사용 하 여 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝-라벨 (TUNEL) 및 Caspase 3/7 Chytridiomycosis와 개구리에 측정 상피 세포 죽음을 분석 실험

이 실험의 전반적인 목표는 양서류 곰팡이 병원균인 batrachochytrium dendrobatidis가 개구리의 표피 조직에서 세포사멸 및 세포 사멸에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 감염이 세포 사멸을 유발하는지 또는 반대로 감염에 대한 면역 메커니즘이 있는지 여부와 같은 야생 동물 질병을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 작은 조직 생검 샘플에 대해 수행할 수 있으므로 감염 과정 전반에 걸쳐 작은 개체를 반복적으로 샘플링할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플 조직이 있는 친수성 유리 슬라이드를 준비합니다. 조직 부분을 파라핀화하려면 코플린 병에서 각각 5분씩 자일렌으로 슬라이드를 세 번 씻습니다. 다음으로, 100% 에탄올이 함유된 슬라이드를 각각 5분씩 2회씩 세척합니다.

그런 다음 95% 에탄올과 70% 에탄올로 슬라이드를 각각 3분 동안 세척합니다. 그런 다음 PBS로 5분 동안 슬라이드를 한 번 씻습니다. 실험 및 음성 대조군 슬라이드를 준비하려면 새로 희석된 proteinase K를 슬라이드에 직접 첨가하여 조직을 전처리합니다.

슬라이드를 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS에서 슬라이드를 각각 2분씩 두 번씩 세척합니다. 양성 대조군 슬라이드를 준비하려면 DN 버퍼로 조직을 전처리한 다음 슬라이드를 실온에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 DNase 1을 DN 완충액에 최종 농도 0.1 μm per millil로 용해시킵니다. 준비된 DNase 용액을 슬라이드에 추가합니다. 슬라이드를 실온에서 15분 동안 배양합니다.

그런 다음 코플린 병에 증류수로 슬라이드를 3분씩 5회 세척합니다. PBS의 3% 과산화수소에서 실온에서 5분 동안 반응을 담금질합니다. 그런 다음 PBS에서 슬라이드를 각각 2분씩 두 번씩 씻습니다.

그런 다음 슬라이드의 조직에 평형 완충액을 추가합니다. 실온에서 10초 동안 배양합니다. 그런 다음 조직 섹션 주변의 여분의 액체를 두드리십시오.

반응 완충액에 묽은 말단 deoxynucleotidyl transferase 효소를 희석합니다. 그런 다음 실험 및 양성 대조군 슬라이드의 조직에 추가합니다. 섭씨 37도의 가습실에서 1시간 동안 배양합니다.

그 후, 스톱 버퍼의 작동 농도가 들어 있는 코플린 항아리에 슬라이드를 놓습니다. 15초 동안 교반한 다음 실온에서 10분 동안 슬라이드를 배양합니다. 그런 다음 PBS로 슬라이드를 각각 1분씩 3회 세척하고 여분의 액체를 두드리십시오.

다음으로, 실온으로 예열된 항 디곡시제닌 접합체를 조직에 직접 첨가합니다. 슬라이드를 가습된 어두운 챔버에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 완료된 후 PBS로 슬라이드를 각각 2분씩 4회 세척합니다.

여분의 액체를 두드리십시오. 그런 다음 슬라이드에 장착 매체를 추가합니다. 슬라이드의 장착 매체에 15마이크로리터의 DAPI 솔루션을 추가합니다.

각 슬라이드를 커버 슬립으로 덮고 매니큐어로 밀봉합니다. 슬라이드를 어둠 속에서 말리십시오. 형광 현미경을 사용하여 스탠딩 프로세스가 완료되는 즉시 슬라이드를 관찰합니다.

각 스킨 섹션을 따라 무작위 간격으로 400회씩 사진을 촬영합니다. DAPI로 염색된 파란색 세포를 계수하여 동물당 피부 섹션당 최소 100개의 세포가 보이도록 합니다. 다음으로, 투명한 세포 가장자리가 있는 빨간색 단일 세포로 나타나는 TUNEL 양성 세포의 수를 계산합니다.

먼저 도립 광 현미경을 40회 사용하여 개구리의 각 발가락 사진을 찍습니다. 발가락 클립의 가장자리 주위에 선을 그리고 이미징 소프트웨어를 사용하여 모양 내의 영역을 추정합니다. 3차원 피부 샘플의 표면적을 평가하려면 추정된 면적에 pi를 곱합니다.

얼어붙은 개구리 발가락 샘플에서 단백질을 추출하려면 100마이크로리터의 샘플 버퍼와 2개의 스테인리스 스틸 비드가 들어 있는 1.5ml 나사 캡 미세 원심분리 튜브에 샘플을 넣습니다. 최대 속도로 비드 비터를 사용하여 세포를 용해시킵니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 3분 동안 놓습니다.

그런 다음 튜브를 원심 분리하여 상층액을 수집합니다. 384웰 플레이트에서 caspase 3/7 분석을 수행하려면 10마이크로리터의 샘플 버퍼를 블랭크로 추가하고 10마이크로리터의 단백질 추출물을 3배로 추가합니다. 그런 다음 시판되는 caspase 3/7 시약 10마이크로리터를 단백질 추출물과 블랭크 웰에 피펫팅합니다.

그런 다음 플레이트를 15초 동안 부드럽게 흔들어 두 시약을 섞습니다. 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 마지막으로 발광판 판독기를 사용하여 샘플의 발광을 측정합니다.

이 연구에서 감염된 동물은 빨간색 또는 분홍색으로 염색된 세포로 표시된 것처럼 대조군 동물에 비해 훨씬 더 많은 TUNEL 양성 세포를 나타냅니다. 대조 동물에서는 TUNEL 양성 세포가 거의 없으며 표피에 집중되어 있지 않습니다. 감염된 동물의 경우, TUNEL 양성 세포가 표피에서 더 빈번하게 발생합니다.

TUNEL 양성 세포는 감염된 세포의 시야에 더 집중되어 있고 바로 근처에 있습니다. 또한, 진균 병원체가 서식하는 곳보다 더 깊은 표피층과 표피층에 더 널리 퍼져 있습니다. 감염된 동물의 경우, 세 가지 피부 유형 모두에서 튜넬 양성 세포가 더 많으며, 특히 허벅지와 벤터 피부에서 높은 수치를 보입니다.

카스파제 분석에서 감염 강도는 카스파제 3/7 활성과 양의 상관관계가 있습니다. 또한, 감염된 동물과 감염되지 않은 동물에서 카스파제 3/7 활성은 시간이 지남에 따라 달랐다. Caspase 3/7 활성은 접종 후 처음 몇 주 동안 감소한 후 감염된 동물에서 7주 말에 증가했습니다.

Caspase 3/7 활성은 감염되지 않은 개인에서 일정하게 유지되었습니다. TUNEL 분석 절차를 시도하는 동안 감도 손실을 방지하고 염료를 보호하기 위해 슬라이드를 서늘하고 어두운 곳에 보관하기 위해 분석 당일에 슬라이드를 읽는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 양서류 피부와 같은 작은 조직 샘플에서 두 가지 다른 검출 방법을 사용하여 세포사멸과 세포 사멸을 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.