Name: 재조합 콜라겐 나 세포 확장과 생물에 셀 납품 시스템으로 그들의 잠재적인 사용에 대 한 펩 티 드 Microcarriers 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 배우세요 조직공학에서 다공성 마이크로캐리어를 이용한 세포 확장 및 생물반응기 기반 세포 전달 방법을. 이 기술은 수확 단계 없이 생체적합성 방식으로 손상 부위에 세포를 전달하여 혈관형성 및 재생의학 연구에 활용됩니다.

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이러한 결과 연구 자금에서 유럽 연합 7 번째 프레임 워크 프로그램 FP7/2007-2013 부여 계약 n ° 607051에서 (바이오 영감)을 받고 있다. SEM 분석에 대해 규 산 연구 ISC를 위한 RCP 제조, 프라 운 호퍼 연구소에서 베르너 Stracke 동안 기술 지원에 감사 반 Carolien Spreuwel-후 지 필름 제조 유럽 변환기에서 Goossens 하 고.

hBMSCs 대 퇴 골 머리 대체 수술 관절염 환자의 대 퇴 골 머리에서 분리 했다. 절차는 뷔르츠부르크 대학의 로컬 윤리 위원회 및 환자의 동의의 승인 아래 수행 되었다. 기본 microvascular 내 피 세포 포 피 biopsies 청소년 기증자의 분리 했다. 그들의 법률 representative(s) 전체 동의 서 면을 제공합니다. 연구는 뷔르츠부르크 대학교 (182/10 투표)의 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. hBMSCs 및 HDMECs의 격리
<ol><li>인간 골 수 유래 중간 엽 stromal 세포 (hBMSCs)<ol>
<li>메 마른 숟가락을 사용 하 여 대 퇴 골 머리에서 해 면 뼈를 제거 합니다. 참고: 해 면 뼈는 단단하고 딱딱한 외피 뼈 내부 느슨하게 하 고 세분화 된 물질으로 나타납니다. 그것은 메스를 사용 하 여 외피 뼈에서 해 면 질 뼈의 스크래치 부분에 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>2 50 mL 튜브에 제거 해 면 뼈를 삽입 합니다. 해 면 뼈의 볼륨 엉덩이 교체 수술 동안 제거 된 대 퇴 골 머리의 크기에 따라 10 mL에 5에서 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>DMEM-F12 (DMEM 및 햄의 F12 매체의 1:1 혼합물), 세척 매체의 약 30 mL와 튜브를 작성.</li>
		<li>5 경도 방식에서 튜브를 수동으로, 동요 해 면 뼈에서 지방 세포를 s. 원심 분리기 300g x와 22 ° C 5 분.</li>
		<li>졸업된 플라스틱 피 펫, 지방 세포 층과 약 20 mL의 나머지 상쾌한 발음. 해 면 뼈를 충당 하기 위해 충분 한 매체를 하자.</li>
		<li>DMEM F12의 10 ml와 함께 튜브를 경도 손으로,에 대 한 10-15, 밖으로 셀 수 있도록 적극적으로 악수.</li>
		<li>새로운 50 mL 튜브를 튜브에서 졸업된 플라스틱 피 펫으로 세포 현 탁 액의 10-15 mL을 전송.</li>
		<li>단계의 1.1.6 풀링 함께 얻은 세포 현 탁 액 50 mL 튜브에 수집 해 면 뼈가 흰색 때까지 2-3 회 반복 합니다.</li>
		<li>졸업된 플라스틱 피 펫으로 세포 현 탁 액 50 mL 튜브의 하단에 콜라겐 펠 릿을 발음을 피하 두 가지 새로운 튜브에 전송.</li>
		<li>5 분에 대 한 300 x g 및 22 ° C에 세포 현 탁 액 분리기 졸업된 플라스틱 피 펫으로 발음 하 여는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
		<li>제 3 관에서 10% FCS DMEM F12 1% 펜/Strep 50 µ g/mL 하는데-2-인산 염의 40 mL를 추가 합니다. 셀 펠 릿을 포함 하는 각 관에이 매체의 5 mL을 전송 합니다. 다시 튜브의 하단을 적극적으로 깜 빡 여 셀 알 약을 중단 하 고 유일한 매체 포함 된 튜브에 세포 정지를 전송.</li>
		<li>선택 사항: 셀 계산을 위해 셀 서 스 펜 션의 100 µ L를 희석, DPBS의 15 µ L을 30 µ L 첫 번째 희석의 15 µ L을 추가 하 여 PBS와 trypan 파랑, 다음 1시 10분 첫 1: 100 희석 Trypan 파랑는 DPBS 얻을: Trypan 블루 1: 1의 비율. 표준 Neubauer 챔버와 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>1.1.11에 설명 된 대로 109 셀/175 cm2 T-플라스 크 25 mL 매체의 세포를 시드하십시오. 또는, 계산 하지 않고 최대 10 175 cm2 셀 문화 플라스 크에 전체 세포 현 탁 액을 나눕니다. 이 단계에서 hBMSCs는 그들을 숫 적으로 크게 적혈구에서 구별할 수 없습니다. hBMSCs 스파스 식민지로 나타날 것 이다 (1-2/플라스 크)는 첫 번째 7 일 동안.</li>
		<li>매체는 hBMSCs와 혈액 세포의 상호 작용 수 있도록 시드 로부터 4 일 후 변경 합니다. 첫 번째 중간 교환 후 2-3 일 마다 매체를 변경 합니다. 추가 하 여 졸업된 플라스틱 피 펫으로 문화 매체를 완전히 제거, 세척 두 번 DPBS (부착 세포 DPBS의 10 mL를 추가 및 제거 하 여 완전히 졸업된 플라스틱 피 펫과 DPBS) 20 mL의 중간 교류를 수행 1.1.11에 설명 된 대로 신선한 매체입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인간의 피부 microvascular 내 피 세포 (HDMECs)<ol>
