Name: 체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 배우세요 식물 수관 조직을 통한 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법으로 Hemipteran 해충에서 RNA 간섭을 유도하는 기술입니다. 이 방법은 유전자 특이적 dsRNA를 활용하여 생체 내 유전자 침묵을 유도하고 농업 해충 관리에 활용할 수 있습니다.

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저자는 기꺼이 실험 BMSB와 HB를 제공 하 고 식민지; 유지에 대 한 도널드 웨버와 메 간 헐리 히 요 (USDA, ARS 벨트 스 빌, 메릴랜드)를 인정 그리고 마리아 토니 곤잘레스, 살바도르 P. 로페즈, (USDA, ARS, 포트 피어스, 플로리다)와 재키 L. 메츠 (프로 리 다의 대학, 포트 피어스, 플로리다) 식민지 유지 관리, 샘플 준비 및 분석.

1. BMSB 양육
<ol><li>표준 실험실 연습와 앞에서 설명한63BMSB 곤충 후면.</li>
	<li>유리 공장 (22 ° C) 및 자연 채광에 감귤 꽃 에 ACP (D. citri) 곤충을 올립니다. 성인 ACP를 사용 하 여, 대략 5-7 일에 게시 일수로.</li>
</ol>2. 유전자 영역 및 체 외에서 합성 dsRNA의 선택
<ol><li>이전에 게시 transcriptome 프로필32에서 BMSB에 특정 유전자를 선택 합니다.</li>
	<li>200 ~ 500의 기본적인 쌍 사이 다를 선택 하는 관심 영역을 확인 합니다.</li>
	<li>연쇄 반응 (PCR) genomic DNA에서 선택 된 유전자와 관련 된 파편을 생성 하기 위해 아래 설명 된 조건을 사용 하 여 수행 합니다. 유전자 관련 oligonucleotides 표 1 을 참조 하십시오.<ol>
<li>PCR 반응: 0.25 mL PCR 튜브에 결합 PCR 버퍼, dNTP 혼합물 (2.5 m m 각)의 4 µ L, 2 µ L의 DNA 템플렛 (50 ng / µ L), 2.5 µ L 각 뇌관 1과 2 (10 µ M), DNA 중 합 효소 (5 U / µ L)의 0.25 µ L의 X 10의 5 µ L DNase/RNase 무료 최대 50 µ L를 물.</li>
		<li>PCR 조건: 10 98 ° C의 30 주기 뒤 3 분 동안 95 ° C에 관심이 증폭 PCR 반응 사이클 s, 55 ° C 30 s, 1 분 품 추가 10 분 Purify 사용 하 여 PCR 반응을 위한 72 ° C에 반응 위한 72 ° C를 정화 키트입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>T7 RNA 중 합 효소 발기인 순서 측면 유전자 특정 한 뇌관으로 얻은 PCR 파편을 더 증폭 (5'-GAA 온 ATA CGA CTC 법 ATA GGG AGA-3')으로 언급 이전62.</li>
	<li>RNAi에 대 한 부정적인 컨트롤 (모의) LacZ 유전자를 사용 합니다. 참고: LacZ β-galactosidase (사용 하는 뇌관은 표 1에 나열 됩니다) Escherichiacoli genomic DNA에서 증폭을 인코딩하는 유전자 이다.</li>
	<li>설명된 이전62으로 dsRNA를 녹음 방송 생체 외에서 수행 합니다.</li>
	<li>분해 하 고 150 µ L DNase/RNase 무료 물에서 결과 dsRNA를 resuspend, 측정 농도, 나중에 사용-80 ° C에서 저장.</li>
</ol>3입니다. 배달 dsRNA 사용 녹색 콩의
<ol><li>선택 초기 4회 탈피 BMSB nymphs 동일한에서 부 화 계란 질량 그리고 dsRNA 먹이 전에 24 h에 대 한 그들을 굶 어.</li>
	<li>슬림 인증된 유기 녹색 콩 (Phaseolus vulgaris L.)를 선택 하 고 5 분 0.2% 염소 용액으로 세척. 참고: 슬림 콩 콩 쉽게 2 mL microcentrifuge 튜브에 수용 될 수 있도록 선정 됐다.</li>
	<li>DdH2O 3 번 세척 하 고 건조 공기를 허용.</li>
	<li>녹두를 꽃 받침 끝에서 깨끗 한 면도날을 사용 하 여 7.5 cm의 총 길이 잘라 주세요.</li>
	<li>제어 솔루션의 300 µ L을 포함 하는 뚜껑 없는 2 mL microcentrifuge 튜브에 세척 하 고 트림 녹두를 담가 (1시 10분 희석 녹색 식용 색소의 (성분: 물, 프로필 렌 글리콜, Fd & C 노란색 5, Fd & C 블루 1, 및 Propylparaben로 방부 제))입니다.</li>
