체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

이러한 절차의 전반적인 목표는 자연스러운 경구 전달 방법을 보여주는 것입니다. 유전자 특이적 dsRNA의 경우, 생체 내 및 해충 RNA 간섭을 유도합니다. 이 방법은 곤충 내부에 생체 분자를 전달하는 방법, RNAi 기반 분자 생물 살충제의 영향을 규명하는 방법, 환경에서 곤충을 제어하는 방법에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 핵산 매개 유전자 침묵을 통한 이러한 전달이 씹는 곤충뿐만 아니라 식물 수액 공급에도 적용될 수 있다는 것입니다. 여기의 방법은 갈색 장갑 노린재, 할리퀸 벌레 및 아시아 감귤류 psyllid와 같은 hemipteran 해충에 이중 가닥 RNA를 전달하는 것을 보여줍니다. 그들은 다른 곤충에 적용 할 수 있습니다.

프로토콜을 시작하려면 알 덩어리에서 부화한 초기 4th Instar 갈색 장갑노린재 또는 BMSB Nymphs를 선택하고 dsRNA 먹이 주기 24시간 전에 굶겨 죽입니다. 다음으로, 가느다란 유기농 인증 생두를 선택하고 0.2% 차아염소산나트륨 용액으로 5분 동안 씻어냅니다. 그런 다음 두 번 증류된 H2O 세척을 세 번 하고 원두를 자연 건조시킵니다.

건조되면 깨끗한 면도날을 사용하여 꽃받침 끝에서 총 7.5cm 길이로 녹두를 다듬습니다. 세척 및 손질한 생두를 300마이크로리터의 제어 용액이 들어 있는 뚜껑이 없는 2밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 담그십시오. 5마이크로그램 또는 20마이크로그램 및 300마이크로리터의 RNA, DNA가 없는 물을 희석하여 시험관 내에서 합성된 lac Z, JHAMT 또는 VGDSRNA를 희석하여 각각 마이크로리터당 0.017마이크로그램 또는 마이크로리터당 0.067마이크로그램의 최종 농도를 생성합니다.

세척 및 손질한 생두를 300마이크로리터의 dsRNA 용액이 들어 있는 뚜껑이 없는 2밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 담그십시오. 마이크로 원심분리기 튜브의 가장자리를 감싸고 담근 원두를 둘러싸서 dsRNA 용액의 증발을 방지하고 동물이 마이크로 원심분리기 튜브에 들어가는 것을 방지합니다. 튜브를 실온에서 3시간 동안 똑바로 세워 모세관 작용에 의해 dsRNA 용액이 녹두 전체에 로드될 수 있도록 합니다.

튜브를 깨끗한 폴리프로필렌 배양 용기에 넣고 굶주린 4번째 Instar BMSB 애벌레 3마리를 배양 용기에 넣습니다. 배양 용기당 3마리의 곤충을 처리합니다. 각각에는 녹색 식용 색소 또는 dsRNA 용액이 함유된 3개의 녹두가 포함되어 있습니다.

곤충을 섭씨 25도 및 상대 습도 72%, 16L, 8D 미만으로 유지하십시오. 인큐베이터의 광주기. 곤충이 dsRNA에 담그고 흡수된 녹두를 5일 동안 먹게 하고 3일 후에 dsRNA로 처리된 녹두를 신선한 사료로 보충합니다. 식물이나 묘목을 선택하고 사용하기 2-3일 전에 물을 주지 마십시오., 토양이 축축하게 건조되 완전히 건조되지 않도록 하십시오.

손으로 펌핑한 스프레이 병을 사용하여 dsRNA 용액 200ml를 아래쪽 캐노피에 바릅니다. 25일에서 40일 후에 4개의 가지 끝에서 약 10개의 잎을 수집하여 이전에 꼭대기에 있던 나무에서 새로운 성장을 맛보십시오. 총 RNA를 추출하고 RT-PCR 및 qPCR로 적용된 dsRNA 트리거의 존재 여부를 분석합니다.