<li>피부 생 검 치료 하 고 분리 이전에 게시 프로토콜21에 따르면 HDMECs. 간단히, 표 피에서 진 피의 분리, 후 37 ° C, 5% CO2시 40 분에 대 한 트립 신에 진 피를 품 어. 시간 후에 부 화, 문화 매체를 포함 하는 배양 접시에 진 피를 전송 하 고 메스를 사용 하 여 각 조각을 스크래치. 얻은 세포 현 탁 액 50 mL 플라스틱 튜브와 g와 22 ° C x 300에 5 분 동안 원심 분리기에 전송 1.2 x 104 셀/c m2의 조밀도에 Neubauer 챔버와 씨앗을 사용 하 여 세포 현 탁 액을 계산 합니다. 완전히 다른 매일 매체를 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 설치 및 스피너 플라스 크, RCP microcarriers, 및 생물의 살 균
<ol><li>스피너 플라스 크와 RCP microcarriers<ol>
<li>하루 전에 실험, 설정 회전자 플라스 크 압력솥에 의해 살 균을 위해 그들을 준비 하 고. 참고: 회전자 플라스 크의 모자 풀어 두고, 가능 하면 수직 위치에 그들을 소독.<ol>
<li>풀기 중 오염을 방지 하기 위해 알루미늄 호 일 쪽 모자 주위 스피너 플라스 크를 별도로 포장. 살 균 후 오염 위험을 최소화 하기 위해 압력가 마로 소독을 위한 알루미늄 호 일의 1-2 층을 가진 플라스 크를 바꿈.</li>
		</ol>
</li>
		<li>20 ml DPBS의 RCP macroporous microcarriers의 필요한 금액을 무게. 참고: 30 mg는 회전자 플라스 크 당 필요 합니다. 오토 클레이 브 (15 분 동안 121 ° C)에 의해 열 살 균 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 수 화 하자.</li>
	</ol>
</li>
	<li>관류 생물<ol>
<li>Vascularized 조직 등가물20생산을 설명 하는 생물 시스템을 사용 합니다. 이 생물은 biomatrix 배치는 선박, 중간 저수지와 압력 병으로 구성 됩니다.<ol>
<li>보통 저수지와 실리콘 튜브 ( 그림 3C참조)을 통해 압력 병 배를 연결 합니다. 느슨한 모자를 두고 고 압력솥 비닐 봉지에 잘, 가까이 하 고 두 번째 압력솥 비닐 봉투에서이 장소. 압력솥에 의해 소독.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hBMSCs와 RCP macroporous microcarriers에 HDMECs의 문화
참고: RCP microcarriers를 시드하는 데 사용 하는 HDMECs RFP와 lentiviral 변환에 의해 표시 되었다. 이 프로토콜은 이전에 게시 프로토콜5후 수정 되었습니다.
<ol><li>RCP macroporous microcarriers는 바닥에 정착 하 고 문화 매체의 10 mL와 함께 그들을 씻어 보자. 3 회 반복 한다.</li>
	<li>문화 매체의 10 mL와 함께 스피너 플라스 크를 씻으십시오.</li>
	<li>문화 매체의 8 ml에서 RCP macroporous microcarriers 스피너 플라스 크 당 30 밀리 그램을 추가 합니다. 셀을 뿌리기 전에 30 분 동안 37 ° C, 5% CO2 에서 RCP microcarriers를 포함 하는 회전자 플라스 크 equilibrate 참고: 이것은 살 균 하기 전에 RCP microcarriers의 대략적인 건조 무게에 기반.</li>
	<li>씨앗 5 x 105 hBMSCs 또는 HDMECs (통로 3) 문화 매체의 2 mL 플라스 크 회전자 당.</li>
	<li>활동가 접시와 5 분 동안 90 rpm 및 나머지 37 ° C, 5% CO2, 1 h 정적/동적 외피의 총 55 분 교 반 시작에 스피너 플라스 크를 놓습니다. 4 회 반복 한다.</li>
	<li>스피너 플라스 크 당 세포 배양 매체의 10 mL을 추가 하 고 연속 95 rpm에서 교 반 시작. 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.</li>
	<li>micropipette의 사용으로 걸릴 샘플 일 1, 4 및 7: 333 µ L에서 DNA에 대 한 콘텐츠 (~ 0.5 mg), 1000 µ L SEM 분석 (~ 1.5 mg) 및 라이브/죽은 얼룩에 대 한 333 µ L (~ 0.5 mg). 참고: 이것은 살 균 하기 전에 RCP microcarriers의 대략적인 건조 무게에 기반.</li>
	<li>문화 매체의 10 mL 매일 변경 합니다. 이 위해, RCP microcarriers는 바닥에 정착 하 고 매우 신중 하 게 10 mL 피 펫의 사용과 스피너 플라스 크에서 10 mL를 발음 다음 신선한 문화 매체의 10 mL를 추가할 때까지 기다립니다.</li>
	<li>7 일 동안 37 ° C, 5% CO2 95 rpm에서 설정 하는 활동가 접시에 있는 문화를 유지.</li>
</ol>4. DNA 콘텐츠, SEM 분석, 살고 죽은 얼룩이 지 고 분석 결과 돋 아
<ol><li>DNA 콘텐츠<ol>
<li>micropipette 사용 2 ml 플라스틱 튜브를 사용 각 회전자 플라스 크 (서 스 펜 션의 333 µ L에 포함) 및 전송에서 microcarriers의 약 0.5 mg을 수집 합니다. 참고: 이것은 살 균 하기 전에 RCP microcarriers의 대략적인 건조 무게에 기반.</li>
		<li>한 번 DPBS의 1 mL로 씻어 후 상쾌한 발음.</li>