	<li>생체 외에서 의 확인 희석 diluting 5 µ g 또는 RNase/DNase 무료 물 0.017 µ g / µ L 또는 0.067 µ µ g/L는의 최종 농도를 각각 300 µ L에서 20 µ g LacZ, JHAMT, 또는 Vg dsRNAs 합성.</li>
	<li>DsRNA 솔루션 (3.6 단계)에서 300 µ L를 포함 뚜껑 없는 2 mL microcentrifuge 튜브에서 세척 하 고 트림 녹두를 담가.</li>
	<li>포장 하 고 몰입된 콩 dsRNA 해결책의 증발을 방지 하 고 microcentrifuge 튜브에 들어가기에서 동물 방지를 포함 하는 microcentrifuge 튜브의 가장자리를 밀봉.</li>
	<li>DsRNA 솔루션 그린 빈을 통해 모 세관 작용에 의해 로드 될 수 있도록 3 시간 실 온에서 직 립 방식으로이 관을 배치 합니다.</li>
	<li>깨끗 한 문화 혈관 (폴 리 프로필 렌)에이 관을 배치 합니다. 장소 3 4회 탈피 BMSB nymphs 문화 선박에 굶주렸다.</li>
	<li>치료 3 동물 문화 선박 마다 각 녹색 식품 색소 또는 dsRNA 해결책을 가진 3 개의 녹색 콩을 포함. 인큐베이터에서 16 L: 8D photoperiod에서 25 ° C 및 72% 상대 습도에서 곤충을 유지 합니다.</li>
	<li>5 일 동안 녹색 콩 (몰입, dsRNA를 흡수)에 공급 하는 곤충을 허용 하지만 3 일 후 dsRNA 치료 녹색 구슬의 신선한 다이어트 보충.</li>
</ol>4. 실시간 정량 분석의 유전자 식 다음 RNAi 중재 입을 BMSB에 (정량)
<ol><li>정량에 의해 대 본 식의 수준에 RNAi의 효과 측정 합니다.</li>
	<li>DsRNA 치료 동물에서 총 RNA를 분리 하 고62cDNA 합성.</li>
	<li>실시간 PCR 시스템 및 표 1에 나열 된 프라이 머를 사용 하 여 정량 Pcr 반응 셋업 한다. 다음 정량 사이클링 조건을 사용 하 여: 15 95 ° C의 40 주기 뒤에 10 분 동안 95 ° C s, 95 ° C 15를 포함 하 여 분리 단계와 함께 1 분 동안 60 ° C s, 1 분, 15에 대 한 95 ° C에 대 한 60 ° C s 그리고 60 ° C 15에 대 한 s.</li>
	<li>정량 기준 결정: cDNA는 정량화에 대 한 참조 표준으로 정상적인 동물에서 분리 된 총 RNA에서 준비의 직렬 희석을 사용 하 여.</li>
	<li>내부 표준으로 BMSB 18s RNA를 사용 하 여 조직32에서 RNA 복구에 차이 대 한 수정.</li>
</ol>5. 잎 스프레이 응용 프로그램 큰 화분에 심은 감귤 나무 묘 목
참고: 'Carrizo' 유리창 (감귤 류 나무 XPoncirus trifoliata, 오렌지), 감귤 류의 품종의 식물 자연 채광 및 온도, 1.2 L 용기에 재배에서 유리 공장에서 유지 되었다. 식물 끊임없이 '플러시' 라는 새로운 잎 싹의 성장을 촉진 하는 정리 된 했다. ACP 피드 및 감귤 류64의 새로운 성장에 산란을 좋아한다.
<ol><li>식물 또는 묘 목을 선택 하 고 습기를 하지만 완전히 건조 건조 토양을 사용 하기 전에 2-3 일 동안 그들을 급수 하지 않는다.</li>
	<li>손 펌프 스프레이 용기를 사용 하 여 낮은 캐노피 (그림 4A) 적용할 dsRNA 솔루션 (0.5 mg/mL)의 200 mL. 참고: 위의 준비 DNase/RNase 무료 물에 dsRNA 솔루션을 언급.</li>
	<li>후 스프레이 응용 프로그램, 적용 된 dsRNA 해결책 잎에 의해 완전히 흡수 될 수 있습니다. 참고: 감귤 나무 적용된 dsRNA를 흡수 하 고 잎 어느 새로운 성장에서 또는 전에 응용 프로그램, 적용 된 지점에서 추출 되었다; dsRNA 정량 Pcr를 사용 하 여 감지 했다 고 3-4 h44,,4546에 최고 캐노피 나뭇잎으로 조직의 움직임을 보여주었다.</li>
	<li>25-40 일 수집 하 여 약 10 4 분기의 끝에서 출발 후 이전 얹어 나무에서 새로운 성장 샘플. 총 RNA를 추출 하 고 반전 녹음 방송 PCR (RT-PCR)에 의해 분석 정량 Pcr 뇌관을 사용 하 여 적용된 dsRNA 트리거의 존재에 대 한 표 1에 나열 된 및 이전에 설명한 방법46. 참고: 샘플 컬렉션, 총 RNA 격리, RT-PCR과 정량 앞에서 설명한46으로 수행 했다.</li>
	<li>마찬가지로, 몸에 붙이기도 경종 또는 작은 화분에 심는 나무 잎의 더 낮은 지역에 10 mL dsRNA 스프레이. 참고: Hemipteran 곤충 (ACP 및 GWSS) 24 h에 일반적으로 먹이 액세스를 부여 했다, 새로운 성장 (잎)을 했다 하지 되었습니다 직접 분무, 나는 성장 주 후, 또는 전체 식물 치료를 게시. 이 곤충 3, 6, 및 10 일에 dsRNA에 대 한 테스트는 긍정적인 수 유 포스트 생산.</li>
