Name: 합성 살 균 소의 건설 맞춤형 다양성 팹 라이브러리 표시 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 학습하세요 맞춤형 다양성을 가진 합성 인간 항체 라이브러리를 구축하는 방법을. 파이지 디스플레이 기술을 활용하여 동물 면역 없이 고친화성 항체를 선별하고 치료용 단클론 항체 개발에 활용할 수 있습니다.

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저자에 대 한 중요 한 의견 Kunkel의 방식 합성 팹 페이지 라이브러리 건설 Sidhu 연구소에서 박사 프레드릭 Fellouse 주셔서 감사합니다. 저자 감사 부인 Alevtina Pavlenco 및 높은 효율 전기 유능한 준비의 귀중 한 도움 Sidhu 실험실에서 다른 멤버 대장균 세포 및 고품질 뒤 ssDNA. 이 작품은 중국의 국가 자연과학 기초에 의해 지원 되었다 (허가 번호: 81572698, 31771006) DW 및 ShanghaiTech 대학으로 (부여 번호: F-0301-13-005) 항 체 공학의 실험실에.

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저자는 공개 없다.

높은 다양성, 팹 라이브러리 페이지 표시, 품질 관리 구성 하 체크 포인트 전기 유능한 세포, 뒤 ssDNA 서식 파일의 효율성의 품질 역량을 포함 하 여 건설 과정의 다양 한 단계를 모니터링 하는 데 필요한 CCC dsDNA 합성, electroporation, 팹 접는 성과 아미노산 Cdr의 팹 파지 클론의 시퀀스 분석 후 titer.
고수익 뒤 ssDNA의 순도 높은 mutagenesis 속도 대 한 필수적입니다. 우리의 경험에서는, 25 ° C에서 살 균 소 유도 하룻밤 37 ° C에서 살 균 소 유도 하룻밤에서 그 보다 더 뒤 ssDNA를 얻을 수 있습니다. 이것은 이전 보고서19일치 하 여 이다. SsDNA 추출에 관한 초기 플라스 미드 스핀 키트 (QIAprep)는 살 균 소 세포와 바인딩 MLB를 포함. 나중에, MLB 알 수 없는 이유로 단종 되었고 PB로 대체. 우리는 뒤 ssDNA의 수익률은 MLB 치료에서 PB 치료...

