 합니다.</li>
		<li>다음, 같은 이미지 (붉은 rhodamine 스테인드)에 TUNEL 긍정적인 셀의 수를 계산 합니다. TUNEL 긍정적인 세포 apoptosis와 괴 사 또는 배경 나타내는 명확한 세포 가장자리 (막 아무 세포와 본래 이다)와 단일 세포 이다. 때로는 세포 형태 apoptotic 시체를 축소합니다.</li>
		<li>TUNEL 분석 결과에 계산 영역 찾아서 H & E histosections 스테인드에 해당 영역을 분석 합니다. H & E 섹션 스테인드 보장 Bd, Bd 감염의 사이트에 해당 확인-감염 된 사이트 TUNEL 분석 결과에 apoptotic 세포를 계산 하는 경우에 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Caspase 3/7 분석 결과
<ol><li>( Bd-노출 및 Bd-부정) 각 동물에서 발가락 끝을 수집 한번 매주 3 주 게시물 접종, 및을 통해 격주 개인 당 8 발가락까지 실험의 끝.<ol>
<li>두 번째 지 골에서 화 염 소독가 위, 발가락 끝을 잘라 고 1.5 mL microtube 놓고-80 ° c.에 즉시 동결</li>
	</ol>
</li>
	<li>냉동된 발가락 샘플에서 단백질을 추출 합니다.<ol>
<li>2 스테인리스 구슬 (3.2 m m) 1.5 mL 나사 모자 microtube 샘플 버퍼 (25mm HEPES pH 7, 5 mM MgCl2)의 100 µ L에 샘플을 배치 합니다. 최대 속도 (1.2.1에서 사용 단계로 같은 구슬 때리는) 얼음에 3 분 뒤에 1 분 구슬의 4 사이클에 의해 샘플을 lyse. 세포의 용 해, 후 12000 g x와 5 분 수집 상쾌한 분석 결과에 사용을 위한 4 ° C에서 샘플 원심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bradford 분석 실험을 사용 하 여 샘플 당 단백질 농도 계량.<ol>
<li>384 잘 플레이트에서 Bradford 시의 10 µ L 10 µ L의 단백질 추출 혼합 하 고 실 온에서 2 분 동안 품 어. 중복에서 각 샘플을 실행, 5 시리즈와 함께 접어 BSA 희석 기준. 595에서 흡 광도 읽고 nm 흡 광도 플레이트 리더에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>또는, 발가락 끝 샘플 (단백질 농도 낮은 표준 근처 단계 4.3.1에서 Bradford 분석 실험에서 결정 또는 샘플링 개구리 3 g 총 중량) 너무 작은 경우, 표준화 샘플 피부 표면을 추정 하 여 Bradford 분석 실험 대신 사진을 사용 하 여 영역.<ol>
<li>Caspase 분석 결과 대 한 샘플에서 단백질을 추출 하기 전에 40 X 확대를 거꾸로 가벼운 현미경을 사용 하 여 각 발가락 사진.</li>
		<li>발가락의 위치를 추정 하 여 이미징 소프트웨어, 컴퓨터를 사용 하 여 발가락 샘플을 분석 합니다. 발가락 클립의 가장자리 주위 선 그리기 하 여이 작업을 수행 하 고 모양 내 이미징 소프트웨어 예상 지역. 다음 3 차원 피부 샘플의 표면적을 대략적인 것 이다 pi (3.14)를 곱하면 그 지역 (길이 단면적 x로 (pi x 직경) 튜브의 바깥 표면 영역을 제공).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Caspase 3/7 분석 결과 수행 합니다.<ol>
<li>384 잘 발광 접시에서 상용 caspase 3/7 시 약의 10 µ L 및 단백질 추출 10 µ L를 추가 합니다. 3 중에서 각 샘플을 실행 합니다.</li>
		<li>실 온에서 30 분 동안 빛에서 접시 15 미 품에 대 한 접시를 천천히 흔들어는 시 약을 혼합. 발광은 발광 격판덮개 리더를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