		<li>lyophilizer에 남아 있는 DPBS 제거 하 고 무게 나중 정규화에 대 한 동결 건조 된 microcarriers.</li>
		<li>적어도 6 h-80 ° C에서 샘플을 동결.</li>
		<li>300 µ L papain 5 60 ° C 하룻밤에 샘플을 품 어 U/mL.</li>
		<li>(예를 들어, PicoGreen dsDNA 분석 결과) 정량 분석 결과의 manufacturer´s 지침에 따라 적절 한 적정 곡선 키트 및 520에 형광 신호 측정을 수행 nm 발광 검출기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스캐닝 전자 현미경 (SEM) 분석<ol>
<li>Ca. microcarriers의 1 밀리 그램에서 수집 각 회전자 플라스 크 및 전송 2 mL 플라스틱 튜브에.</li>
		<li>Microcarriers DPBS의 1 mL로 한 번 씻는 다.</li>
		<li>DPBS 제거 하 고 1 시간에 70% 에탄올의 1 mL에 품 어.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 1 시간에 80% 에탄올의 1 mL에 품 어.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 1 시간에 대 한 90% 에탄올의 1 mL에 품 어.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 1 시간에 대 한 100% 에탄올의 1 mL에 품 어.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 hexamethyldisilazane 10 분의 1 mL에 품 어.</li>
		<li>뚜껑 열고 샘플 화학 후드 하룻밤을 건조 하 게 합니다.</li>
		<li>적절 한 지원에 샘플을 수정 하 고 설립된 프로토콜에 따르면 SEM 분석을 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DAPI 및 라이브/죽은 얼룩<ol>
<li>microcarriers에 시드 셀 후 2, 4, 및 7 일에서 2 mL 플라스틱 튜브를 사용 각 회전자 플라스 크 및 전송에서 microcarriers의 0.5 mg을 수집 합니다. 한 번 씻어 DPBS의 1 mL.</li>
		<li>DAPI<ol>
<li>그들을 충당 하기 위해 충분 한 4 %paraformaldehyde 10 분에 대 한 샘플을 수정.</li>
			<li>한 번 씻어 DPBS의 1 mL.</li>
			<li>락 통에 45 분 동안 얼룩 솔루션으로 실 온에서 품 어.</li>
			<li>420 nm 방출 필터 형광 현미경에 DAPI 형광 신호를 감지 하 고 이미지.</li>
		</ol>
</li>
		<li>라이브/죽은 얼룩<ol>
<li>라이브/죽은 염료 솔루션의 500 µ L에서 샘플을 품 어. 빛 으로부터 보호 20 분 동안 37 ° C에서 샘플을 유지.</li>
			<li>한 번 씻어 DPBS의 1 mL.</li>
			<li>490 nm 방출 필터와 살아있는 세포 형광 현미경에 545 nm 방출 필터와 죽은 세포의 형광 신호를 감지 합니다. 이미지를 취득 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>HDMECs에 대 한 분석 결과 돋 아<ol>
<li>콜라겐 R 솔루션 0.4%의 혼합 330 µ L, 0.1% 아세트산의 170 µ L 그리고 중간 M199 15 mL 플라스틱 튜브에서의 50 µ L. 얼음에 계속.</li>
			<li>micropipette 사용 microcarriers (250 µ L) ~0.375 밀리 그램 가져가 라. 1.5 mL 플라스틱 튜브에 전송, 하단에 정착 하 고 매체를 완전히 제거 하는 RCP microcarriers에 대 한 대기. 참고: 이것은 살 균 하기 전에 RCP microcarriers의 대략적인 건조 무게에 기반.</li>
			<li>콜라겐 혼합물을 중화 하 고 즉시 RCP microcarriers와 함께 그것을 혼합 하는 데 필요한 0.2 N NaOH의 볼륨을 추가 합니다. 참고: ph에서 변화까지 혼합물에 추가 하 여 0.2 N NaOH의 필요한 금액을 사전에 결정 (노란색 컬러에서 차례 분홍색), 다음 후 젤을 형성 하는 1 분 동안 인큐베이터에 혼합물을 배치.</li>
			<li>플레이트 24-잘 접시의 우물에 콜라겐 젤-RCP microcarriers 혼합물. 37 ° C와 30 분 동안 5% CO2 에서 품 어.</li>
			<li>혈관 내 피 성장 인자 (예, VascuLife VEGF Mv 문화 매체)의 200 µ L를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2 24 h에서 품 어.</li>
			<li>쏘아 단계 대조 현미경 배율 개체 X 10을 사용 하 여 관찰 하 고 이미지.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Biomatrix 시드 및 HDMECs에 대 한 생물 시스템의 시작
<ol><li>생물 문화를 시작 하기 전에 1 일 오픈 BioVaSc (biomatrix) 경도 antimesenteric 측에 자르고 이전 소독된 폴 리카 보 네이트 프레임에 고정 ( 그림 3A, B참조). 참고: 있는 BioVaSc biomatrix 게시21이전 준비 decellularized 돼지 jejunal 세그먼트에서 얻은입니다. 참고: 폴 리카 보 네이트 프레임 열, 소독 수로 소닉 목욕 (40khz) 25 분에 대 한 에탄올 70% 부 화 3 시간 뒤 부 화 20 분 여 소독. 다음, 3 번 DPBS와 프레임 살 균 세척.<ol>