mAbs 기초 연구에서 질병 진단 및 치료에 이르기까지 광범위 한 응용 프로그램 있다. 2016, 현재 60 mAbs 자가 면역 질환, 암, 그리고 전염병1,2의 임상 치료에 대 한 미국 식품의 약 청 (USFDA)에 의해 승인 되었습니다.
1975 년 Kohler와 Milstein 보고 'hybridomas' 그리고이 기법은 라고도 셀룰러 소스에서 단일 클론 특이성의 항 체의 지속적인 세대를 위한 기술 의학 및 산업3 초석 이후 되고있다. ,4. 이 메서드에서 mAbs의 세대 항 원 생산, 마우스 면역, B 림프 톨의 추출, 치료 응용 프로그램에 대 한 불멸의 hybridoma 세포, 클론 선택, 형성 하기 위하여 myeloma 세포와 B 세포의 융해를 포함 하 여 다양 한 단계 필요 인간 화 인간 안티 마우스 항 체 (하 마)4,5을 피하기 위해 필요 합니다. 그러나,이이 기술에 대 한 항 독 소, 균, 그리고 높은 보존된 단백질을 포함 하 여 상대적으로 mAb 생산5에 대 한 vivo에서 면역 반응을 트리거링에 유효 하지 않습니다.
1978 년, 허 치 슨 외. 단일 가닥 살 균 소 바이러스6잔류물의 직접 mutagenesis는 oligonucleotide 사용 하 여 보고. 1985 년에, 스미스 보고 외국 유전자 파편 유전자 살 균 소의 외 투 단백질 III 인코딩 프레임에 융합 될 수 있다 하 고 따라서 그것의 infectivity7을 타협 하지 않고 살 균 소 표면에 표시 될 수 있습니다. 이 선구적인 작품에 면역, 순진한, 살 균 소 전시 항 체 라이브러리의 후속 건설에 대 한 토대를 마련 하 고 합성을 위한 단일 체인 변수 조각 (scFv)의 항 원 묶는 조각 (팹) 형식으로 형성 치료 mAb 개발8,9. 기술적인 관점에서 파지 디스플레이 기반 항 체 개발 hybridoma 기반 mAb 개발 일부 항 포즈 수 있는 한계를 우회 하는 데 도움이 수 있는 상호 보완적인 접근 방식을 제공 하 고는 인간 화 하는 과정 hybridoma 파생 된 항 체는 종종5가필요합니다. 2016, 현재 6 살 균 소 전시 파생 mAbs Humira, 류 마티스 관절염의 치료에 사용 되는 가장 성공적인 mAbs 중 하나를 포함 하 여 시장 승인 및 많은 파지 디스플레이 파생 된 항 체는 현재 임상의 다양 한 단계에서 조사10.
면역과 순 살 균 소 항 체 라이브러리, complementarity 결정의 다양성에 대 한 지역 (Cdr) 빛과 무거운 체인에 자연 면역 레 퍼 토리 (즉, B 세포에서)에서 파생 됩니다. 반면, 합성 살 균 소 항 체 라이브러리에서 Cdr의 다양성 완전히 인공입니다. 합성 접근 도서관 건축을 정밀 하 게 제어 순서 다양성의 디자인을 제공 항 체 구조의 기계 론 적인 연구에 대 한 기회를 제공 하 고 기능11,12. 또한, 합성 라이브러리 프레임 워크 라이브러리 건설 촉진 하류, 대규모 산업 개발11,12전에 최적화할 수 있습니다.
1985 년, Kunkel M13 살 균 소에 사이트 이동 돌연변이 효율적으로 소개 하는 단일 가닥 DNA (ssDNA) 템플릿 기반 mutagenesis 접근 보고13. 이 방법은 이후 살 균 소 전시 도서관의 건축을 위해 널리 사용 되었다. 화학적 합성된 DNA oligonucleotides 팹 Cdr에 다양성을 소개 하는 항 체 백본 템플릿을 phagemid에 통합 됩니다. 이 프로세스는 phagemid uracil 포함 된 ssDNA (뒤-ssDNA)로 표현 된다 고는 oligonucleotides는 Cdr에 단련는 이중 가닥 DNA (dsDNA) T7 DNA 중 합 효소 및 T4 DNA 리가 존재 합성 확장. 마지막으로, 생성 된 ds DNA electroporation에 의해 대장균 에 도입 될 수 있습니다.
높은 다양성, 살 균 소 전시 도서관 건설, 2 분 대 혼합 전기 유능한 세포와 covalently의 높은 전압 electroporation 닫힌된 원형 dsDNA (CCC-dsDNA) 신중 하 게 준비 한다. Sidhu 외. 전통적인 방법에서 크게 향상 된 라이브러리 다양성14전기-유능한 세포와 DNA의 준비를 수정.
이 프로토콜에서 우리는 합성 살 균 소 표시 팹 라이브러리의 109-1010 단일 electroporation에 얻을 수의 다양성을 건설 하는 방법을 설명합니다. 그림 1 에서는 도서관 건설 등의 개요: 1) 고효율 전기 유능한 세포 준비; 2) 뒤 ssDNA;의 추출 3) Kunkel 메서드 기반 oligonucleotide 감독 mutagenesis; 4) electroporation 그리고 계산 라이브러리 크기; 5) A/L 기반 ELISA 위한 단백질 폴딩 및 기능적 다양성 평가; 그리고 6) 다양성의 DNA 순서 분석. 모든 시 약, 긴장 및 장비 물자의 테이블에 나열 됩니다. 표 1 시 약 설치를 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M H3PO4</td><td>Fisher</td><td>AC29570</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tris, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>10 mM ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330-019</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP </td><td>dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 각각 25mM씩 함유하는</td> <td>GE 헬스케어</td><td>28-4065-60</td> 용액을 혼합합니다.</tr><tr><td>3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)</td><td>키르케고르 & Perry Laboratories Inc</td><td>50-76-02</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE</td><td>Invitrogen</td><td>24710030</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin, carb</td><td>Sigma</td><td>C1389</td><td>100 mg/mL in water,&nbsp; 0.22 &mu; M 필터 살균, 작업 농도 : 100 &Mu; g/mL입니다.</td></tr><tr><td>클로람페니콜, cmp</td><td>시그마</td><td>C0378</td><td>에탄올 중 100mg/mL, 0.22 &μ; M 필터 살균, 작업 농도 : 10 &Mu; g/mL입니다.