우리는 표 피 apoptosis와 세포 죽음의 치명적인 질병 chytridiomycosis 병리학 또는 Bd 취약 종에 질병 저항 메커니즘의 잠재적인 메커니즘으로 탐험. 우리 세포 죽음 표 피, 표 피 세포 죽음 분석, 현장에 대 한 분석 결과 TUNEL 및 감염의 진행을 통해 표 피 세포 죽음을 모니터링을 위한 caspase 3/7 분석 결과 평가의 두 가지 방법을 사용 합니다. 우리는 세포 죽음 및 apoptosis 감염 부하와 상관은 세포 죽음은 감염의 사이트에 훨씬 더 높은 발견. 초기 감염에는 표 피에 있는 apoptosis에 감소 하지만 apoptosis 감염된 조직 내의 병원 체 부담 증가로 증가.
세포에 있는 Apoptosis 이점 및 제한에 각각 수많은 다른 방법을 사용 하 여 테스트할 수 있습니다. 그것은 여러 분석 실험을 사용 하 여 결과 확인 하는 apoptosis와 세포 죽음을 연구 해야 합니다. 이 연구에서 우리는 조사 상...

양서류는 현재 발생 하나 모든 척추 동물 taxa1의 세계 생물 다양성의 가장 큰 손실. 이러한 하락의 주요 원인 치명적인 피부 질병 chytridiomycosis, Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2곰 팡이 병원 균에 의해 발생 이다. 병원 체는 표면적으로 표 피, 피부 기능 심한 전해질 손실, 심장 마비, 그리고 사망3결과의 중단으로 이어질 수 있는 감염. Bd 에 대 한 다양 한 잠재적인 호스트 면역 메커니즘은 현재 공부 되 고, 항균 성 펩 티 드4,5, 피부 세균 식물6,8, 면역 세포의 수용 체7, 그리고 림프 구 활동9,10. 그러나, 몇 가지 연구는 상피 apoptosis와 세포 죽음은이 치명적인 병원 체에 대 한 면역 메커니즘을 탐구 한다.
세포 죽음, apoptosis (프로그램 된 세포 죽음) 또는 괴 사 (unprogrammed 죽음), 표 피에서 통해 Bd 감염의 병리학을 있을 수 있습니다. 이전 연구 Bd 감염 세포내 접합의 피부 explants zoospore supernatants 생체 외에서11. 에 노출 되는 때 관찰 하기 때문에 apoptosis를 유도 수 있습니다 하는 것을 건의 한다. 또한, Bd에 퇴행 성 상피 변화-감염 된 개구리 전자 현미경12,13를 사용 하 여 관찰 된다. Transcriptomic 분석 나타냅니다 apoptosis 경로 감염 된 피부14, upregulated 양서류 splenocytes 그들은 체 외에서 Bd supernatants15에 노출 되 면 apoptosis를 받 다. Bd 를 일으킬 수 있는 제안 하는 증거의 증가 볼륨에도 불구 하 고 apoptosis와 호스트 죽음 생체 외에서 vivo에서 연구에 하거나 감염의 진행을 통해 메커니즘 부족 apoptosis를 계량 하는 세포. 또한, 그것 아니다 알려진 호스트 Bd 감염을 방지 하기 위해 면역 방어 전략으로 apoptosis를 사용 하는 경우 또는 apoptosis 질병의 병 리.
이 연구에서 우리가 감염된 동물에서 vivo에서 두 가지 방법을 사용 하 여 표 피 세포 죽음 및 apoptosis를 감지 목적: caspase 3/7 단백질 분석 결과, 및 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 현장에서 시험. 각 분석 결과 감지 세포 죽음16의 다른 측면, 함께 이러한 방법을 세포 죽음에 관련 된 메커니즘의 완전 한 이해를 제공 하 고 효과의 정확한 측정을 보장. Caspase 3/7 분석 결과 단정 이펙터 caspases 3, 7, 내장 및 외부 apoptosis 경로의 정량화를 가능 하 게의 활동. 반면, TUNEL 분석 결과 검색 DNA 파편, apoptosis, 괴 사 및 pyroptosis17를 포함 하 여 세포 죽음 메커니즘에 의해 발생 합니다. TUNEL 분석 결과 사용 하 여 세 가지 다른 피부 섹션을 사용 하 여 모두 임상적으로 감염 되 고 감염 되지 않은 동물의 표 피 내 세포 죽음의 위치를 조사 하는 우리: 고 등는 venter와 Pseudophryne 코의 허벅지. 이 메서드는 특정 상피 층 내에서 위치를 구별 뿐만 아니라 세포 죽음의 해 부 사이트를 식별 합니다. 우리는 다음 caspase 3/7 분석 결과 사용 하 여 Litoria verreauxii alpina에 8 주 감염을 통해 apoptosis의 시간 시리즈 정량화를 수행. 우리 같은 동물에서 발가락 끝 샘플을 격주 걸릴 고 caspase 3/7 활동 병원 체 감염 부하를 연결할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>POLARstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>발광 플레이트 리더</td></tr><tr><td>384 웰 플랫 클리어 바닥 플레이트</td><td>Corning</td><td>3707</td><td></td></tr><tr><td>384 웰 로우 플랜지 화이트 플랫 바닥 플레이트</td><td>Corning</td><td>3570</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacteriological (Oxoid)</td> <td>Fisher</td><td>OXLP0011B</td><td></td></tr><tr><td>Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Fisher</td><td>6764254</td><td></td></tr><tr><td>유당 육수 (옥소이드)</td><td>Fisher</td><td>OXCM0137B</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Fisher</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Tricane-S (MS-222)</td><td>Fisher</td><td>NC0872873</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Invitrogen</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>멸균 레이온 면봉</td><td>Medical Wire & 장비</td><td>MW-113</td><td></td></tr><tr><td>ApopTag Red 현장 세포사멸 감지 키트</td><td>Merck Millipore</td><td>S7165</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Bradford 시약</td><td>Pierce</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Caspase Glo&nbsp; 3/7</td><td>Promega</td><td>G8090</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 버퍼</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887-20ML</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1374248-1G</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 가수분해물 효소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0262</td><td></td></tr><tr><td>PBS (인산염 완충 식염수), pH 7.2 (1X)</td><td>Thermo/Life</td><td>20-012-043</td><td></td></tr><tr><td>Prepman</td><td>Thermo/Life</td><td>4318930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4444556</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Clorox 표백제</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof, 분자 등급</td><td>Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Scan 형광 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>3.2mm 스테인리스 스틸 비드</td><td>BioSpec</td><td>11079132SS</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 ITSI-3 Chytr (5&prime;-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3&prime;)</td><td>프라이머 및 프로브용</td> <td>Taqman</td><td></td> 개별 설계</tr><tr><td>프라이머 5.8S Chytr (5&prime;-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3&prime;)</td><td>Taqman</td><td></td><td>프라이머 및 프로브에 대한 개별 설계</td></tr><tr><td>마이너 그루브 바인더 프로브 Chytr MGB2(5&prime;-CGAGTCGAAC-3&prime;)</td><td>Taqman</td><td></td><td>프라이머 및 프로브를 위한 개별 설계</td></tr><tr><td>Rotor-Gene qPCR 기기</td><td>Qiagen</td><td></td><td>qPCR 기계</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 1.5ml</td><td>Fisher</td><td>02-681-372</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 페트리 플레이트</td><td>Nunc</td><td>263991</td><td></td></tr><tr><td>Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm</td><td>BioSpec</td><td>11079105Z</td><td></td></tr></tbody></table>

사용 하 여 터미널 전이 효소 중재 dutp 닉 끝-라벨 (tunel) 및 caspase 3/7 chytridiomycosis와 개구리에 측정 상피 세포 죽음을 분석 실험