<li>100 mm 페 트리 접시에에서 biomatrix 프레임 시스템을 배치 하 고 혈관 내 피 성장 인자 + 1% 채워 페니실린 스 (펜/Strep).</li>
		<li>하룻밤에 37 ° C, 5% CO2배양으로 biomatrix equilibrate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분리 후 셀 계산, 10 x 107 HDMECs biomatrix의 보존된 맥 관 구조를 통해 문화 매체의 1000 µ L에 2 mL 주사기를 사용 하 여 주사. 참고: 동맥 입구를 통해 µ L ~ 700 및 정 맥 출구를 통해 ~ 300 µ L를 주사.</li>
	<li>셀 첨부 파일을 허용 하도록 37 ° C, 5% CO2 3 h에서 품 어.</li>
	<li>혈관 내 피 성장 인자 + 1%의 350 mL 생물 시스템을 채울 펜/Strep 고 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.</li>
	<li>장소는 생물의 선박 내부 프레임. 동맥 및 정 맥 pedicles 선박에 연결 합니다.</li>
	<li>연동 펌프에 생물 시스템을 연결 하 여 재 관류를 시작 합니다. 10 mmHg와 진폭 ± 1에 압력을 설정 합니다.</li>
	<li>매 시간 마다 100 mmHg의 압력, 진폭 ± 20 도달까지 단계적 압력 증가.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에서 이러한 조건 하에서 7 일 동안 생물 시스템을 유지.</li>
</ol>6. RFP-HDMECs는 biomatrix에의 추가
<ol><li>0.4% 콜라겐 R 솔루션의 330 µ L, 0.1% 아세트산의 170 µ L 15 mL 송 골 매 관에에서 중간 M199의 50 µ L를 믹스. 얼음에 계속.</li>
	<li>스피너 플라스 크에서 RCP microcarriers를 가져가 라. 문화 매체를 완전히 제거 합니다.</li>
	<li>콜라겐 혼합물을 중화 하 고 즉시 RCP microcarriers와 함께 그것을 혼합 하는 데 필요한 0.2 N NaOH의 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>biomatrix 루멘에 콜라겐 젤-RCP microcarriers 혼합물을 추가 합니다. 30 분 동안 겔 화를 허용 한다.</li>
	<li>동시에는 생물의 중간 매체를 완전히 제거 하 여 변경 하 고 다음 350 mL 신선한, 사전 예 열, 혈관 내 피 성장 인자 + 1% 추가 펜/Strep.</li>
	<li>연동 펌프에는 생물 반응 기를 연결 하 고 100 mmHg 및 진폭 ± 20에서 압력을 설정 합니다.</li>
	<li>매체 7 일 마다 변경 합니다.</li>
	<li>21 일에 대 한 문화에는 생물 반응 기를 유지.</li>
</ol>7. 분석 및 생물 문화 지요
<ol><li>샘플의 준비<ol>
<li>biomatrix는 생물에서 분리 하 고 폴 리카 보 네이트 프레임에서 제거 합니다.</li>
		<li>6 섹션으로 얻은 조각 잘라: MTT, 2 파라핀 포함/얼룩 및 SEM 분석을 위한 2 대 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파라핀 포함<ol>
<li>페 트리 접시에 섹션을 배치 하 고 그들을 충당 하기 위해 충분 한 DPBS 세척. DPBS 삭제 합니다.</li>
		<li>하룻밤에 4 %paraformaldehyde 섹션을 수정 합니다.</li>
		<li>파라핀 포함 카세트를 준비 하 고 표준 프로토콜에 따라 수행.</li>
		<li>파라핀 블록에서 섹션을 준비 하 고 H & E 염색는 톰의 사용에 대 한 3 µ m의 샘플을 잘라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H & E 염색<ol>
<li>표준 프로토콜32에 따르면 rehydrated 섹션을 얼룩.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스캐닝 전자 현미경 (SEM) 분석<ol>
<li>페 트리 접시에 섹션을 배치 하 고 그들을 충당 하기 위해 충분 한 DPBS 세척. DPBS 삭제 합니다.</li>
		<li>밤새 4.75%도 함께 수정 섹션.</li>
		<li>농도의 에탄올 50%-100% 증가 함께 탈수 체인을 수행 합니다.</li>
		<li>10 분 사용된 HMDS 삭제에 대 한 hexamethyldisilazane (HMDS)와 섹션을 커버 하 고 신선한 HMDS를 추가 합니다.</li>
		<li>연기 후드 건조 하룻밤 섹션을 허용 하 고 이미징에 대 한 샘플을 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 (MTT)<ol>
<li>MTT 시 약 1 mg/mL의 농도에서 혈관 내 피 성장 인자와 함께 믹스.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO290 분에 대 한 MTT 솔루션 섹션을 품 어.</li>
		<li>거시적 또는 metabolically 활성 셀을 검출 밝은 분야 현미경 혈관 구조 및 셀 시드 microcarriers를 준수 합니다. 이미지를 취득 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