</ol>6. 토양/물 약 응용 프로그램에 큰 또는 작은 감귤 류 나무와 모 종 화분
<ol><li>식물 또는 묘 목을 선택 하 고 2-3 일 아니지만 습기를 밖으로 건조 하는 토양을 사용 하기 전에 그들을 급수 하지 않는다 완전히 건조 (이 공기 공간 적용 될 액체 솔루션을 만듭니다).</li>
	<li>큰 화분 (약 2.5 m)의 토양에 dsRNA 솔루션 (0.2 mg/mL) 1 리터를 추가 하 고 1 시간 후 물 (체이서) 1 패를 추가.</li>
	<li>100ml dsRNA 해결책 (1.33 mg/mL) 1 m 높이의 토양의 화분에 심는 나무 부분적으로 건조 토양에 적용 됩니다.</li>
	<li>작은 묘 목, 콘에서 토양 또는 벌 거 벗은 뿌리 (그림 4B, C) 10 mL dsRNA 해결책 (1 mg/mL)의 적용.</li>
	<li>식물을 30 분 동안 담가 수 토양 물 약으로는 dsRNA 솔루션을 받을 수 있습니다. 다음 경우 큰 화분 > 1 갤런 (20 mL 노란색 용기에 식물을 위해) 또는 100 mL 뿌리에 의해 흡수를 돕기 위해 일반 물만 치료 적용. 참고: 잎을 몸에 붙이기도 적용된 dsRNA 탐지 최대 원심 팁 3-6 h 게시물 치료, 나무를 통해 조직의 움직임을 보여주는 내 분기의 결과. 새로운 성장 분기 60-90 일 포스트 트리트먼트에 dsRNA에 대 한 긍정적인 테스트합니다. 잘라 먹이 생물 검정44dsRNA에 곤충 (ACP 및 GWSS)에 제공 됩니다.</li>
</ol>7. 줄기 큰 화분에 심은 감귤 나무와 묘에서 응용 프로그램 탭 (트리 트렁크 주입)
<ol><li>새로운, 또는 대략 3.5 년 오래 된 식물 줄기를 사용 하 여 dsRNA를 주입에 대 한 탭 (트렁크 주사) 방법 감귤 류의 묘 목을 선택 합니다.</li>
	<li>감귤 류 식물 훈련 및 2 cm, 또는 줄기의 약 절반 직경을 초과 하지 않도록 주의 복용 10 m m 드릴 비트를 사용 하 여 구멍을 드릴 합니다.</li>
	<li>팁 근처 누설을 방지 하기 위하여 필름을 씰링의 0.6 cm (¼ 인치) 넓은 스트립으로 4-6 시간 각 인젝터의 구리 끝부분을 바꿈.</li>
	<li>6 mL (1.7 mg/mL)에 dsRNA 솔루션 DNase/RNase 무료 물에 희석 하는 트리 트렁크 인젝터 채워 (표시 색된 솔루션으로 서 여기).</li>
	<li>나무의 줄기에 솔루션을 주입 하 고 6-10 h dsRNA 해결책의 흡수 수 있도록 트렁크에 인젝터를 둡니다. 3, 10, 30 일 게시물 치료에서 치료 나무에서 절단에 피드에 곤충을 허용 합니다. 참고: 트렁크 주입 방법을 사용 하 여 주입 dsRNA 나무에서 30-60 일41,,4244의 기간에 대 한 유지. RNAi에 대 한 유효성 검사는 표 1에 나열 된 프라이 머를 사용 하 여 정량에 의해 수행 되었다.</li>
</ol>8. dsRNA 곤충을 통해 토양으로의 배달을 위해 처리 점토 알갱이
<ol><li>튜브에 35 mL 마크 (흡수 성 찰 흙의 약 30 g) 50 mL 원뿔 관으로 흡수 성 찰 흙 밖으로 붓는 다.</li>
	<li>젖은 모든 흡수 관으로 dsRNA 솔루션 DNase/RNase 무료 물 (µ g/100ml)에 희석의 20 mL를 붓으십시오. 원뿔 튜브 캡, 튜브를 제거 하는 공기, 팁 및 튜브 캡.</li>
	<li>튜브 똑바로 놓고 그것은 솔루션을 흡수 하는 찰 흙 입자에 대 한 1-2 분 동안 서 보자.</li>
	<li>1 갤런 냄비를 채우기 위해 토양 혼합으로 충분 한 dsRNA에 젖은 점토를 추가 합니다.</li>
	<li>혼합 고 손으로 철저 하 게 토양으로 dsRNA에 젖은 흙을 혼합 하는 토양.</li>
	<li>사용 하 여이 토양 repot 묘 dsRNA 치료에 대 한 선택.</li>
	<li>DsRNA 없이 일반 물 200 mL와 함께 토양을 물. 1 시간 30 분, 후 일반 물 100 mL를 따릅니다. 24 시간 후 정상 급수 계획에 식물을 넣어.</li>
	<li>새로운 식물 성장의 가장 꼭대기 잎을 수집 하 여 4-6 잎 점토 absorbents와 dsRNA 치료 화분의 dsRNA에 대 한 각 달 게시물 치료를 테스트 합니다. 참고: 식물 또는 절단이 대우 식물에서 먹인 다 곤충에 언제 든 지 24 시간 치료를 게시 하 고 곤충 (되지 않은 데이터)를 최대 1 년을 위한 RNAi 배달 할 수 있다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