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

양서류 세계적으로 생물 다양성에 큰 손실을 겪고 그리고 주요 원인 중 하나 전염병 chytridiomycosis. 이 병은 곰 팡이 병원 균 Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), 감염 하 고 개구리 표 피;를 방해에 의해 발생 그러나, 병 적인 변화는 계속 명시적으로 특징 되지. Apoptosis (프로그램 된 세포 죽음) 호스트 조직 손상에 병원 균에 의해 사용할 수 있습니다 하지만 병원 체 제거에 대 한 질병 저항의 호스트 메커니즘을 수도 있습니다. 이 연구에서 우리는 두 개의 서로 다른 분석 실험을 사용 하 여 감염 되 고 감염 되지 않은 동물의 표 피 세포 죽음 계량: 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝-라벨 (TUNEL) 및 caspase 3/7. 사용 하, 등, 복 부 및 허벅지 피부 조직을 TUNEL 분석 결과에 우리가 관찰 세포 죽음 표 피 세포에는 제자리에서 임상적으로 감염 된 동물의 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 감염 되지 않은 동물 세포 죽음을 비교. 표 피에서 apoptosis 수준 감염의 과정을 통해 변경 하는 방법을 결정 하기 위해 우리는 8 주 동안 격주 발가락 끝 샘플을 제거 하 고 추출 된 단백질 caspase 3/7 분석 결과 사용 하 여 샘플 내에서 활동을 계량. 우리는 다음 감염 부하 caspase 3/7 활동을 상관 관계. TUNEL 분석 결과 세포 죽음에서 제자리에서의 지역화에 대 한 유용 하지만 비용과 시간 샘플 당 집중. Caspase 3/7 분석 결과 큰 샘플 크기와 시간에 대 한 효율적인 실험 과정. 그러나, 개구리 발가락 팁 biopsies 작기 때문에 있다 제한 추출 샘플 표준화 Bradford 분석 실험과 같은 단백질 정량화 방법을 통해 사용할 수 있습니다. 따라서, 피부 표면 영역 샘플 표준화 동안 추출 물을 사용 하지 않으려면 발가락 biopsies의 사진 분석을 통해 추정 하는 것이 좋습니다.

TUNEL 분석 결과
감염된 제어 동물에 더 많은 TUNEL 긍정적인 세포 보다 감염 된 동물에 있었습니다. 셀에 달랐다 긍정적인 TUNEL 제자리에 위치 감염 하 고 동물을 제어. 제어 동물, TUNEL 셀 및 표 피는 피부를 통해 피부 레이어 (참조 그림 1A), 수준 낮은 하지만 감염 된 동물에 TUNEL 긍정적인 세포 표 피 (그림에에서 더 자주 긍정적인의 동등한 배급이 했다 1B). 감염 (H &amp; E 슬라이드 스테인드 관찰)로의 사이트 했다 관찰 clumped Bd sporangia 허벅지와 복 부 피부 등 섹션에서 없음 섹션을 통해 흩어져. TUNEL 동안 긍정적인 세포에 집중 되었고 직접 감...

우리는 두 가지 방법을 사용 하 여 chytridiomycosis와 개구리에서 상피 세포 죽음 계량. 먼저, 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 제자리에서 조직학 사용 하 여 임상적으로 감염 되 고 감염 되지 않은 동물 간의 차이 확인 하려면. 둘째, 우리는 caspase 3/7 단백질 분석을 사용 하 여 감염을 통해 apoptosis의 시간 시리즈 분석을 실시 합니다.