Microcarrier의 하나의 주요 목표는 필요의 위치로 셀을 전달 하기 위하여 그들의 차별화를 유지 하면서 세포의 확장입니다. 표현된 방법 소개 RCP microcarriers 세포 부착, 증식, 및 높은 세포 밀도 microcarriers 식민지를 수 있었다. 이 라이브/죽은 얼룩, 어떤 실행 가능한 세포의 90% 이상 검색만 몇 죽은 세포의 동적 문화 7 일 후 가져온 동안에 의해 관찰 되었다. 마찬가지로, SEM 이미지 셀 문화의 7 일 후에 microcarriers의 전체 표면을 커버 확인.
3D 모델에서 세포 생존을 보장 하기 위해, 그것은 세포에 산소와 양분의 공급을 유지 하 고 폐기물 물질의 제거를 허용 하는 것이 중요. 혈관에는 있는 내 피 세포 들은 혈관23의 안쪽 부분을 일렬로 세우는 세포 때문 핵심적인 역할을 담당할이 교환 과정의 책임 구조. 그들은 격 증, 마이그레이션, 준수, 새싹, 및<sup class="xr...

조직 공학 응용 프로그램에 하나의 일반적인 문제는 수익률 높은 세포 질량의 위치에서 올바른 차별화 표현 형을 필요. 이 문제를 해결 하려면 microcarriers의 응용 프로그램은 피부, 뼈, 연골, 힘 줄1의 대규모 세대에 대 한 정형 외과 조직 공학 분야에서 최신의 증가 함께 1967 년에 시작 했다. 그들은 허용 부착 문화의 처리 방법으로 현 탁 액 문화2 와 비슷한 미 3 차원 (3D) 기판에 셀을 확장 하 여. 그로 인하여 세포 균질 영양소 공급 및 세포-매트릭스 상호 작용 vivo에서3,4 차별화의 차원에서 시간이 지남에 따라 자주 분실 되는 더 나은 유지 보수를 리드5접근 경험. 결국 높은 수익률6,7셀, 높은 가스 이어지는 높은 표면 볼륨 비율-고 영양 환율 정적 시스템8, 규제 하 고 물리적 문화 주제 가능성에 비교 자극9, 그리고 잠재적인 확장 과정7 확장 추가 이점이 있습니다. 직경, 밀도, 다공성, 표면, 그리고 접착 속성10,11 등 여러 가지 기능이 다른 상용 마이크로-와 매크로-사업자 구분. 그러나, 주요 장점 중 하나는 그들의 microtissues로 잠재적인 사이트 결함 또는 배달 수요입니다.
Microcarrier 기술 뼈 조직 공학에서의 응용 프로그램에 대 한 우리에 나와 있는 이전 보고서12 생산의 새로운 microcarrier 유형 구성 재조합 콜라겐의 나 펩 티 드 (RCP, Cellnest으로 상용). 임상 시나리오에 셀 납품을 위한 필요에 따라이 새로운 microcarrier는 GMP 준수 최대 비 계 및 셀 생산의 스케일링 수 있습니다. 이러한 맥락에서 비 계 안정성, 속도 저하, 및 적합 한 가교 전략의 적절 한 선택을 통해 표면 특성의 조정 선택 된 응용 프로그램에 기술을 적응, 관심 유형의 세포 또는 조직13을 대상 수 있습니다. 특히, 치료 응용 프로그램14 주 사용 셀 배달 시스템으로이 microcarrier의 잠재적인 고용 그들은 게 임상 설정에서 특히 흥미로운.
이 문서에서 우리는 따라서 분리와 인간 골 수 유래 중간 엽 stromal 세포 (hBMSCs)와 인간의 피부 microvascular 내 피 세포 (HDMECs) 콜라겐-난-기반 재조합에의 확장에 대 한 자란 절차 설명 펩타이드 기반 microcarriers, 그리고 임상 설정에서 납품을 위한 그들의 준비. 또한, 우리는 주입 시 세포 생존 능력의 유지 보수에 대 한 유용한 추가 프로토콜을 설명합니다.
이식 후 세포 생존 능력은 사실 vascularization15,,1617, 산소와 영양분의 교환을 보장 하 고 폐기물 제거를 용이 하 게에 강하게 의존 합니다. Bioreactors는 vascularization 극복해 조직 공학에서 그로 인하여 산소와 영양분18제공 하는 문화 매체의 관류를 통해 세포 생존 능력을 유지 하는 한 가지 방법은 구성 합니다. 여기, 우리는 biomatrix 하 데 노 보 vascularization와 신생 수 그들의 RCP microcarriers에서 microvascular 내 피 세포의 마이그레이션 기능을 평가 하기 위해 생체 외에서 메서드를 보여 줍니다. 이 biomatrix 이며 돼지 공장 decellularized 세그먼트 되 나 BioVaSc (생물 나가도록 비 계), 콜라겐과 엘라 스 틴에 풍부한 혈관 구조, 먹이 동맥을 포함 하 고는 배수 정 맥19 보존 이식 문제20적용.

