Name: 서 주 신장 조직 세그먼트와 소설 비 계 없는 건설 기술 관 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 학습하세요 생쥐 신장의 미세 해부 기법을 통해 피질-수질 세그먼트를 분리하고 무지지 세포 구조물에 이식하는 방법을. 이 기술은 조직 공학 및 말기 신질환 치료 연구에 활용됩니다.

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NIH 박사 제도적 교육 부여, NIH-HL-007260

아래에 설명 된 모든 동물 수술 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 의학 대학의 사우스 캐롤라이나에서 어떤 동물 수술 전에 또는 사용의 어떤 동물의 조직에 의해 승인 되었다.
1. murine 신
<ol><li>수술 용 마스크와 오염 위험을 최소화 하기 위해 bouffant 모자를 돈. 외과 영역의 설정 동안 불 임을 유지 합니다.<ol>
<li>운영 테이블에 비 fenestrated 수술 커튼을 배치 합니다.</li>
		<li>무 균 커튼에 압력가 악기의 팩을 엽니다. 신에 필요한 악기 3 작은 hemostats, 정밀한 집게 이빨, 이빨, 그리고 직선 아이리스가 위 없이 좋은 집게.</li>
		<li>운영 테이블의 센터에 다른 비 fenestrated 외과 용 드 레이프를 배치 합니다.</li>
		<li>5 mL의 Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS) 칼슘과 마그네슘, 1% 페니실린/스 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 보충을 준비 합니다. 얼음 운영 테이블 옆에이 솔루션을 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동물 주택 단지에서 8-12 주 오래 된 C57BL/6 마우스를 (남성 또는 여성)를 가져옵니다.</li>
	<li>마 취 유도 챔버 내부 마우스를 놓고 3.5% 흡입 isoflurane로 유도 합니다. 코 콘 2 %isoflurane 마 취 유지 보수에 대 한 사용 하 여 마우스를 놓습니다.<ol>
<li>주기적으로 페달 반사 (회사 발가락 핀치)에 대 한 평가 하 여 수술 내내 마 취의 적절 한 깊이 대 한 모니터.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제 모 크림을 사용 하 여 복 부 몸통에서 머리의 모든을 제거 합니다. 이 지역을 모든 머리에서 복 부 제거 되었습니다 되도록 증류수로 헹 구 십시오.</li>
	<li>최고 비 fenestrated 드 레이프에서 부정사 자리에 무 균 운영 테이블에 마우스를 전송 합니다. 그냥 마우스 복 부를 overlying 드 레이프에 2 x 2 cm2 창문 내기를 잘라.</li>
	<li>Povidone-요오드 70% 에탄올 복 부 살 균 거 즈 또는 코 튼 볼을 사용 하 여 다음 적용 됩니다.</li>
	<li>가 위 치아와 아이리스 미세 집게를 사용 하 여, 3-4 cm 수직 복 부 피부 절 개를 중간, 중간의 왼쪽에 0.5 cm에 평행 하 게 참고: 오른쪽 신장 제거 하려고,이 중간의 오른쪽에 0.5 c m 절 개 될 것입니다.<ol>
<li>아이리스가 위로 복 부 캐비티를 입력 incise을 치아 없이 좋은 집게와 복을 잡고. Hemostats 피부와 긴장을 옆으로 배치 하 고 노출 강화 복의 뛰어난 및 하 부 측면 가장자리에 적용 됩니다.</li>
		<li>섬세 하 게 노출 왼쪽된 신장에 복 부의 오른쪽 장 내용 이동. 부드럽게 복 부의 상승 신장에 견인 장소.</li>
		<li>왼쪽된 신장 hilum 걸쳐 hemostat 장소. 아이리스가 위를 사용 하 여 transect ureter과 신장 혈관.</li>
		<li>1% 왼쪽된 신장 에서도 얼음에 페니실린/스 DPBS 솔루션.</li>
		<li>포함 하는 메 마른 조직 문화 후드에 신장 튜브를 전송 합니다. 15 mL 원뿔 튜브의 신장 60 mm 페 트리 접시 (그림 1)에 전송. 칼슘과 마그네슘 5 mL DPBS를 사용 하 여 두 번으로 하는 린스 신장 5 ml DPBS 60 mm 접시에 일시 중지 하십시오.<ol>
<li>5 mL DPBS 기정 프로토콜 중 사용할 수와 함께 추가적인 60 mm 페 트리 접시를 준비 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>승인 된 IACUC 동물 프로토콜에 따라 thoracotomy와 신장, 조달 다음 exsanguination 마우스를 안락사.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. murine 신장 서 신장 세그먼트 격리에 대 한
<ol><li>메 마른 기술 프로토콜, 메 마른 장갑, 수술 용 마스크를 포함 하 여의이 부분에 대 한 사용 하 여 계속 bouffant 오염 위험을 최소화 하 고.<ol>
