서 주 신장 조직 세그먼트와 소설 비 계 없는 건설 기술 관

이 현미경 박리 절차의 전반적인 목표는 조직 공학 응용 분야를 위해 손상되지 않은 신장 구조를 가진 살아있는 신장 조직의 개별 부분을 분리하는 것입니다. 이 방법은 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다: 분리된 1차 장기 조직의 전체 세그먼트를 무균으로 적출하여 배양에서 살아 있게 유지할 수 있습니까? 이 기술의 주요 장점은 세포주를 사용하여 26개 이상의 서로 다른 세포 유형을 가진 복잡한 장기를 재생성하는 것과 대조적으로 세그먼트가 손상되지 않은 신장 구조를 포함한다는 것입니다.

이 기술의 의미는 말기 신장 질환 치료로 확장되는데, 이러한 구조는 여과를 개선하고 환자가 투석을 받지 않는 데 도움이 될 수 있기 때문입니다. 수술 중에는 오염 위험을 최소화하기 위해 마스크와 모자를 포함한 적절한 수술 장비를 착용하십시오. 마찬가지로, 내내 무균 상태를 유지하기 위해 모든 노력을 기울이십시오.

수술대를 드레이프하여 준비를 시작합니다. 다음으로, 멸균 커튼에 오토클레이브 기구 팩을 엽니다. 여기에는 세 개의 작은 지혈제, 이빨이 있는 가는 집게, 이빨이 없는 가는 집게, 곧은 홍채 가위가 포함되어야 합니다.

수술대 중앙을 천공이 없는 두 번째 수술용 드레이프로 덮습니다. 수술실을 설정하기 전에 항생제가 보충된 DBPS 50ml를 준비하고 5ml를 15ml 튜브에 분취합니다. 이제 8주에서 12주 된 C57 블랙 식스 마우스를 마취하고 발가락을 단단히 꼬집어 페달 반사를 평가하여 정기적으로 마취 수준을 모니터링합니다.

다음으로 제모 크림을 사용하여 복부 몸통 부위의 털을 모두 제거하고 크림과 머리카락을 증류수로 헹굽니다. 그런 다음 마우스를 수술대로 옮기고 천공되지 않은 드레이프 아래에 누운 자세로 놓습니다. 이제 마우스의 복부 위에 드리워진 2cm 정사각형 창호를 잘라냅니다.

그런 다음 포비돈 요오드로 노출된 피부를 문지른 다음 70% 에탄올을 3회 문질러 피부를 살균하고 수술 준비를 완료합니다. 치아와 홍채 가위가 있는 가는 집게를 사용하여 수술을 시작합니다. 정중선에서 왼쪽으로 1/2cm 떨어진 정중선과 평행하게 3-4cm 피부를 절개합니다.

그런 다음 이가 없는 미세한 집게를 사용하여 복막을 잡고 홍채 가위로 절개하여 복강으로 들어갑니다. 그런 다음 피부와 복막의 상부 및 하부 측면 가장자리에 지혈제를 적용하여 측면으로 장력을 가하고 노출을 향상시킵니다. 이제 장 내용물을 복부 오른쪽으로 섬세하게 이동하여 왼쪽 신장을 노출시킵니다.

그런 다음 신장을 부드럽게 견인하여 복부 밖으로 들어 올립니다. 이제 신장의 문턱을 가로질러 지혈제를 놓고 홍채 가위를 사용하여 요관과 신장 혈관을 절제합니다. 그런 다음 얼음 위의 1%pen-strep DBPS 튜브로 신장을 옮깁니다.

이 튜브를 멸균 배양 후드로 가져가 처리하십시오. 거기에서 신장을 60mm 페트리 접시에 옮기고 칼슘과 마그네슘이 함유된 신선한 5ml의 DPBS로 두 번 헹굽니다. 두 번째 세척 후 새로운 60mm 접시에 담긴 신선한 DBPS 5ml에 신장을 매달아 놓습니다.

그런 다음 나중에 사용할 수 있도록 5ml의 DBPS만 들어 있는 추가 페트리 접시를 준비합니다. 멸균 장갑, 수술용 마스크 및 불룩한 제품을 포함한 멸균 기술을 계속 사용하여 오염 위험을 최소화하십시오. 그런 다음 무대 영역과 실체 현미경 주변 영역을 드레이프합니다.