<table><tbody><tr><td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH</td><td>20395.01</td><td></td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌디하이드로클로라이드 (DAPI)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 100%</td><td>시그마-알드리치</td><td>533,001</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울 Kern EG 2200-2NM</td><td>Kern & Sohn GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascorbate-2-phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor</td><td>Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 뷔르츠부르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>명시야 현미경 Axiovert 40C</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellnest</td><td>Fujifilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 R 용액 0,4%</td><td>Serva Electrophoresis GmbH</td><td>47254.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate 완충 식염수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>변형, 염화칼슘 및 염화마그네슘 없음</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177.01000</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 96%</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T171.4</td><td>변성</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청 (FCS)</td><td>Bio& </td><td>FCS를 판매합니다. ADD.0500</td><td>열 비활성화되지 않음</td></tr><tr><td>형광 현미경 BZ-9000</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haematoxylin</td><td>Morphisto</td><td>10231.01000</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191</td><td>시약 등급, &ge; 99%</td></tr><tr><td>생물반응기용 인큐베이터</td> 독일 <td>뷔르츠부르크</td><td></td><td></td>조직 공학 및 재생 의학 의장</tr><tr><td>라이브/데드 셀 이중 염색 키트</td><td>Fluka</td><td>04511KT-F</td><td></td></tr><tr><td>자기 교반기 플레이트</td><td>2Mag</td><td>80002</td><td></td></tr><tr><td>매체 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td>10X</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더 Tecan Infinite M200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>바늘 21G 16mm</td><td>VWR</td><td>613-5389</td><td></td></tr><tr><td>파파야 라텍스에서 추출한 파파인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4762</td><td>동결건조 분말, &ge; 10 units/mg 단백질</td></tr><tr><td>파라</td>핀 <td>Carl Roth GmbH</td><td>6642.6</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quanti-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트</td><td>, Thermo Fischer Scientific</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Histofix 4%</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P087</td><td></td></tr><tr><td>주사 전자 현미경 Supra 25</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 용액 1.0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>스피너 플라스크(25mL)</td><td>Wheaton</td><td>356879</td><td></td></tr><tr><td>주사기 1mL</td><td>VWR</td><td>720-2561</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2)</td><td>TPP Techno Plastik Products AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF-Mv</td><td>Lifeline cell technology</td><td>LL-0005</td><td></td></tr></tbody></table>