<li>장소 살 균 영역 왼쪽 및 오른쪽 현미경의 악기에 대 한 멸 균 분야에 뿐만 아니라 스테레오 현미경 플랫폼에 커튼. 현미경 초점 손잡이에 플라스틱 접착 시트를 배치 하 고 70% 에탄올 스프레이. 무대를 빛 듀얼 목이 조명 기를 켭니다.</li>
		<li>오픈 소독된 악기 (치아, 메스 핸들, #15 메스 블레이드, 두 직선 hemostats, 두 30½ 없이 미세 집게 게이지 빈 구멍 바늘) 무 균 커튼에. 메스에 장소 #15 블레이드 지금 처리 하 고 각 바늘 어댑터/허브 그림 1에서 보듯이 나중 사용을 위한 바늘 절 개 악기를 만들려고 한 hemostat를 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>60 mm 페 트리 디쉬, 포함 하는 DPBS와는 다른 유일한 DPBS, 현미경 영역 조직 문화 후드에서 신장 하나를 이동 합니다.<ol>
<li>목표 아래 60 mm 페 트리 접시를 놓고 신장 폭로 뚜껑을 제거 합니다. 나중에 사용에 대 한 멸 균 분야에 포함 하는 DPBS 접시를 옆에 둡니다.</li>
		<li>만 신장의 앞쪽 또는 후부 표면 (즉, 접시의 바닥을만 지 다른 얼굴로 신장의 대형 평면 얼굴) 보기에 접시를 이동 합니다. 절차의이 부분에 대 한 3.2-4 배속 줌. 비 지배적인 손을 사용 하 여, 통과 하는 신장 신장 열 등 하 고 우량한 극 근처 요리에 대 한 핀 치아 없이 미세 집게를 사용 합니다.</li>
		<li>신장 핀 장소에 비 지배적인 손을 계속. 지배적인 손을 가진 #15 블레이드를 사용 하 여 노출 된 표면에서 반투명 섬유 capsular 레이어를 제거 하. 신장 캡슐의 나머지를 제거의 노출 된 표면에서 가장 천박한 0.5 m m를 면도.</li>
		<li>#15 블레이드를 사용 하 여 조직의 약 2 m m3 크기에서, decapsulated 지역에서 거꾸로 피라미드 해 부. DPBS만을 포함 하는 60 m m 접시를 검색 하 고 깨끗 한 접시에 조직의 피라미드를 배치. 신장에의 나머지를 삭제 합니다.</li>
		<li>해 부의 나머지 부분에 대 한 1.5-2.0 X 확대를 감소. 때까지 조직 세그먼트 바늘 팁의 직경 보다 작거나 조직 조각 점차적으로 작은 조각으로 슬라이스 절단 악기 두 hemostat 바늘 악기를 사용 하 여. 크기의 신장 조직 2 m m3 는 50 개 이상의 세그먼트를 한 번 완전히 해 부를 생산할 예정 이다.</li>
		<li>조직 문화 후드에 신장 세그먼트와 60 mm 접시를 이동 합니다. 1000 µ L 피 펫 사용 DPBS를 제거 합니다. 5 mL DMEM, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보충을 추가 합니다.</li>
		<li>문화 인큐베이터 또는 세포에 이식에서 37 ° C에서 3 일 동안 즉시 생성합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 신장 세그먼트 세포질 구조 제조
<ol><li>문화 정상적인 인간 피부 섬유 아 세포 (NHDF) 그리고 인간의 지방 microvascular 내 피 세포 (HAMEC)를 105 fibroblasts x 7.2와 1.8 x 10 원하는 구조 당5 내 피 세포 몇 주 동안. 조직 문화 후드에서 agarose 금형 미리 혈관 비 계 없는 내 피 섬유 구조 (사양) 앞에서 설명한 Czajka 에 의해 형성에 막대 모양의 우물으로 (4:1) 내 피 세포를 섬유 아 세포의 적절 한 비율 씨 외 19.</li>
	<li>멸 균된 hemostat, 30½ G 바늘 및 플랫 엔드 메 마른 주걱 얻을.<ol>
<li>발음 및 신장 세그먼트를 제거 하지 않도록 주의 되 고 신장 세그먼트를 포함 하는 60 m m 플레이트에서 미디어의 대부분을 제거 합니다.</li>
		<li>세그먼트의 주입을 시각화 하기 위해 외과 Loupes 장비.</li>
		<li>10-15 세그먼트를 얻을, 주걱의 매우 끝에 따라 균등 하 게 퍼져 60 mm 접시의 바닥을 따라 부드럽게 주걱의 끝을 다쳤어요. 사양 시드 했다 잘의 입술에 최대한 가깝게 주걱의 끝을 놓습니다.</li>
		<li>우물의 가장자리를 주걱 끝에서 각 개별 세그먼트를 이동 하려면 다른 손에 hemostat 30½ G 바늘 악기를 사용 합니다. 부드럽게 잘 사용 하는 약간 이전 시드 세포 현 탁 액에 빠져들 때까지 바늘 팁에 아래로 각 세그먼트를 이동 합니다.</li>
		<li>2에서 신장 세그먼트 사양 문화: FGM-2/EGM-2/DMEM 매체 (2.5 mL 전체 볼륨)의 1:1 비율. 3 일 문화 미디어 모든 24 h를 변경 합니다. 구문에서 72 h 형에서 제거 하 고 수정 또는 플래시-동결 처리를 위해.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