</td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9620G</td><td></td></tr><tr><td>과립 한천</td><td>VWR</td><td>J637-500G</td><td></td></tr><tr><td>H2O2 과산화효소 기질</td><td>Kirkegaard & Perry Laboratories Inc</td><td>50-65-02</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin, kan</td><td>Fisher</td><td>AC61129</td><td>물에서 50 mg/mL,&nbsp; 0.22 &mu; M 필터 살균, 작업 농도 : 50 &MU; g/mL입니다.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>94046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>알파 Aesar</td><td>U19C015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Fisher</td><td>ND2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256</td><td>! 주의 NaOH는 화상을 유발합니다.</td></tr><tr><td>무지방 분유</td><td>, Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr>, <tr><td>PEG-8000</td>, <td>Fisher</td><td>BP233</td><td></td></tr>, <tr><td>단백질 A-HRP 접합체</td>, <td>Invitrogen</td><td>101123</td><td></td></tr>, <tr><td>QIAprep, Spin M13 키트</td>, <td>Qiagen</td><td>22704</td><td></td></tr>, <tr><td>QIAquick 젤 추출 키트,</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr>, <tr><td>QIAquick PCR 정제 키트,</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>재조합 단백질 L</td><td>Fisher</td><td>77679</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T7 DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274S</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린, tet</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td>물에 있는 50 mg/mL, 0. 22 &뮤; M 필터 살균, 작업 농도 : 10 &Mu; g/mL입니다.</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>피셔</td><td>0123-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>초순수 글리세롤</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td>25 mg/mL in ethanol, 작업 농도: 0.25 &mu; g/mL입니다.</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td></td><td>VWR DF0127-08</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.coli CJ236</td><td>New England Biolabs</td><td>E4141</td><td>유전자형: dut-&nbsp; 웅<섭>-</섭>&nbsp; thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). dU-ssDNA의 제조에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>E.coli SS320</td><td>Lucigen</td><td>60512</td><td>유전자형: [F'proAB+lacIq lacZ&Delta; M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 &Delta; (araABC-leu)7679 &델타; lacX74 galUgalK rpsL thi. 고효율 전기천공법(electroporation) 및 사상(filamentous) 박테리오파지 생산에 최적화되어 있습니다.</td></tr><tr><td>M13KO7</td><td>New England Biolabs</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2-cm 갭 전기천공법 큐벳</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well 2mL 딥웰 플레이트</td>, <td>Fisher</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>96웰 맥시소프 면역플레이트</td>, <td>Nunc</td><td>151759</td><td></td></tr><tr><td>배플 플라스크,</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>5811000096</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 병,</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM-630 electroporator</td><td>, BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetic 교반 막대</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher 원심분리기</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고속 쉐이커</td><td>TAITEK</td><td>MBR-034P</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 쉐이커</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-9002</td><td></td></tr><tr><td>96 및 384웰용 리퀴드 핸들러</td><td>RAININ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mutil-channel 피펫</td><td>RAININ</td><td>E4XLS</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 농축기</td><td>Merck</td><td>UFC803096</td><td></td></tr></tbody></table>