다음으로, 현미경 초점 손잡이에 플라스틱 접착 시트를 놓고 70% 에탄올을 분사합니다. 그런 다음 듀얼 구즈넥 일루미네이터를 켜서 무대를 비춥니다. 이제 멸균 커튼 위에서, 이빨이 없는 미세한 집게, 메스 손잡이, 15번 메스 날, 두 개의 직선 지혈기, 두 개의 30.5 게이지 속이 빈 바늘이 들어 있는 멸균 기구 상자를 엽니다.

숫자 15 블레이드를 메스 손잡이에 놓고 각 바늘 어댑터 허브에 하나의 지혈을 부착하여 바늘 해부 기구를 만듭니다. 이제 신장이 DPBS에 있는 접시와 DPBS에 있는 접시 두 개를 현미경 영역으로 옮깁니다. 신장 접시의 뚜껑을 제거하고 3.2-4X 배율로 신장의 전방 또는 후방 표면에 현미경의 초점을 맞춥니다.

다음으로, 주로 사용하지 않는 손으로 이빨이 없는 가는 집게를 사용하여 신장의 아래쪽 극과 위쪽 극에 있는 접시에 신장을 뚫고 고정합니다. 그런 다음 주로 사용하는 손으로 숫자 15 블레이드를 사용하여 노출된 표면에서 반투명 섬유낭 층을 제거합니다. 캡슐의 나머지 부분을 제거하기 위해 신장 표면의 노출된 표면에서 가장 표면적인 0.5mm를 면도합니다.

계속해서 숫자 15 블레이드를 사용하여 약 2제곱밀리미터의 캡슐화가 해제된 영역에서 조직의 역피라미드를 해부합니다. 그런 다음 조직을 DBPS의 깨끗한 접시에 옮기고 신장의 나머지 부분을 버립니다. 이제 절개된 조직에 초점을 맞추고 배율을 1.5에서 2.0X로 줄입니다.

두 개의 지혈 바늘 도구를 절단 도구로 사용하여 조직 조각이 바늘 끝의 크기가 되거나 더 작아질 때까지 조직 조각을 점진적으로 더 작은 조각으로 자릅니다. 약 50개의 세그먼트가 생성되어야 합니다. 이것은 절차의 중요한 부분입니다.

각 세그먼트는 확산을 방해할 수 있는 큰 세그먼트를 피하기 위해 30-1/2 게이지 바늘 끝의 직경을 밀접하게 근사화해야 합니다. 조직을 조직 배양 후드로 되돌리고 P1000 마이크로피펫을 사용하여 DPBS를 제거합니다. 그런 다음 10%의 소 태아 혈청과 1%의 펜 연쇄상구균으로 보충된 5mm의 DMEM을 다시 추가합니다.

그런 다음 조직을 배양하거나 즉시 세포 구조물에 이식합니다. 설명된 절차에 의해 생성된 온전한 신장 분절의 생존력은 생존력 분석을 사용하여 배양에서 3일에 걸쳐 검사되었습니다. 녹색 형광 칼슘 AM은 살아있는 세포를 나타내는 세포 내 에스테라제 활성과 함께 존재합니다.

적색 형광 ethidium homodimer-1은 원형질막의 무결성 손실과 함께 보입니다. 신장 분절이 골격이 없는 내피 섬유아세포 구조체에 삽입되었을 때, 3일째에는 세포 구조체와 통합되어 온전한 구조를 형성했습니다. 구축물은 von Willebrand 인자로 표지하여 표시된 혈관 전 내피 네트워크를 유지했습니다.

신장 상피 세포는 cytokertain-18에 의해 표지된 녹색으로 볼 수 있습니다. 체외 신장 기능을 테스트하기 위해 구조체를 FITC 표지된 알부민으로 배양했습니다. 박힌 신장 조직의 분절에서 멀리 떨어진 곳에서 잔류 알부민이 발견되는 반면, 신장 세뇨관 상피 세포에도 핫스팟이 있었습니다.

이러한 핫스팟은 루미나미(intraluminin)를 가로지르는 알부민(albumin)이며, 이는 신장 분절(renal segment) 세포 구조에서 알부민 재흡수를 나타내는 것으로 생각됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 조직 공학 응용 분야에서 쥐 신장에서 신분절을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 마스터하면 이 절차를 1-1/2시간 안에 완료할 수 있습니다.

이러한 절차에 따라, 신장 구축물 제작 및 특성화에 관한 다른 질문에 답하기 위해 세포화된 구축물을 시딩하는 것을 포함하는 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 수술 기구와 가압 산소 실린더를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 날카로운 물체를 가지고 작업할 때는 주의하고 산소 탱크를 실험실 벤치에 고정하는 것을 잊지 마십시오.