메서드 구문 두 종류의 세포와 생체 재료 활용, 그리고 많은 경우에,에 관해서는 넓게 변화 신장 조직 생활 하는 데 사용 되는 오래 된 또는 하지 잘 성격을 나타낸 문학7. 많은 줄기 세포 접근을 사용 하는 또는 업과 고립에서 신장 아키텍처의 개별 구성 요소, 인위적으로 세포 현 탁 액에서 26 다른 차별화 된 세포 유형으로 전체 기관 재현의 전망 21고려를 압도. 이것은 아마 왜 다른 신장 조직의 세그먼트를 사용 하 여 조직 엔지니어링 응용 프로그램에에서 접근을 이동입니다. 위에서 설명한 대로 이전 작업은 PGA 건설 기계16에 시드를 위한 신장 세그먼트의 격리에서 수행 되었습니다. 그러나, 세그먼트의 격리를 설명 하는 데 사용 하는 방법 좀 자세하게에서 설명 했다 고 세그먼트 하지 어떤 일정 기간 생존 능력에 대 한 평가 대 한 교양 했다. 여기, 세포 생존 능력 분석 결과 사용 하 여 함께 설명 ...

만성 신장 병 (CKD)는 현재 중요 한 공중 위생 도전 전세계1중 하나입니다. 미국에서 CKD의 보급은 가장 심각한 형태, 끝 단계 신장 질병 (ESRD)2에서 고통 이상 600000 미국인과 전체 인구의 14% 이상. ESRD 있는 사람들을 위해 사용할 수 있는 현재 치료 옵션 포함 투 석 및 신장 이식. 약 25000 환자가 신장 이식 매년 받아야, 비록 환자 수가 매년 인명 기관 및 그 수신 이식3를 기다리고 그 사이 큰 차이가 이어지는 추가 됩니다. 장 수 및 삶의 질에 심각한 부정적인 영향, 뿐만 아니라 투 석 놀라운 금융 부담으로 연결 됩니다. 2014, 메디케어 클레임을 지불 ESRD 환자2$30 십억 이상 합계 했다. 제한 된 장기 공급 및 환자 투 석 요구에 아무 명백한 하향 추세, 연구 노력 투를 대체 솔루션 식별 목적으로 하 고 이식도 중요 하다. 투에 대 한 필요에도 비교적 짧은 지연 투 석 관련 비용4,,56을 연기 하는 동안 환자 수 질 조정 된 생활 년 및 생산성을 실질적으로 증가 합니다.
있으 나 ESRD에서 그런 기능 조직 손실에 대 한 솔루션 전체 기관 공학 사용 하 여 비 계 기반 organoid 제조에서까지 널리 다양 한 접근법과 조직 공학 및 재생 의학 연구소에서 현재 공부 되 고 있다 오르간 구조 세포 이식7,,89,10,11decellularized 업과 한계 또는 폐기 신장에서 복잡 한 신장 구조는 부분적 으로만 조사. 사실, 거의 20% 신장 이식에 대 한 조달의 다양 한 이유로12,13에 대 한 삭제 됩니다. 이러한 상 상속 이식에서 신장 기능 조직 활용 고 하나 또는 여러 조직 설계 구조에 통합 될 수 있습니다. 사전 연구 신장 조직 공학 목적14,15엑스트라 세포 매트릭스를 활용 하 여 이러한 폐기 장기 사용의 타당성을 설명 했다. 그러나, 몇 가지는 사용 건강 한 신장에서 기본 nephronal 조직 조직 공학 목적16,,1718.
이전 김 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 한 가지 방법은 다음 polyglycolic 산 (PGA) 건설 기계 구조물 제작16에 시드 했다 건강 한 쥐 신장에서 신장 "세그먼트"의 분리를 포함 한다. 그러나, 작은 정보 정확한 해 부 방법론에 관한 부여 되 고 세그먼트 잘 닦지 및 여과의 조합에서 입수 했다. 우리는 마찬가지로 그대로 nephronal 아키텍처, 개별 신장 세그먼트 하지만 기정 기법에 의존 하는 대신이 프로토콜의 설명. Nephrectomies는 살아있는 성인 생쥐, 신장 어디 신장 캡슐을 제거 하 고 조직을 더 해 부 해 부 현미경을 전송 후에 수행 됩니다. 작은-내경 30½ G 바늘 절삭 악기로 사용 되 고도 가이드 해 부에 은닉, 바늘으로 직경은 신장 세그먼트의 대상 직경. 격리 된,이 경우 murine, 신장 세그먼트 문화에서 생존을 유지 하 고 비 계 없는 내 피-fibroblast 세포 구조19통합. 이러한 구문은 이전 바이오 인공 췌 장20를 포함 하 여 다른 장기를 사용 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Non-fenestrated Sterile Field</td><td>Busse 병원 일회용품</td><td>696</td><td></td></tr><tr><td>Fenestrated Sterile Field</td><td>Busse 병원 일회용품</td><td>697</td><td></td></tr><tr><td>Halsted 모기 집게 5 곡선</td><td>Miltex</td><td>Mil-7-4</td> <td>원고의 "Hemostat"</td></tr><tr><td>초미세 Graefe 집게, 치아가 있는 곡선</td><td>Fine Science Tools</td><td>11155-10</td><td>치아가 있는 미세한 집게</td></tr><tr><td>엑스트라 파인 그레이프 집게, 톱니 모양 (치아 없음)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td>이빨이없는 파인 펜치</td></tr><tr><td>파인 가위 - 텅스텐 카바이드</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14568-09</td><td>아이리스 가위</td></tr><tr><td>Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5 %</td> <td>Purdue Products LP</td><td>67618-151-17</td><td></td></tr><tr><td>멸균 면 거즈 패드(4" x 4")</td> <td>Fisher Healthcare</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 용액</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 용액, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란, USP</td><td>제조사: Piramal, 유통업체: McKesson</td><td>2254845</td><td></td></tr><tr><td>Nair Hair Remover</td><td>Nair</td><td>22600-23307</td><td>제모 크림 텍스트</td></tr><tr><td>200 프루프 에탄올</td><td>Decon Laboratories</td><td>2705</td><td>70% 에탄올 용액으로 희석</td></tr><tr><td>BioLite 60mm 조직 배양 접시</td><td>Themo-Scientific</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>Press'n Seal</td><td>Glad</td><td>12587-70441</td><td>입체 스코프에 적용</td></tr><tr><td>SZX16 실체 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 조명기</td><td>Cole Parmer</td><td>41720-20</td><td></td></tr><tr><td>자체 지원 이중 광 파이프, 23" L 구즈넥</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-41720-60</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들 #3</td><td>Miltex</td><td>Mil-4-7</td><td></td></tr><tr><td>멸균 립백 탄소강 블레이드, 블레이드 크기 15</td><td>Bard-Parker</td><td>371115</td><td></td></tr><tr><td>31 1/2 게이지 바늘</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-826F</td><td>Becton Dickinson 305106</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>태아 선택 100% 소 혈청</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FS-0500-AD</td><td></td></tr><tr><td>정상 인간 피부 섬유아세포</td><td>Lonza</td><td>CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>인간 지방 미세혈관 내피 세포</td><td>Sciencell Research Laboratories</td><td>7200</td><td></td></tr><tr><td>수술용 확대경(2.5x)</td><td>Orascoptic</td><td>(N/A) 맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2(FGM-2 SingleQuots 추가)</td><td>Lonza</td><td>CC-3131, CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2(EGM-2 SingleQuots 추가)</td><td>Lonza</td><td>CC-3156, CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>포유류 세포용 Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>항사이토케라틴-18 항체</td><td>Abcam</td><td>ab668</td><td></td></tr><tr><td>염소 항 마우스 IgG, Alexa Fluor 633</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21052</td><td></td></tr><tr><td>염소 항 토끼 IgG, Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>항 폰 Willebrand 인자 항체</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td></td></tr><tr><td>알부민, 플루오레세인 이소티오시아네이트 Conjugate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9771-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>BD Pharmingen 561908</td><td></td><td></td></tr><tr><td>배경 버스터</td><td>Innovex Biosciences</td><td>NB306</td><td></td></tr></tbody></table>