합성 살 균 소의 건설 맞춤형 다양성 팹 라이브러리 표시

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

단일 클론 항 체 (mAbs) 기초 연구와 의학에 대 한 수요는 매년 증가 하 고 있다. Hybridoma 기술 mAb 개발 이후 1975 년에 그것의 첫 번째 보고서에 대 한 지배적인 방법 되었습니다. 대체 기술, mAb 개발에 대 한 파지 디스플레이 방법으로 점점 더 매력적인 Humira, 첫 번째 페이지에서 파생 된 항 체와 베스트 셀러 mAbs 중은 2002 년에 류 마티스 관절염의 임상 치료에 대 한 승인 이후입니다. 비 동물 mAb 개발 기술을 기반으로, 살 균 소 전시 항 원 immunogenicity, 인간 화, 그리고 전통적인 hybridoma 기술 기반 항 체 개발에서 필요한 동물 유지 보수를 무시 합니다. 이 프로토콜에서 우리는 합성 살 균 소 표시 팹 라이브러리의 109-1010 단일 electroporation에 얻을 수의 다양성을 건설 하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 구성: 1) 고효율 전기 유능한 세포 준비; 2) 추출 uracil 포함 하는 단일 가닥 DNA (뒤-ssDNA); 3) Kunkel 메서드 기반 oligonucleotide 감독 mutagenesis; 4) electroporation 그리고 계산 라이브러리 크기; 5) 단백질 A/L 기반 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 폴딩에 대 한 기능적 다양성 평가; 그리고 6) 다양성의 DNA 순서 분석.

팹 도서관 건축의 흐름 차트를 다음 ( 그림 1참조) 우리는 M13KO7 도우미 페이지 미리 감염 대장균 SS320 전기 유능한 세포 준비. 도서관 건축을 위한 팹 phagemid 백본 사용 되었다 때 이러한 전기 유능한 세포의 효율성 2 X 109 cfu / µ g로 추정 된다 (그림 4).
Uracil 관 효율 비교 하 여 CJ236 대장균 과 대장균 SS320 세포에서 titer의 되었다 검사. CJ236 대장균 및 대장균 SS320 셀 뒤 ssDNA를 은닉 하는 살 균 소 감염 했다. E. 콜라이 SS320는 효소 (dUTPase 및 u...

이 프로토콜에서는 맞춤형 다양성 합성 항 체 살 균 소 전시 도서관의 건설에 대 한 자세한 절차를 설명합니다. 합성 항 체는 질병 진단 및 치료제를 기초 연구에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

이 절차의 전반적인 목표는 독자에게 맞춤형 다양성을 갖춘 파지 표시 합성 인간 항체 라이브러리를 구축하는 데 대한 자세한 실습 경험을 제공하는 것입니다. 합성 파지에 표시된 항체 라이브러리는 동물 면역 및 후속 항체 인간화의 필요성을 우회함으로써 치료용 단클론 항체 개발을 위한 전통적인 하이브리도마 기반 기술을 대체할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. synthetic antibody library의 장점은 높은 친화력 상호 작용과 바람직한 단백질 특성을 지원하는 위치 다양성에 대한 통찰력을 사용하여 맞춤형 다양성이 항체 프레임워크에 도입된다는 것입니다.실용적인 유용성 외에도 합성 항체 라이브러리를 사용하여 생체 분자 상호 작용에서 특정 아미노산의 역할을 실험적으로 조사할 수 있으므로 자체의 지속적인 개선을 지원할 수 있습니다. 이 절차는 우리 연구실의 Zhenwei Zhong이라는 대학원생과 Shin-chen Hou 박사가 시연할 것입니다. 예정

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 표적 단백질에 대한 친화도가 높은 단백질을 발현하는 사전 엔지니어링된 파지를 분리하는 파지 디스플레이 기술을 보여줍니다.