RNAi 입증 유전자 생물학 기능 및 규정, 해충19,,6869,70, 의 관리에 대 한 활용을 중대 한 잠재력을 탐험을 위한 중요 한 도구 71. 디자인 및 특정 곤충 종과 곤충에 해당 dsRNA(s)의 납품의 방법에 입을 위한 적절 한 gene(s)의 선택은 매우 중요 둘 다. 곤충으로 dsRNA를 제공 하기 위한 최적의 방법이 결정 되어야 합니다 경험, 배달에 대 한 상대적인 복용량 선택 함께 이점 및 기타 제한 특정 방법을 제공할 수 있습니다. 궁극적으로 환경 방출에 대 한 적합 한 수 있습니다 분자 중국의 개발, 실현, 효율적이 고 유리한 전달 방법이 필요 합니다. 예를 들어 몸에 붙이기도 적용된 dsRNA 곤충 컨트롤을 감귤 류와...

Hemipteran 곤충 높은 인구 증가 달성 하 여 식물에 질병을 확산 그들의 능력의 agriculturebecause의 경제적으로 가장 중요 한 해충의 일부를 구성. BMSB, H. halys 찾을, 19961에 보고 된 첫 번째 보이 질와 아시아 (중국, 대만, 한국, 그리고 일본)에서 알 렌 타운, 펜실베이니아에 서반구에 실수로 도입 된 침입 해충 이다. 그것의 소개부터 BMSB Mid-atlantic (DE, MD, 펜 실바 니 아, 뉴저지, 버지니아, 그리고 웨스트 버지니아), 뿐만 아니라 캐나다, 유럽, 가장 높은 인구가 43 개 주에서 감지 되었습니다 하 고 농업2에 잠재적인 위협을 나타냅니다. Polyphagous 해충으로 BMSB 사과, 포도, 관 상용 식물, 씨앗, 콩, 작물과 옥수수 등 고부가가치 작물을 포함 하 여 약 300 확인 된 식물 호스트 손상을 선동 수 있습니다. 피해는 어디 동물 피어 호스트 작물 영양분을 혈관 조직2,3에서 액세스 하는 바늘 같은 stylet와 lacerate 및 플러시 라고 먹이의 모드 때문에 주로 발생 합니다. BMSB 학교 등 생활 지역에 거주지를 찾을 수 있습니다 그들은 실내 해충 이기도 하 고가을 겨울2집. 화학 물질 및 aeroallergens BMSB 발표 과일 자르기 근로자에서 불법 알레르기 반응으로 보고 되었다. BMSB 또한 접촉 피부염, 결막염, 그리고 민감한 개인4,5비 염 알레르기 질환에 기여할 수 있습니다. 또 다른 hemipteran 곤충, ACP, D. citri 쿠 (Hemiptera: Liviidae), 감귤 류 과일의 심각한 해충 이며 Huanglongbing (HLB), 더 잘 알려진 원인 체 관 부-제한 된 박테리아 (Candidatus Liberibacter asiaticus)를 전송 감귤 류 녹화 질병6,7로. HLB 중국 남부에서 처음 알려졌다 고 40 다른 아시아, 아프리카, 오세아니아, 한국 및 북미 국가7확산 하고있다. 감귤 류 녹화는 경제 및 재정 손실 때문에 감귤 류의 과일 손실; 위협 세계적인 문제 따라서, ACP의 관리는 방지 하 고 HLB 제어 매우 중요 간주 됩니다.
이러한 해충의 효과적인 제어를 위한 조치는 일반적으로 비교적 짧은 화학 살충제의 응용 프로그램 살 필요 합니다. 화학 살충제 제어 전략 종종 안전 환경 관리 전략 부족 또는 유해물 인구8,9농약 저항으로 인해 민감성을 감소. 따라서, 분자 biopesticides 가진 유해물의 생물학 통제는 잠재적인 대안 이다, 하지만 그것의 사용은 세계적으로 겸손, 남아 및 parasitoids (예를 들어, Trisolcus 나무)의 다양 한 종 자연 생물으로도 효과적일 수 있습니다. 제어 합니다. RNAi 분자 biopesticides10침략 적인 해충을 관리 하기 위한 기술을 신흥 잠재력 이다. RNAi는 결국 리드는 mRNA에 유전자 발현의 규칙 순서 특정 방식에서 dsRNAs 침입 뿐만 아니라 내 생의 효과적인 posttranscriptional 유전자 입을 용이 하 게 잘 설명된 유전자 규제 메커니즘 레벨11,12. 간단히, 외 인 dsRNA는 siRNAs에 bidentate nuclease RNase III superfamily의 구성원에 의해 처리 되는 셀에 내 면, 진화론에 벌레, 파리, 식물, 균 류, 포유류13, 보존 Dicer 호출 14 , 15.이 21-25의 뉴클레오티드 siRNA duplexes 다음 해제 및 RNAs를 가이드로 RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 통합. 이 RISC RNA 복잡 한 Watson 근육 경련 기본적인 쌍 수 하는 보완 대상 mRNA; 이 결국 지도 한다 분열 Argonaute 단백질, 멀티 도메인 단백질 저하 해당 mRNA 및 단백질 번역, 그로 인하여 입을16 posttranscriptional 유전자로 이어지는 감소는 RNase H-같은 도메인을 포함 하 여 , 17 , 18.
해충 관리를 위한 RNAi siRNA 통로 활성화 함으로써 dsRNA에서 vivo에서 , 관심사의 유전자를 침묵의 도입을 필요 합니다. 곤충 및 곤충 세포 dsRNA 배달 조직의 RNAi를 유도 하기 위해 사용 된 다양 한 방법이 포함10,19,20,21, microinjection22, 사업자 리 같은 몸으로 먹이 23, 그리고24다른 기술. RNAi 화재로 unc-22 유전자 발현을 침묵 하 꼬마 선 충 에서 처음 되었고 멜로25, 최저 초파리 melanogaster26에 frizzled 유전자의 표현에 의해 따라. 초기 기능 연구 활용 곤충, Apis mellifera22,27,28 Acyrthosiphon pisum, Blattella germanica29, dsRNA를 제공 microinjection H. halys30및 (Terenius 그 외 여러분 검토 lepidopteran 곤충 31). microinjection 곤충에 대 한 관심의 사이트를 정확 하 고 정확한 복용량을 제공 하는. 비록 같은 정화 조 자국 농업 biopesticides 개발에서의 실용성을 배제 외상32, 그러므로, 때문에 면역 관련된 유전자의 표정을 유도 수 있습니다.