서 주 신장 조직 세그먼트와 소설 비 계 없는 건설 기술 관

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

신장 이식 이제 끝 단계 신장 질병을 위한 주류 치료 이다. 그러나, 대기자 명단 이식 달성이 환자의 단지 1 / 4에 대략 96000 명, 기관 실패와 그에 대 한 대안에 대 한 절박 한 필요가 있다. 그것은 지불 해야 하는 전체 의료 비용 함께 투 석의 해로운 결과 감소, 활성 조사 기관 이식에 대체 솔루션을 찾아 진행 중 이다. 이식 조직 설계 신장 세포 구조 등 가능한 방식을 한 손실된 신장 기능을 대체 있습니다. 여기, 처음으로 설명입니다 생활 corticomedullary의 격리 murine 신장 서 신장 세그먼트. 이러한 세그먼트 한번 이식 호스트 맥 관 구조와 신속한 연결 수 있는 비 계 없는 내 피-섬유 구조 내의 급속 한 합동 할 수 있다. 성인 마우스 신장 살아있는 기증자, 200-300 µ m 직경에서 신장 세그먼트를 stereoscope 서 뒤에서 조달 했다. 여러 신장 구조 한 신장에서 수확 기본 신장 세그먼트를 사용 하 여 조작 했다. 이 메서드는 기능 신장 조직 그렇지 않으면 삭제 될 것 입니다에서 구제할 수 있는 절차를 보여 줍니다.

설명 하는 프로토콜 신장 조직의 피라미드 2 mm3 섹션 당 약 50 신장 세그먼트를 생성 합니다. 처리 되 고 몇 군데 신장 세그먼트 다른 비율 ( 그림 2참조) 관 및 사 구성 요소에 있는. 그대로 세그먼트는 3 일 동안 다른 세그먼트 한 번 모든 24 h의 생존 능력을 결정 하기 위하여 분석 결과를 받게 했다. 그린 형광 calcein-오전은 세포내 esterase 활동, 살아있는 세포의 지표와 함께 존재 합니다. 레드-형광 브로민 homodimer-1 원형질 막의 무결성의 손실 볼 수 있다. 이러한 세그먼트는 그대로, 3 차원 구조, 중요 한 분석 결과 침투 confocal 현미경 검사 법으로 감지할 수는 ( 그림 3참조).
세그먼...

신장 구조 조직 설계 기관 부족 및 투 석의 해로운 효과 위한 솔루션을 제공합니다. 여기, 우리는 마이크로 프로토콜 설명 cortico 골 수 세그먼트의 격리 murine 신장 해 부. 이 세그먼트는 신장 organoids를 형성 세포 비 계 없는 구문으로 이식.