Phage Display를 사용하여 타겟 단백질에 대한 친화도가 높은 단백질 선택

파지 디스플레이는 그 고정 된 분자와 상호 작용하는 단백질이나 단백질 부분을 캡처 할 수있는 강력한 기술이다. 생성하는 파아지 cDNA 라이브러리의 형식과 스크린의 결정이 제작되면, 여기에 설명 된 프로토콜 인터랙의 식별에 이르는 효율 선호도 선택을 허용한다.

재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

방법은 항원 동시에 수백 대해 파지 디스플레이 조합 항체 라이브러리의 합성 확장, 고 스루풋 선택을 수행하기위한 시각적 반주하여 설명한다. 이 병렬 접근 방식을 사용하여, 우리는 표준 면역의 기능적인 다양한 항원에 대한 높은 친화력과 특이성을 나타내는 항체 단편을 격리했다.

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

셀 무료 녹음 방송 번역 플랫폼의 새로운 세대 생화학 시스템에 생체 외에서 유전자 회로 실행을 통해 구성 설계 되었습니다. 이 문서에서는, 우리는 모든 대장균 세포 무료 TXTL 시스템을 사용 하 여 그들의 게놈에서 살 균 소 MS2, ΦΧ174, T7, 등는 합성 하는 방법을 설명 합니다.

에는 대장균-감염 살 균 소의 합성 기반 셀 무료 식 시스템

설명 하는 프로토콜 건설, 특성화 및 DNA 소스에서 만든 "domainome" 라이브러리 (선택의 대상)에 대 한 선택 수 있습니다. 이것은 다른 기술을 결합 하 여 연구 파이프라인에 의해 달성: 파지 디스플레이, 접이식 기자와 다음 세대 시퀀싱 데이터 분석을 위한 웹 도구.

위하여-Seq: Domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜

임의의 주어진 소분자 리간드에 대해 원하는 친화성 및 특이성을 가진 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템을 만드는 것은 많은 생물학적 감지 및 작동 응용을 가질 것이다. 여기서, 우리는 파지 디스플레이 조합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계적 선택을 통해 화학적으로 유도된 이량화 시스템의 de novo 엔지니어링을 위한 효율적이고 일반화 가능한 방법을 설명한다.

결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성

유비퀴티뉴션은 번역 후 중요한 단백질이며, 이의 난독증은 수많은 인간 질환에 연루되어 있다. 이 프로토콜은 파지 디스플레이가 유비퀴티니션의 특이성, 효율성 및 패턴을 제어하는 E3 리개아의 활성을 결합하고 조절할 수 있는 새로운 유비퀴틴 변종을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다.

파지 디스플레이를 사용하여 E3 리개아제용 유비퀴틴 변종 변종 변조기 개발

우선 세균성 병원균의 식별을위한 간단한 방법은 유전자 조작 기자 파지를 사용하는 것입니다. 자신의 특정 호스트 수종와 관련된 이러한 기자의 파지는 빠르게 호스트 세포에 발광 생물 신호 응답을 transducing 수 있습니다. 여기에, 우리는의 검출에 대한 기자의 파지의 사용을...

카테고리의 감지 세균성 병원균에 대한 &#39;발광 생물&#39;리포터 파지

이 프로토콜은 자동 형광 시간 경과 현미경을 사용하여 시간에 다른 박테리아의 단일 세포의 행동을 모니터하기위한 단계별 절차를 제공합니다. 또한, 우리는 어떻게 현미경 이미지를 분석하는 지침을 제공합니다.

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

우리는 환경 바이러스성 사회에서 단일 좌초 DNA를 두 번 좌초 DNA와 RNA 분자를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 핵산은 인산 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 fractionated 있습니다. 이 방법은 환경 시료에서 바이러스 핵산 형식의 절연을 허용합니다.

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

학습하세요 맞춤형 다양성을 가진 합성 인간 항체 라이브러리를 구축하는 방법을. 파이지 디스플레이 기술을 활용하여 동물 면역 없이 고친화성 항체를 선별하고 치료용 단클론 항체 개발에 활용할 수 있습니다.

합성 살 균 소의 건설 맞춤형 다양성 팹 라이브러리 표시

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