DsRNA에서 vivo에서 제공 하는 또 다른 방법은입니다 몸을 담근 채, 섭취 또는 흡수 dsRNA의 동물 또는 세포의 dsRNA를 포함 하는 extracellular 매체에서 일반적으로 포함. 효율적으로 침묵 C. 선 충 뿐만 아니라 하류로의 Raf1 (DSOR1) 물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 키 니 아 제 (MAPKK)20, 억제 하기 위해 초파리 S2 조직 배양 세포에서 RNAi를 유도 하는 데 사용 되었습니다 젖어 pos-1 진33. 그러나, 몸으로 사용 하 여 배달 dsRNA microinjection20에 비해 RNAi를 유도 하는 것 덜 효율적입니다. RNAi 중재 씹는 곤충에 입을 인공 한 천 다이어트10으로 dsRNA를 일으키는 여 서 부 옥수수 rootworm (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera)에 먼저 보였다. 이전 보고서는 dsRNA 절지동물34특정 자연 다이어트에 주입을 제공 하는 방법을 요약 있다. 이러한 전달 방법 추가 배달;의 인위적인 수단을 대 등 하 게 효과적일 수 결정 등 어디 동등한 최저 면역 관련 유전자의 dsRNA 혈액 식사 또는 microinjected35를 통해 전달 했다 때 관찰 되었다 체체파리 비행 (Glossina morsitans morsitans)의 경우. 마찬가지로, 꿀 꿀벌38,39 뿐만 아니라 밝은 갈색 애플 엄 (Epiphyas postvittana)36, 다이아몬드 나 방 (이용한 배 xylostella) 애벌레37, 방울 통해 dsRNA의 납품 효율적인 RNAi를 유도. 호스트 식물의 혈관 조직을 통해 전달 해야 합니다 때문에, hemipteran 곤충에 dsRNA의 구두 전달 힘든 때문에 hemipteran에 가장 효과적인 RNAi 실험 dsRNA40 의 주입 활용가. 효과적인 RNAi 또한 ACP와 유리 날개 사격의 명 수 leafhopper (GWSS) Homalodisca vitripennis에서 관찰 되었다: dsRNA 감귤 류와 루트 물 약, 잎을 통해 혈관 조직으로 dsRNA를 흡수 했다 포도 덩굴을 통해 전달 했다 스프레이, 트렁크 주사, 또는 절단41,,4243,44,45,46에 의해 흡수. 이것 또한 dsRNA ACP (2016, 미국 20170211082 A1)에 대 한 첫 번째 특허 귀착되는. SiRNA 나노 입자 등 리 캐리어를 사용 하 여 dsRNA의 납품 부여 안정성, 그리고 전달된의 dsRNA 효능 증가23,,4748,49 신흥 빠르게 ,50. 나노 기반 배달 차량의 생체 외에서 그리고 vivo에서 적당 한 배달 벡터51로 치료 응용 프로그램 엄청난 잠재력을 얻으며 수 있습니다에 대 한 구체적으로 요약 했다에 대 한 핵 산에 대 한 새로운 클래스. DsRNA에 대 한 배달 차량으로 나노 입자 용 해도, hydrophobicity, 또는 제한 된 bioaccumulation52를 포함 하 여 단점 있지만 적당 한 폴리머 탈출 배달 이러한 단점을 보상 수 있습니다. 개발 및 자체 제공 뉴클레오티드의 사용 이라는 '센스 oligonucleotides', 단일 좌초 RNA/DNA 쌍 신 회로46는 등장도 하고있다.
절지동물에 vitellogenesis 키가는 체 지방; Vg 합성의 주요 inducers 복제 제어 과정 및 젊은 호르몬 (JH) 또는 ecdysone 규제, Vg는 결국 Vg 수용 체 중재 된 endocytosis53통해 개발 oocyte에 의해 촬영. Vg은 polypeptides의 그룹 합성 extraovarially vitellin54,55, 주요 계란 노 른 자 단백질의 개발을 위한 필수 이며 따라서, 재생산 및 노화56에 중요 하다. Vg은 nematodes57 에 성공적으로 침묵 되었다 뿐 아니라 꿀벌 (Apis mellifera) 어디 RNAi 중재 Vg의 고갈에서에서 성인과 계란22에서 관찰 되었다. RNAi 그것의 고갈 같은 관찰 phenotypic 영향으로 이어질 것으로 생각 되었다 때문에 시험 되었다 중재 posttranscriptional 유전자 Vg의 입을 감소 산과 통치, 잠재적으로 BMSB 제어에 도움. JHAMT 유전자 인코딩하는 S-adenosyl-L-메티오닌 (SAM)-종속 JH 산 O-methyltransferase, JH 생 합성 통로58의 마지막 단계를 catalyzes. 이 통로 farnesyl 파이 인산 (FPP)는 순차적으로 farnesol에서 farnesoic 산 JHAMT에 의해 JH 메 틸 farnesoate의 변환 다음에 변형 됩니다. 이 통로 곤충 변 태 호르몬59,,6061에 의해 규제 발달 과정에 맞게 절지동물에 보존 됩니다. B. 모리, JHAMT 유전자 발현 및 Corpora allata에 JH 생 합성 활동 제안 JHAMT 유전자의 transcriptional 억제 JH 생 합성58의 종료에 대 한 결정적 이다. 따라서, JHAMT 및 Vg 유전자 RNAi를 사용 하 여 대상된 고갈에 대 한 선정 됐다. RNAi는 ACP와 GWSS의 제어를 위한 감귤 나무에서 또한 시험 되었다. 감귤 나무 dsRNA 루트 물 약을 통해 치료 했다, dsRNAs 곤충 특정 아르기닌 키 (AK) 녹취 록42,44에 대 한와 잎 스프레이 뿐만 아니라 탭 (트렁크 주사), 줄기. 감귤 나무, 식물 혈관 조직을 통해 효율적인 납품을 나타내는 고 귀착되 었 다 ACP GWSS41,42, 에서 사망률 증가의 캐노피 온통 dsRNA의 국 소 응용 프로그램 검색 되었습니다. 45.
현재 연구에서 우리는 dsRNA 등 치료에 대 한 자연 식단 배달 방법을 확인 했습니다. 새로 개발된 된이 기술은 이후 JHAMT 및 Vg 입을 사용 되었다 mRNA 유전자 특정 dsRNAs BMSB로 nymphs에 사용 하 여 이전62시연. 여기 설명 이러한 새로운 배달 프로토콜 국 소 스프레이 또는 microinjections를 사용 하는 기존 RNA 배달 시스템을 대체 합니다. 야채와 과일, 줄기 탭, 토양에는 억 수 같이 쏟아지는, 및 찰 흙 absorbents에서 사용할 수 있습니다 전달의 dsRNA,이 중국 해충 및 병원 체 관리의 지속적인된 발전에 매우 중요.