사용 하 여 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝-라벨 (TUNEL) 및 Caspase 3/7 Chytridiomycosis와 개구리에 측정 상피 세포 죽음을 분석 실험

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

이 실험의 전반적인 목표는 양서류 곰팡이 병원균인 batrachochytrium dendrobatidis가 개구리의 표피 조직에서 세포사멸 및 세포 사멸에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 감염이 세포 사멸을 유발하는지 또는 반대로 감염에 대한 면역 메커니즘이 있는지 여부와 같은 야생 동물 질병을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 작은 조직 생검 샘플에 대해 수행할 수 있으므로 감염 과정 전반에 걸쳐 작은 개체를 반복적으로 샘플링할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플 조직이 있는 친수성 유리 슬라이드를 준비합니다. 조직 부분을 파라핀화하려면 코플린 병에서 각각 5분씩 자일렌으로 슬라이드를 세 번 씻습니다. 다음으로, 100% 에탄올이 함유된 슬라이드를 각각 5분씩 2회씩 세척합니다.그런 다음 95% 에탄올과 70% 에탄올로 슬라이드를 각각 3분 동안 세척합니다. 그런 다음 PBS로 5분 동안 슬라이드를 한 번 씻습니다. 실험 및 음성 대조군 슬라이드를 준비하려면 새로 희석된 proteinase K를 슬라이드에 직접 첨가하여 조직을 전처리합니다.슬라이드를 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS에서 슬라이드를 각각 2분씩 두 번씩 세척합니다. 양성 대조군 슬라이드를 준비하려면 DN 버퍼로 조직을 전처리한 다음 슬라이드를 실온에서 5분 동안 배양합니다.그런 다음 DNase 1을 DN 완충액에 최종 농도 0.1 μm per millil로 용해시킵니다. 준비된 DNase 용액을 슬라이드에 추가합니다. 슬라이드를 실온에서 15분 동안 배양합니다.그런 다음 코플린 병에 증류수로 슬라이드를 3분씩 5회 세척합니다. PBS의 3% 과산화수소에서 실온에서 5분 동안 반응을 담금질합니다. 그런 다음 PBS에서 슬라이드를 각각 2분씩 두 번씩 씻습니다.그런 다음 슬라이드의 조직에 평형 완충액을 추가합니다. 실온에서 10초 동안 배양합니다. 그런 다음 조직 섹션 주변의 여분의 액체를 두드리십시오.반응 완충액에 묽은 말단 deoxynucleotidyl transferase 효소를 희석합니다. 그런 다음 실험 및 양성 대조군 슬라이드의 조직에 추가합니다. 섭씨 37도의 가습실에서 1시간 동안 배양합니다.그 후, 스톱 버퍼의 작동 농도가 들어 있는 코플린 항아리에 슬라이드를 놓습니다. 15초 동안 교반한 다음 실온에서 10분 동안 슬라이드를 배양합니다. 그런 다음 PBS로 슬라이드를 각각 1분씩 3회 세척하고 여분의 액체를 두드리십시오.다음으로, 실온으로 예열된 항 디곡시제닌 접합체를 조직에 직접 첨가합니다. 슬라이드를 가습된 어두운 챔버에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 완료된 후 PBS로 슬라이드를 각각 2분씩 4회 세척합니다.여분의 액체를 두드리십시오. 그런 다음 슬라이드에 장착 매체를 추가합니다. 