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

이 현미경 박리 절차의 전반적인 목표는 조직 공학 응용 분야를 위해 손상되지 않은 신장 구조를 가진 살아있는 신장 조직의 개별 부분을 분리하는 것입니다. 이 방법은 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다: 분리된 1차 장기 조직의 전체 세그먼트를 무균으로 적출하여 배양에서 살아 있게 유지할 수 있습니까? 이 기술의 주요 장점은 세포주를 사용하여 26개 이상의 서로 다른 세포 유형을 가진 복잡한 장기를 재생성하는 것과 대조적으로 세그먼트가 손상되지 않은 신장 구조를 포함한다는 것입니다.이 기술의 의미는 말기 신장 질환 치료로 확장되는데, 이러한 구조는 여과를 개선하고 환자가 투석을 받지 않는 데 도움이 될 수 있기 때문입니다. 수술 중에는 오염 위험을 최소화하기 위해 마스크와 모자를 포함한 적절한 수술 장비를 착용하십시오. 마찬가지로, 내내 무균 상태를 유지하기 위해 모든 노력을 기울이십시오.수술대를 드레이프하여 준비를 시작합니다. 다음으로, 멸균 커튼에 오토클레이브 기구 팩을 엽니다. 여기에는 세 개의 작은 지혈제, 이빨이 있는 가는 집게, 이빨이 없는 가는 집게, 곧은 홍채 가위가 포함되어야 합니다.수술대 중앙을 천공이 없는 두 번째 수술용 드레이프로 덮습니다. 수술실을 설정하기 전에 항생제가 보충된 DBPS 50ml를 준비하고 5ml를 15ml 튜브에 분취합니다. 이제 8주에서 12주 된 C57 블랙 식스 마우스를 마취하고 발가락을 단단히 꼬집어 페달 반사를 평가하여 정기적으로 마취 수준을 모니터링합니다.다음으로 제모 크림을 사용하여 복부 몸통 부위의 털을 모두 제거하고 크림과 머리카락을 증류수로 헹굽니다. 그런 다음 마우스를 수술대로 옮기고 천공되지 않은 드레이프 아래에 누운 자세로 놓습니다. 이제 마우스의 복부 위에 드리워진 2cm 정사각형 창호를 잘라냅니다.그런 다음 포비돈 요오드로 노출된 피부를 문지른 다음 70% 에탄올을 3회 문질러 피부를 살균하고 수술 준비를 완료합니다. 치아와 홍채 가위가 있는 가는 집게를 사용하여 수술을 시작합니다. 정중선에서 왼쪽으로 1/2cm 떨어진 정중선과 평행하게 3-4cm 피부를 절개합니다.그런 다음 이가 없는 미세한 집게를 사용하여 복막을 잡고 홍채 가위로 절개하여 복강으로 들어갑니다. 그런 다음 피부와 복막의 상부 및 하부 측면 가장자리에 지혈제를 적용하여 측면으로 장력을 가하고 노출을 향상시킵니다. 이제 장 내용물을 복부 오른쪽으로 섬세하게 이동하여 왼쪽 신장을 노출시킵니다.그런 다음 신장을 부드럽게 견인하여 복부 밖으로 들어 올립니다. 이제 신장의 문턱을 가로질러 지혈제를 놓고 홍채 가위를 사용하여 요관과 신장 혈관을 절제합니다. 그런 다음 얼음 위의 1%pen-strep DBPS 튜브로 신장을 옮깁니다.이 튜브를 멸균 배양 후드로 가져가 처리하십시오. 거기에서 신장을 60mm 페트리 접시에 옮기고 칼슘과 마그네슘이 함유된 신선한 5ml의 DPBS로 두 번 헹굽니다. 두 번째 세척 후 새로운 60mm 접시에 담긴 신선한 DBPS 5ml에 신장을 매달아 놓습니다.그런 다음 나중에 사용할 수 있도록 5ml의 DBPS만 들어 있는 추가 페트리 접시를 준비합니다. 멸균 장갑, 수술용 마스크 및 불룩한 제품을 포함한 멸균 기술을 계속 사용하여 오염 위험을 최소화하십시오. 그런 다음 무대 영역과 실체 현미경 주변 영역을 드레이프합니다.다음으로, 현미경 초점 손잡이에 플라스틱 접착 시트를 놓고 70% 에탄올을 분사합니다. 그런 다음 듀얼 구즈넥 일루미네이터를 켜서 무대를 비춥니다. 이제 멸균 커튼 위에서, 이빨이 없는 미세한 집게, 메스 손잡이, 15번 메스 날, 두 개의 직선 지혈기, 두 개의 30.5 게이지 속이 빈 바늘이 들어 있는 멸균 기구 상자를 엽니다.숫자 15 블레이드를 메스 손잡이에 놓고 각 바늘 어댑터 허브에 하나의 지혈을 부착하여 바늘 해부 기구를 만듭니다. 