<table><tbody><tr><td>BMSB (H. halys) 곤충&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACP (D. citri) 곤충&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유기농 녹두</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시트러스 식물</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>차아염소산나트륨 용액</td><td>J.T. 베이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>녹색 식용 색소&nbsp;</td><td>McCormick & Co., Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>써모 포마 챔버&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마젠타 용기(배양)</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>프라이머&nbsp;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiMix SYBR</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR ABI 7500</td><td>응용 바이오시스템&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스프레이 병</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American Can Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

체 관 부 식물 수액 공급 hemipteran 곤충에 rna 간섭을 유도 하 이중 가닥 rna 구두 전달 방법

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

체 관 부 및 식물 sap 먹이 곤충 침략 작물과 식량 작물을 손상 하는 과정에서 영양소를 검색 하는 과일의 무결성. Hemipteran 곤충 체 관 부 수액에 먹이로 작물을 손상 하는 식물의 경제적으로 상당한 해충의 숫자에 대 한 계정. 갈색 marmorated 악취 버그 (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae)와 아시아 감귤 류 psyllid (ACP), Diaphorina citri 쿠 (Hemiptera: Liviidae)는 북미 지역에서 도입 hemipteran 해충 어디 그들은 그들은 실내 집계 때 고부가가치 전문, 행, 및 주식 작물 및 감귤 류 과일의 침략 농업 유해물으로 귀찮은 해충 있습니다. 많은 종에서 살충제 저항 해충 관리 전략의 대체 방법의 개발을 주도하 고 있다. 이중 가닥 RNA (dsRNA)-중재 RNA 간섭 (RNAi)는 해충의 관리를 위한 공구로 잠재적인 응용 프로그램을 기능 게놈 연구에 대 한 메커니즘을 입을 유전자. 것 합성된 dsRNA 또는 작은 간섭 RNA (siRNA)은 동종 제시 하는 내 생 RNA의 저하를 통해 매우 효율적인 유전자 침묵 하는 것을 실행할 수 있습니다. 효과적이 고 환경으로 사용 RNAi 분자 biopesticides biocontrol hemipteran 곤충의 대 한 먹이 통해 dsRNAs 비보에 전달을 해야합니다. 여기 곤충 dsRNA의 납품을 위한 방법 제시: 침수로 녹색 콩으로 dsRNA의 로드 하 고 섭취를 통해 구두 전달 유전자 특정 dsRNA의 흡수. 우리는 또한 비-유전자 변형 식물 배달 방법을 사용 하 여 잎 스프레이, 루트 물 약, 트렁크 주사 뿐만 아니라 찰 흙과 립, 모두의 dsRNA의 지속적인된 출시에 필수적인 수 있습니다 설명 했습니다. 구두로 섭취 dsRNA에 의해 효율적인 배달 타겟된 유전자, 청소년 호르몬 산 O-methyltransferase 등 (JHAMT)와 vitellogenin (Vg)의 표현에 상당한 감소를 유도 하는 효과적인 복용량으로 확인 됐다. 이러한 혁신적인 방법 해충 관리에 대 한 환경 문제를 극복 하 고 작물 보호에 사용 하는 dsRNA의 납품에 대 한 전략을 나타냅니다.

BMSB 4회 탈피 님프에 먹이 통해 야채 중재 dsRNA 배달 분자 biopesticides RNAi를 사용 하 여 침입 곤충 해충에 대 한 개발에 대 한 테스트를 했다. BMSBs 피드로 알려진 메커니즘에 의해 그들의 바늘 같은 stylets를 사용 하 여 입힌 고 플 러쉬, 어떤 작물에 상당한 손상을 초래. 슬림 유기 녹색 콩, P. vulgaris L., 영양소 또는 dsRNA 전달 될 수 있는 비보에 BMSB에 먹이3테스트에 사용 되었다. 녹두의 세그먼트는 DNase/RNase 무료 물 또는 물과 녹색 식용 색소 BMSB (그림 1A)에서 배달 테스트 솔루션에 몰두 했다. 녹색 식용 색소는 dsRNA를 모방 하는 시각적 표시로 사용 되었다. 녹색 콩의 혈관 조직 모 세관 작용62</s...