슬라이드의 장착 매체에 15마이크로리터의 DAPI 솔루션을 추가합니다.각 슬라이드를 커버 슬립으로 덮고 매니큐어로 밀봉합니다. 슬라이드를 어둠 속에서 말리십시오. 형광 현미경을 사용하여 스탠딩 프로세스가 완료되는 즉시 슬라이드를 관찰합니다.각 스킨 섹션을 따라 무작위 간격으로 400회씩 사진을 촬영합니다. DAPI로 염색된 파란색 세포를 계수하여 동물당 피부 섹션당 최소 100개의 세포가 보이도록 합니다. 다음으로, 투명한 세포 가장자리가 있는 빨간색 단일 세포로 나타나는 TUNEL 양성 세포의 수를 계산합니다.먼저 도립 광 현미경을 40회 사용하여 개구리의 각 발가락 사진을 찍습니다. 발가락 클립의 가장자리 주위에 선을 그리고 이미징 소프트웨어를 사용하여 모양 내의 영역을 추정합니다. 3차원 피부 샘플의 표면적을 평가하려면 추정된 면적에 pi를 곱합니다.얼어붙은 개구리 발가락 샘플에서 단백질을 추출하려면 100마이크로리터의 샘플 버퍼와 2개의 스테인리스 스틸 비드가 들어 있는 1.5ml 나사 캡 미세 원심분리 튜브에 샘플을 넣습니다. 최대 속도로 비드 비터를 사용하여 세포를 용해시킵니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 3분 동안 놓습니다.그런 다음 튜브를 원심 분리하여 상층액을 수집합니다. 384웰 플레이트에서 caspase 3/7 분석을 수행하려면 10마이크로리터의 샘플 버퍼를 블랭크로 추가하고 10마이크로리터의 단백질 추출물을 3배로 추가합니다. 그런 다음 시판되는 caspase 3/7 시약 10마이크로리터를 단백질 추출물과 블랭크 웰에 피펫팅합니다.그런 다음 플레이트를 15초 동안 부드럽게 흔들어 두 시약을 섞습니다. 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 마지막으로 발광판 판독기를 사용하여 샘플의 발광을 측정합니다.이 연구에서 감염된 동물은 빨간색 또는 분홍색으로 염색된 세포로 표시된 것처럼 대조군 동물에 비해 훨씬 더 많은 TUNEL 양성 세포를 나타냅니다. 대조 동물에서는 TUNEL 양성 세포가 거의 없으며 표피에 집중되어 있지 않습니다. 감염된 동물의 경우, TUNEL 양성 세포가 표피에서 더 빈번하게 발생합니다.TUNEL 양성 세포는 감염된 세포의 시야에 더 집중되어 있고 바로 근처에 있습니다. 또한, 진균 병원체가 서식하는 곳보다 더 깊은 표피층과 표피층에 더 널리 퍼져 있습니다. 감염된 동물의 경우, 세 가지 피부 유형 모두에서 튜넬 양성 세포가 더 많으며, 특히 허벅지와 벤터 피부에서 높은 수치를 보입니다.카스파제 분석에서 감염 강도는 카스파제 3/7 활성과 양의 상관관계가 있습니다. 또한, 감염된 동물과 감염되지 않은 동물에서 카스파제 3/7 활성은 시간이 지남에 따라 달랐다. Caspase 3/7 활성은 접종 후 처음 몇 주 동안 감소한 후 감염된 동물에서 7주 말에 증가했습니다.Caspase 3/7 활성은 감염되지 않은 개인에서 일정하게 유지되었습니다. TUNEL 분석 절차를 시도하는 동안 감도 손실을 방지하고 염료를 보호하기 위해 슬라이드를 서늘하고 어두운 곳에 보관하기 위해 분석 당일에 슬라이드를 읽는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 양서류 피부와 같은 작은 조직 샘플에서 두 가지 다른 검출 방법을 사용하여 세포사멸과 세포 사멸을 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