이제 신장이 DPBS에 있는 접시와 DPBS에 있는 접시 두 개를 현미경 영역으로 옮깁니다. 신장 접시의 뚜껑을 제거하고 3.2-4X 배율로 신장의 전방 또는 후방 표면에 현미경의 초점을 맞춥니다.다음으로, 주로 사용하지 않는 손으로 이빨이 없는 가는 집게를 사용하여 신장의 아래쪽 극과 위쪽 극에 있는 접시에 신장을 뚫고 고정합니다. 그런 다음 주로 사용하는 손으로 숫자 15 블레이드를 사용하여 노출된 표면에서 반투명 섬유낭 층을 제거합니다. 캡슐의 나머지 부분을 제거하기 위해 신장 표면의 노출된 표면에서 가장 표면적인 0.5mm를 면도합니다.계속해서 숫자 15 블레이드를 사용하여 약 2제곱밀리미터의 캡슐화가 해제된 영역에서 조직의 역피라미드를 해부합니다. 그런 다음 조직을 DBPS의 깨끗한 접시에 옮기고 신장의 나머지 부분을 버립니다. 이제 절개된 조직에 초점을 맞추고 배율을 1.5에서 2.0X로 줄입니다.두 개의 지혈 바늘 도구를 절단 도구로 사용하여 조직 조각이 바늘 끝의 크기가 되거나 더 작아질 때까지 조직 조각을 점진적으로 더 작은 조각으로 자릅니다. 약 50개의 세그먼트가 생성되어야 합니다. 이것은 절차의 중요한 부분입니다.각 세그먼트는 확산을 방해할 수 있는 큰 세그먼트를 피하기 위해 30-1/2 게이지 바늘 끝의 직경을 밀접하게 근사화해야 합니다. 조직을 조직 배양 후드로 되돌리고 P1000 마이크로피펫을 사용하여 DPBS를 제거합니다. 그런 다음 10%의 소 태아 혈청과 1%의 펜 연쇄상구균으로 보충된 5mm의 DMEM을 다시 추가합니다.그런 다음 조직을 배양하거나 즉시 세포 구조물에 이식합니다. 설명된 절차에 의해 생성된 온전한 신장 분절의 생존력은 생존력 분석을 사용하여 배양에서 3일에 걸쳐 검사되었습니다. 녹색 형광 칼슘 AM은 살아있는 세포를 나타내는 세포 내 에스테라제 활성과 함께 존재합니다.적색 형광 ethidium homodimer-1은 원형질막의 무결성 손실과 함께 보입니다. 신장 분절이 골격이 없는 내피 섬유아세포 구조체에 삽입되었을 때, 3일째에는 세포 구조체와 통합되어 온전한 구조를 형성했습니다. 구축물은 von Willebrand 인자로 표지하여 표시된 혈관 전 내피 네트워크를 유지했습니다.신장 상피 세포는 cytokertain-18에 의해 표지된 녹색으로 볼 수 있습니다. 체외 신장 기능을 테스트하기 위해 구조체를 FITC 표지된 알부민으로 배양했습니다. 박힌 신장 조직의 분절에서 멀리 떨어진 곳에서 잔류 알부민이 발견되는 반면, 신장 세뇨관 상피 세포에도 핫스팟이 있었습니다.이러한 핫스팟은 루미나미(intraluminin)를 가로지르는 알부민(albumin)이며, 이는 신장 분절(renal segment) 세포 구조에서 알부민 재흡수를 나타내는 것으로 생각됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 조직 공학 응용 분야에서 쥐 신장에서 신분절을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 마스터하면 이 절차를 1-1/2시간 안에 완료할 수 있습니다.이러한 절차에 따라, 신장 구축물 제작 및 특성화에 관한 다른 질문에 답하기 위해 세포화된 구축물을 시딩하는 것을 포함하는 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 수술 기구와 가압 산소 실린더를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 날카로운 물체를 가지고 작업할 때는 주의하고 산소 탱크를 실험실 벤치에 고정하는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은 혈관 구조를 통한 세제의 사전 관류에 의한 Sprague Dawley 쥐 신장의 탈세포화를 설명하며, 인간 신장 상피 세포로 재증식하기 위한 템플릿 역할을 하는 무세포 신세포 외 기질을 생성합니다. 성장을 모니터링하기 위한 재세포화 및 레사주린 관류 분석법의 사용은 특별히 설계된 관류 생물반응기 내에서 수행됩니다.