이 문서에는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 먹이 체 관 부 수액에 대 한 식물의 혈관 조직을 통해 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 구두 납품을 위해 개발 된 새로운 기술을 보여 줍니다.

체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

이러한 절차의 전반적인 목표는 자연스러운 경구 전달 방법을 보여주는 것입니다. 유전자 특이적 dsRNA의 경우, 생체 내 및 해충 RNA 간섭을 유도합니다. 이 방법은 곤충 내부에 생체 분자를 전달하는 방법, RNAi 기반 분자 생물 살충제의 영향을 규명하는 방법, 환경에서 곤충을 제어하는 방법에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 핵산 매개 유전자 침묵을 통한 이러한 전달이 씹는 곤충뿐만 아니라 식물 수액 공급에도 적용될 수 있다는 것입니다. 여기의 방법은 갈색 장갑 노린재, 할리퀸 벌레 및 아시아 감귤류 psyllid와 같은 hemipteran 해충에 이중 가닥 RNA를 전달하는 것을 보여줍니다. 그들은 다른 곤충에 적용 할 수 있습니다.프로토콜을 시작하려면 알 덩어리에서 부화한 초기 4th Instar 갈색 장갑노린재 또는 BMSB Nymphs를 선택하고 dsRNA 먹이 주기 24시간 전에 굶겨 죽입니다. 다음으로, 가느다란 유기농 인증 생두를 선택하고 0.2% 차아염소산나트륨 용액으로 5분 동안 씻어냅니다. 그런 다음 두 번 증류된 H2O 세척을 세 번 하고 원두를 자연 건조시킵니다.건조되면 깨끗한 면도날을 사용하여 꽃받침 끝에서 총 7.5cm 길이로 녹두를 다듬습니다. 세척 및 손질한 생두를 300마이크로리터의 제어 용액이 들어 있는 뚜껑이 없는 2밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 담그십시오. 5마이크로그램 또는 20마이크로그램 및 300마이크로리터의 RNA, DNA가 없는 물을 희석하여 시험관 내에서 합성된 lac Z, JHAMT 또는 VGDSRNA를 희석하여 각각 마이크로리터당 0.017마이크로그램 또는 마이크로리터당 0.067마이크로그램의 최종 농도를 생성합니다.세척 및 손질한 생두를 300마이크로리터의 dsRNA 용액이 들어 있는 뚜껑이 없는 2밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 담그십시오. 마이크로 원심분리기 튜브의 가장자리를 감싸고 담근 원두를 둘러싸서 dsRNA 용액의 증발을 방지하고 동물이 마이크로 원심분리기 튜브에 들어가는 것을 방지합니다. 튜브를 실온에서 3시간 동안 똑바로 세워 모세관 작용에 의해 dsRNA 용액이 녹두 전체에 로드될 수 있도록 합니다.튜브를 깨끗한 폴리프로필렌 배양 용기에 넣고 굶주린 4번째 Instar BMSB 애벌레 3마리를 배양 용기에 넣습니다. 배양 용기당 3마리의 곤충을 처리합니다. 각각에는 녹색 식용 색소 또는 dsRNA 용액이 함유된 3개의 녹두가 포함되어 있습니다.곤충을 섭씨 25도 및 상대 습도 72%, 16L, 8D 미만으로 유지하십시오. 인큐베이터의 광주기. 곤충이 dsRNA에 담그고 흡수된 녹두를 5일 동안 먹게 하고 3일 후에 dsRNA로 처리된 녹두를 신선한 사료로 보충합니다. 식물이나 묘목을 선택하고 사용하기 2-3일 전에 물을 주지 마십시오., 토양이 축축하게 건조되 완전히 건조되지 않도록 하십시오.손으로 펌핑한 스프레이 병을 사용하여 dsRNA 용액 200ml를 아래쪽 캐노피에 바릅니다. 25일에서 40일 후에 4개의 가지 끝에서 약 10개의 잎을 수집하여 이전에 꼭대기에 있던 나무에서 새로운 성장을 맛보십시오. 총 RNA를 추출하고 RT-PCR 및 qPCR로 적용된 dsRNA 트리거의 존재 여부를 분석합니다.마찬가지로, 10ml의 dsRNA를 묘목의 아래쪽 영역이나 작은 화분에 심은 나무 잎에 국소적으로 분사합니다. 식물이나 묘목을 선택하고 사용하기 전에 2-3 일 동안 물을 주어 토양을 말리고 축축하지만 완전히 건조하지는 않도록하십시오. 다음으로, 1리터의 dsRNA 용액을 대형 화분의 토양에 첨가합니다.1시간 후에 물 1리터를 넣으십시오. 부분적으로 건조한 토양에 있는 1미터 높이의 화분에 심은 나무의 토양에 100ml의 dsRNA 용액을 바릅니다. 식물이 dsRNA 용액을 토양 관주로 받아 30 분 동안 담그도록합니다.그런 다음 뿌리의 흡수를 돕기 위해 일반 물만 처리하십시오. 감귤류 묘목, 신규 또는 약 3.5년 된 식물을 선택하여 줄기 주사 방법이라고도 하는 줄기 탭을 사용하여 dsRNA를 주입합니다. 각 인젝터의 구리 팁을 0.6cm 너비의 천장 필름 스트립으로 4-6회 감아 팁 근처에서 누출을 방지합니다.다음으로, 나무 줄기 주사기에 DNA가 없는 물인 DNA로 희석된 6ml의 dsRNA 용액을 채웁니다. 10 밀리리터 드릴 비트를 사용하여 감귤류 식물에 구멍을 뚫고 2cm 또는 줄기 지름의 약 절반을 초과하지 않도록주의하십시오. 그런 다음 용액을 나무 줄기에 주입하고 dsRNA 용액이 흡수될 수 있도록 주입기를 줄기에 6-10시간 동안 그대로 둡니다.곤충이 처리 후 3일, 10일, 30일에 처리된 나무의 절단물을 먹게 합니다. 점토 흡수제 30g을 50ml 원뿔형 튜브에 35ml 표시까지 붓습니다. DNA에 희석된 dsRNA 용액 20ml, RNA가 없는 물을 튜브에 부어 모든 흡수제를 적십니다.원뿔형 튜브의 뚜껑을 덮고 튜브를 기울여 공기를 제거한 다음 튜브를 똑바로 세우고 점토 입자가 용액을 흡수하는 동안 1-2분 동안 그대로 두십시오. 1갤런 냄비를 채울 수 있을 만큼 충분한 dsRNA에 적신 점토를 토양 혼합물에 추가합니다. dsRNA에 적신 점토를 흙에 완전히 섞기 위해 손으로 흙을 섞고 뒤집습니다.토양을 사용하여 dsRNA 처리를 위해 선택한 묘목을 다시 화분에 심습니다. 30분에서 1시간 후에 dsRNA가 없는 200ml의 일반 물로 토양에 물을 줍니다. 그 후 물 100ml를 붓습니다.24 시간 후 식물을 정상적인 급수 일정에 놓으십시오. 새로운 식물 성장의 가장 정점이 있는 잎을 수집하여 dsRNA에 대한 후처리하여 매달 처리된 화분의 잎 4-6개를 점토 흡수제와 dsRNA로 테스트합니다. 갈색 장갑노린재 또는 BMSB mRNA에 특이적인 체외 합성 dsRNA에 침지된 녹두 분절의 QPCR은 표적 JHAMT 및 Vg의 발현이 in vivo에서 현저히 감소함에 따라 RNAi의 성공적인 유도를 나타냈습니다.이 전달 방법은 또 다른 반딧불 해충인 할리퀸 벌레에도 효과적입니다. 녹색의 배설물로 표시됩니다. 이러한 시각적 시연을 시청한 후에는 생체 내에서 RNAi 곤충을 유도하기 위한 경구 섭취를 통해 이중 가닥 RNA를 곤충에 전달하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.RNAi nucelotide 기술의 발전은 광범위한 살아있는 유기체에서 RNA, 유전자 발현 및 단백질 수준을 조절하는 연구자의 능력을 계속 확장하고 있습니다. 이것은 식물에서 곤충, 그리고 가장 어려운 미생물에 이르기까지 다양합니다. 따라서 이중 가닥 RNA의 생산 비용이 계속 감소하고 전달 방법 및 안정성이 계속 개선되는 동안, RNAi 기술의 미래는 새롭고 복잡한 문제를 해결하는 데 계속 사용될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