재조합 콜라겐 나 세포 확장과 생물에 셀 납품 시스템으로 그들의 잠재적인 사용에 대 한 펩 티 드 microcarriers 모델

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

조직 공학 유망 분야, 조직 및 장기 이식 목적에 대 한 수요 증가 대 한 솔루션 개발에 초점을 맞춘입니다. 같은 조직을 생성 하는 과정 복잡, 고 특정 세포 유형, 건설 기계, 및 세포 성장 및 분화를 안내를 물리적 또는 생 화 확 적인 자극의 적절 한 조합을 포함 한다. Microcarriers 셀에 3 차원 (3D) microenvironment, 이후 그들은 더 높은 표면에 볼륨 비율을 제공 하 고 더 밀접 하 게 전통적인 2 차원 방법에 비해 vivo에서 상황을 모방 확장 하는 매력적인 도구를 나타냅니다. 혈관 시스템, 세포에 산소와 양분을 공급 하 고 폐기물 제거, 조직 설계를 생성 하는 때 중요 한 빌딩 블록을 구성 합니다. 사실, 대부분 구조 혈관 지원 부족 인해 이식 되 고 후 실패 합니다. 이 연구에서 우리 스피너 플라스 크 및 생물 반응 기, 동적 조건 하에서 재조합 형 콜라겐 기반 microcarriers에 내 피 세포 확장에 대 한 프로토콜을 제시 하 고이 설정 세포 생존 능력 및 기능을 결정 하는 방법을 설명. 또한, 우리는 필요한 추가 분리 단계 없이 vascularization 목적 셀 배달 하는 방법을 제안합니다. 또한, 우리 decellularized 생물 매트릭스에 관류 생물에 잠재적인 셀 vascularization를 평가 하는 전략을 제공 합니다. 제시 방법의 사용 조직 엔지니어링 임상 연습에서 응용 프로그램의 큰 범위에 대 한 새로운 세포 기반 치료법의 발전으로 이어질 수 믿습니다.

그림 1A에서 같이, 우리는 문화의 라이브/죽은 얼룩에 의해 결정 7 일 후 RCP microcarriers에 가능한 셀의 높은 수를 얻었다. 그 결과 완전히 식민지 화 microcarriers 숨 구멍, 분할 그들 (그림 1B)를 overgrowing 주위 관찰 되었다 SEM 분석에 의해 확인 되었다. 다른 한편으로, 없는 셀은 균등 하 게 시드되지 않습니다 실험 결과 여러 빈 microcarriers. 실패 한 실험 해서는 안 이상 총 셀 금액 (그림 1C)의 10%는 죽은 세포의 비정상적으로 높은 숫자를 특징 이다. 또한, HDMECs의 DNA 콘텐츠 정량화 시간 (그림 1D) dsDNA의 증가 보였다.
<p class="jove_content" ...

우리는 macroporous microcarriers에 셀 확장 프로토콜 및 decellularized 조직 매트릭스를 시드하 관류 생물에서 배달 시스템으로 그들의 사용을 제안 합니다. 우리는 또한 세포 증식 및 microcarriers에 경작 하는 세포의 생존 능력을 결정 하기 위해 다른 기술을 포함 합니다. 또한, 생물 반응 기 배양 후 세포의 기능을 설명합니다.

재조합 콜라겐 나 세포 확장과 생물에 셀 납품 시스템으로 그들의 잠재적인 사용에 대 한 펩 티 드 Microcarriers 모델

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

이 절차의 전반적인 목표는 사용 가능한 높은 표면적에서 세포를 확장하고 이러한 세포를 결함 부위 또는 임상 적용에 대한 수요 부위에 추가로 전달하는 것입니다. 이 방법은 세포 확장, 세포 전달 및 혈관화와 같은 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 세포를 확장하여 수확 단계 없이 생체 적합성 방식으로 결함 부위에 전달할 수 있다는 것입니다.이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 매우 중요한데, 작동하는 마이크로캐리어와 바이오리액터는 관련된 많은 단계로 인해 처음에는 복잡할 수 있기 때문입니다. 절차를 돕는 것은 우리 연구실의 박사 과정 학생인 Jihyoung Choi가 맡을 것입니다. 실험 하루 전에 스피너 플라스크를 설정하고 오토클레이브로 멸균할 수 있도록 준비합니다.포장을 푸는 동안 오염을 방지하기 위해 측면 캡에 알루미늄 호일로 스피너 플라스크를 별도로 감쌉니다. 멸균 후 오염 위험을 최소화하기 위해 고압증기멸멸배를 위해 플라스크를 1-2겹의 알루미늄 호일로 감쌉니다. 스피너 플라스크의 뚜껑을 느슨하게 두고 가능하면 똑바로 세워서 소독하십시오.다음으로, Dulbecco의 인산염 완충 식염수 20ml에 필요한 양의 RCP 거대다공성 마이크로캐리어의 무게를 측정합니다. 오토클레이브로 열 살균하기 전에 최소 1시간 동안 수분을 공급하십시오. 텍스트 프로토콜에 참조된 생물반응기 시스템을 사용하여 혈관화된 조직 등가물을 생성합니다.이 생물 반응기는 생물 매트릭스가 놓인 용기, 매체 저장소 및 압력 병으로 구성됩니다. 용기를 매체 저장소와 연결하고 실리콘 튜브를 통해 압력 병을 연결합니다. 캡을 느슨하게 하고 시스템을 오토클레이브 비닐 봉지에 넣습니다.백을 잘 닫고 오토클레이브로 살균하기 전에 두 번째 오토클레이브 비닐 백에 넣으십시오. 멸균된 RCP 거대다공성 마이크로캐리어를 바닥에 가라앉히고 10ml의 배양 배지로 세척합니다. 이 과정을 세 번 반복합니다.또한 스피너 플라스크를 10ml의 배양 배지로 세척하십시오. 다음으로, 8ml의 배양 배지에 스피너 플라스크당 30mg의 RCP 거대다공성 마이크로캐리어를 추가합니다. 세포를 파종하기 전에 스피너 플라스크 RCP 거대 다공성 마이크로캐리어를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 30분 동안 평형을 이룹니다.그런 다음 50만 개의 인간 골수 유래 중간엽 기질 세포 또는 스피너 플라스크당 인간 피부 미세혈관 내피 세포