마찬가지로, 10ml의 dsRNA를 묘목의 아래쪽 영역이나 작은 화분에 심은 나무 잎에 국소적으로 분사합니다. 식물이나 묘목을 선택하고 사용하기 전에 2-3 일 동안 물을 주어 토양을 말리고 축축하지만 완전히 건조하지는 않도록하십시오. 다음으로, 1리터의 dsRNA 용액을 대형 화분의 토양에 첨가합니다.

1시간 후에 물 1리터를 넣으십시오. 부분적으로 건조한 토양에 있는 1미터 높이의 화분에 심은 나무의 토양에 100ml의 dsRNA 용액을 바릅니다. 식물이 dsRNA 용액을 토양 관주로 받아 30 분 동안 담그도록합니다.

그런 다음 뿌리의 흡수를 돕기 위해 일반 물만 처리하십시오. 감귤류 묘목, 신규 또는 약 3.5년 된 식물을 선택하여 줄기 주사 방법이라고도 하는 줄기 탭을 사용하여 dsRNA를 주입합니다. 각 인젝터의 구리 팁을 0.6cm 너비의 천장 필름 스트립으로 4-6회 감아 팁 근처에서 누출을 방지합니다.

다음으로, 나무 줄기 주사기에 DNA가 없는 물인 DNA로 희석된 6ml의 dsRNA 용액을 채웁니다. 10 밀리리터 드릴 비트를 사용하여 감귤류 식물에 구멍을 뚫고 2cm 또는 줄기 지름의 약 절반을 초과하지 않도록주의하십시오. 그런 다음 용액을 나무 줄기에 주입하고 dsRNA 용액이 흡수될 수 있도록 주입기를 줄기에 6-10시간 동안 그대로 둡니다.

곤충이 처리 후 3일, 10일, 30일에 처리된 나무의 절단물을 먹게 합니다. 점토 흡수제 30g을 50ml 원뿔형 튜브에 35ml 표시까지 붓습니다. DNA에 희석된 dsRNA 용액 20ml, RNA가 없는 물을 튜브에 부어 모든 흡수제를 적십니다.

원뿔형 튜브의 뚜껑을 덮고 튜브를 기울여 공기를 제거한 다음 튜브를 똑바로 세우고 점토 입자가 용액을 흡수하는 동안 1-2분 동안 그대로 두십시오. 1갤런 냄비를 채울 수 있을 만큼 충분한 dsRNA에 적신 점토를 토양 혼합물에 추가합니다. dsRNA에 적신 점토를 흙에 완전히 섞기 위해 손으로 흙을 섞고 뒤집습니다.

토양을 사용하여 dsRNA 처리를 위해 선택한 묘목을 다시 화분에 심습니다. 30분에서 1시간 후에 dsRNA가 없는 200ml의 일반 물로 토양에 물을 줍니다. 그 후 물 100ml를 붓습니다.

24 시간 후 식물을 정상적인 급수 일정에 놓으십시오. 새로운 식물 성장의 가장 정점이 있는 잎을 수집하여 dsRNA에 대한 후처리하여 매달 처리된 화분의 잎 4-6개를 점토 흡수제와 dsRNA로 테스트합니다. 갈색 장갑노린재 또는 BMSB mRNA에 특이적인 체외 합성 dsRNA에 침지된 녹두 분절의 QPCR은 표적 JHAMT 및 Vg의 발현이 in vivo에서 현저히 감소함에 따라 RNAi의 성공적인 유도를 나타냈습니다.

이 전달 방법은 또 다른 반딧불 해충인 할리퀸 벌레에도 효과적입니다. 녹색의 배설물로 표시됩니다. 이러한 시각적 시연을 시청한 후에는 생체 내에서 RNAi 곤충을 유도하기 위한 경구 섭취를 통해 이중 가닥 RNA를 곤충에 전달하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

RNAi nucelotide 기술의 발전은 광범위한 살아있는 유기체에서 RNA, 유전자 발현 및 단백질 수준을 조절하는 연구자의 능력을 계속 확장하고 있습니다. 이것은 식물에서 곤충, 그리고 가장 어려운 미생물에 이르기까지 다양합니다. 따라서 이중 가닥 RNA의 생산 비용이 계속 감소하고 전달 방법 및 안정성이 계속 개선되는 동안, RNAi 기술의 미래는 새롭고 복잡한 문제를 해결하는 데 계속 사용될 것입니다.