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

생체 내 조직의 구조적 특징, 구성 요소 및 기계적 특성과 유사한 3차원 구조를 엔지니어링하기 위해 혁신적인 생체 제조 기술이 개발되었습니다. 이 기술은 새로 개발된 희생 재료인 BSA 고무를 특징으로 하며, 이 고무는 세부적인 공간 특징을 전달하여 다양한 조직의 생체 내 구조를 재현합니다.

세 가지 차원 생체 모방 기술 ​​: 소설 Biorubber는 콜라겐 하이드로 겔에 마이크로 및 매크로 스케일 아키텍처를 정의 작성합니다

이 작품은 장기 발달을 연구하기위한 두 가지 방법, 배양 배아 장기 및 오르가노이드의 혈관 을 허용하는 조류 배아에서 융모난성 막 (CAM)에 개선 된 이종이식 설정및 새로운 고정 z 방향을 설명합니다. 고해상도 시간 경과 공초점 이미징을 허용하는 수정 된 실험 조건을 가진 장기 배양 방법.

혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 Organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰

우리는 사구체, 근위 관, 두꺼운 상승 사지, 수집 덕트 및 간질염을 포함하여 인간 신장의 하위 세그먼트의 레이저 미세 절제에 대한 프로토콜을 설명합니다. RNA는 얻어진 구획및 RNA 시퀀싱으로부터 분리되어 각 하위 세그먼트 내의 전사 서명의 변화를 결정한다.

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이 프로토콜은 탈세포 쥐 신장을 사용하여 발판을 개발하는 방법을 소개합니다. 이 프로토콜에는 생체 이용률을 확인하기 위한 탈세포화 및 재세포화 프로세스가 포함됩니다. 탈세포화는 트리톤 X-100 및 나트륨 도데킬 황산염을 사용하여 수행됩니다.

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재건 수술을 위한 조직 공학 임플란트는 복잡하고 값비싼 골격 구성 요소를 포함하는 힘든 체외 배양으로 인해 전임상 시험 이상으로 거의 진행되지 않습니다. 여기에서는 자가 미세이식편을 포함하는 접근 가능한 콜라겐 기반 관형 골격을 사용하여 요로 전환을 위해 설계된 단일 단계 절차를 제시합니다.

Minipigs의 단일 단계 조직 공학 요로상피관에 대한 수술 모델

여기에서는 미세생리학적 시스템에서 콜라겐 및 콜라겐-아가로스 매트릭스를 사용하여 3D 세포 배양을 구현하기 위한 지침을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 신장 근위세뇨관 및 신세포 암 스페로이드 공동 배양을 지원하여 생체 내 조건을 시뮬레이션하고 신장암 세포 상호 작용에 대한 고급 조사를 가능하게 합니다.

신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양

여기에서는 신장 피질에서 인간 신장 세뇨관 상피 세포(HRTEC)의 1차 배양을 얻어 세포외 기질(3D-HRTEC)에서 단층 및 3차원 배양을 개발하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

Development of human renal tubular epithelial cell primary cultures in monolayers and three-dimensional conditions(단층 및 3차원 조건에서의 인간 신장 세뇨관 상피 세포 1차 배양 개발)

우리는 원발성 신근위세뇨관 상피 세포를 분리 및 배양하기 위해 전체 인간 신장을 처리하기 위한 최적화된 프로토콜과 이러한 세포를 3차원, 미세유체, 미세생리학적 플랫폼에서 적용하여 신장 근위세뇨관을 재현하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

1차 인간 근위세뇨관 상피 세포의 분리 및 신장 근위세뇨관의 미세생리학적 모델 생성에 사용

학습하세요 생쥐 신장의 미세 해부 기법을 통해 피질-수질 세그먼트를 분리하고 무지지 세포 구조물에 이식하는 방법을. 이 기술은 조직 공학 및 말기 신질환 치료 연구에 활용됩니다.

서 주 신장 조직 세그먼트와 소설 비 계 없는 건설 기술 관

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