recombinant-collagen-i-peptide-microcarriers-for-cell-expansion-their

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

현재 줄기 세포 치료에서 주요 장애물은 호스트 조직으로 이들 세포를 전달하는 가장 효과적인 방법을 결정합니다. 지방 파생 줄기 세포들이 multipotency을 유지할 수 있도록하면서 여기에서, 우리는 효과적이고 접근 간단 키토산 기반의 전달 방법을 설명합니다.

줄기 세포 - 로드된 키토산 Microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축

이 연구에서는 콜라겐, 평활근 세포 및 내피 세포를 직접 배양하여 살아있는 혈관 조직을 신속하게 만드는 기술을 제시합니다. 또한 엔지니어링된 혈관 조직의 기계적 특성화를 위한 새로운 프로토콜이 설명됩니다.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

조직 공학은 종종 조직 재생을위한자가 이식을 만들기 위해 체외 확장에 포함되어 있습니다. 본 연구에서는 조직 확장 재생 및 생체 내에서 재구성하기위한 방법이 체외 세포 및 생체 물질의 처리를 최소화하기 위해 개발되었다.

압축 된 콜라겐에 다진 조직 : 단일 무대 재건 복구를위한 세포 함유 Biotransplant

우리는 고분자 crowders (MMC)를 이용하여 세포 외 기질 단백질이 풍부한 세포 - 유래 매트릭스를 획득하기 위해 프로토콜을 제시한다. 또, 구조의 성숙을 유지하면서 배양 시간을 단축 차원의 Organotypic 피부 공동 배양 세대에서 MMC를 포함하는 프로토콜을 제시한다.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

콜라겐은 ECM의 핵심 구성 요소이며, 이전의 분화와 증식에 이르기까지 여러 세포 과정에 대한 중요한 단서를 제공한다. 3D 콜라겐 히드로 겔 내에 세포를 포함하는 프로토콜 및 PDMS 마이크로 채널을 사용하여 무작위 또는 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 더 진보 된 기술이 여기에 제공된다.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

조직 특이 적 세포 외 기질 (ECM)는 세포 기능의 중요한 매개체이다. 이 문서에서는 순수 ECM 파생 폼 및 체외 세포 배양 모델에서 고급 3D 애플리케이션 또는 프로 재생 bioscaffolds 화학적 가교 결합을위한 필요없이 문화에 안정 마이크로을 합성하는 방법을 설명합니다.

조직 특이 적 세포 배양 및 전달 플랫폼과 같은 세포 외 기질 유래 거품과 마이크로 담체의 제조

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

이 프로토콜은 3D 콜라겐 하이드로겔(두께 &lt;250μm)에서 섬유를 정렬하기 위해 확장 변형(스트레칭)을 생성하기 위해 유체 흐름 방향을 따라 기하학이 변화하는 미세유체 채널의 사용을 보여줍니다. 결과 정렬은 수 밀리미터에 걸쳐 확장되며 연신 변형률의 영향을 받습니다.

Microengineering 3D 콜라겐 하이드로겔(장거리 섬유 정렬 포함)

여기에서는 GMP 등급의 용해성 마이크로캐리어를 기반으로 하는 완전 폐쇄형 시스템을 통해 부착 세포의 대규모 제조를 달성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 인간 중간엽 줄기 세포, HEK293T 세포 및 Vero 세포의 배양은 검증되었으며 세포 및 유전자 치료 산업의 수량 요구와 품질 기준을 모두 충족했습니다.

GMP 등급의 용해성 다공성 마이크로캐리어를 기반으로 한 대규모 셀 생산

이 프로토콜은 면역염색에 의한 세포 접착, 오가노이드 형태 및 유전자 발현을 위한 생체 기능성 자기 조립 펩타이드를 평가하는 것을 목표로 합니다. 우리는 결장직장암 세포주를 사용하여 집중적인 테스트를 위한 오가노이드를 얻는 비용 효율적인 방법을 제공할 것입니다.

초단파 자기조립 펩타이드 매트릭스에서 SW1222 세포주의 대장암 오가노이드 제조 및 특성화

배우세요 조직공학에서 다공성 마이크로캐리어를 이용한 세포 확장 및 생물반응기 기반 세포 전달 방법을. 이 기술은 수확 단계 없이 생체적합성 방식으로 손상 부위에 세포를 전달하여 혈관형성 및 재생의학 연구에 활용됩니다.

재조합 콜라겐 나 세포 확장과 생물에 셀 납품 시스템으로 그들의 잠재적인 사용에 대 한 펩 티 드 Microcarriers 모델

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