using-terminal-transferase-mediated-dutp-nick-end-labelling-tunel

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

불후의 N19 - oligodendrocyte 세포 문화에 caspase - 3의 중재 apoptosis의 라이브 세포 이미징의를...

모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

우리는 마우스 배아의 프로그래밍 세포 죽음의 영역 (PCD)와 LysoTracker라는 높은 가용성 염료를 사용하여 배아 줄기 (ES) 세포 문화를 차별화를 시각화하는 간단한 프로토콜을 제시한다.

태아의 프로그래밍 셀 죽음을 감지 할 LysoTracker의 이용 및 배아 줄기 세포를 차별화

이 비디오에서는 샘플에서 세포사멸 세포의 존재를 검출하기 위해 TUNEL 분석이 수행됩니다. 이 연구는 형광 현미경으로 관찰하고 식별할 수 있는 단편화된 DNA의 3' 말단에 표지된 dUTP를 추가하는 촉매 역할을 하는 특수 DNA 중합효소(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하는 것과 관련이 있습니다.

Terminal Transferase-Mediated dUTP Nick End-Labeling—TUNEL Assay: An In Situ Method to Detect DNA Fragmentation in apoptotic cells(말단 전이효소 매개 dUTP 닉 말단 라벨링—TUNEL 분석법: 세포사멸 세포에서 DNA 단편화를 검출하는 현장 방법)

이 동영상은 세포 사멸 또는 세포사멸을 정량화하기 위한 체외 Caspase-3/7 발광 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 pro-luminescent DEVD 기질의 caspase-3/7 절단 후 생성된 발광을 측정합니다. 생성된 발광은 caspase-3/7 활성에 비례합니다.

Caspase-3/7 Assay: 개구리 피부 이식에서 Caspase-3/7 활성을 측정하여 세포사멸을 정량화하는 발광 기반 분석

특정 유전적 교란이나 독소에 대한 노출은 정상적인 발달 과정을 방해하여 특정 세포 유형의 사멸로 이어질 수 있습니다. 제브라피시 배아에서 전체 마운트 면역형광에 의한 활성화된 Caspase 3 분석은 특이적으로 세포사멸을 겪고 있는 세포의 단계 및 조직 특이적 국소화를 보여줍니다.

활성화된 카스파아제 3을 검출하기 위한 전체 마운트 면역형광에 의한 제브라피시 배아의 세포사멸 분석

양서류 Batrachochytrium의 dendrobatidis 감염은 감소 된 농도 (0.0025 %) 및 일반적으로 사용되는 것보다 이트라코나졸의 짧은 기간 (6 일 동안 오분 화장실)을 사용하여 제거 할 수있다. 이하 사망률과 적은 부작용이 변경됨 치료 프로토콜을 사용하여 관찰 하였다.

감소 이트라코나졸의 농도와 지속 시간은 치료의 성공<em&gt; Batrachochytrium의 dendrobatidis</em&gt; 수륙 양용 비행기에 감염

멀티 플렉스 분석은 기본 세포 메커니즘에 대한 유익한 정보를 제공하고 시약 및 불필요한 반복 실험의 낭비를 제거 할 수 있습니다. 우리는 팔 미트 산으로 산화 반칙으로 체외 시상 하부 모델에서 세포 생존을 결정하기 위해, 형광 및 발광 기반의 방법을 사용하여, 여기에 멀티 플렉스 카스파 3 / 7 활동 분석에 대해 설명합니다.

시상 하부 세포 모델에서 세포 사멸을 결정하는 카스파 다중 분석의 사용

이 비디오는 마우스 골격근의 해부, 조직 처리, 절편 및 형광 기반 TUNEL 라벨링에 대해 설명합니다. 또한 TUNEL 라벨링의 반자동 분석 방법에 대해서도 설명합니다.

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석 현장에서 TUNEL 방법을 사용하여

Anastasis는 vivo에서 감지 하는 세포 죽음 프로세스를 반대로 세포 형태학 상으로 정상적인 건강 한 세포와 구별할 수 있기 때문에 기술적으로 도전적 이다. 여기 우리는 감지 하 고 우리의 새로 개발 된 vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에서 anastasis 받아야 하는 셀 추적에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지

우리는 Chagas 질병의 원인 인자 인 Trypanosoma cruzi의 세 가지 수명주기 단계에서 β-galactosidase 활성을 측정하는 고처리량 비색 분석을 설명합니다. 이 분석은 트립파노시달 화합물을 쉽고 빠르며 재현 가능한 방식으로 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

체외 β-갈락토시다제를 발현하는 기생충을 이용한 트리파노소마 크루지 의 모든 생애주기 단계에 대한 약물 스크리닝

배우세요 TUNEL 및 Caspase 3/7 분석을 사용하여 개구리 상피 세포에서 키트리디오미코시스 감염에 의한 세포사멸을 정량화하는 방법을. Batrachochytrium dendrobatidis 감염과 세포사멸의 관계를 규명하여 양서류 보전 전략 수립에 기여합니다.

사용 하 여 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝-라벨 (TUNEL) 및 Caspase 3/7 Chytridiomycosis와 개구리에 측정 상피 세포 죽음을 분석 실험

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