이 프로토콜에서는, 우리는 동시에 꿀벌 두 개의 유전자 (더블 유전자 최저를) 억제 두 가지 전략에 대해 설명합니다. 그럼 우리는 꿀벌 미각 지각을 두 번 유전자 최저의 효과를 연구하는 코 확장 응답 (PER) 분석을 사용하는 방법을 제시한다.

꿀벌의 RNAi를 매개로 두 유전자 넉다운과 미각 지각 측정 (<em&gt; 아피스 mellifera</em&gt;)

여기서 우리는 유충 섭취 RNA 나노 입자 / 키토산의 사용을 통해 질병 벡터 모기 유전자 기능을 억제 간섭하는 절차를 설명한다.

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

RNA interference (RNAi)는 유전자 기능을 밝히는 데 매우 유용한 도구입니다. 그러나 성체 이전 단계에서 RNAi를 사용하여 유전자를 표적으로 하는 능력은 주요 인간 말라리아 매개체인 Anopheles gambiae에서 제한됩니다. 번데기 발달 중 직접 주입을 통해 유전자 기능을 감소시키는 RNAi 프로토콜에 대해 설명합니다.

에 RNAi의 트리거 배달<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt; 번데기

여기, 우리는 실험실에서 중간 - 세균 딱정벌레, Dermestes maculatus (D. maculatus)를 양육하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한이 종에서 유전자 기능을 연구하기 위해 배아 표현형을 분석 배아 및 부모의 RNAi를위한 프로토콜과 방법을 공유 할 수 있습니다.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초, Dermestes maculatus

이 원고는의 리에 이중 가닥 RNA의 구강 섭취를 통해 독일 바퀴벌레는 midgut에 유전자 발현의 고갈 보여 줍니다.

RNA 방해의 실용적인 사용: Liposome 캐리어 바퀴벌레에 대 한 이중 가닥 RNA의 구두 납품

RNA 간섭은 특정 발달 단계에서 유전자 발현을 조작하기 위한 널리 적용가능하고 강력한 기술입니다. 여기서, 우리는 수중 다이빙 딱정벌레 Thermonectus marmoratus에서이 기술을 구현하기 위한 필요한 단계를 기술합니다, 구조 또는 행동에 영향을 미치는 유전자의 녹다운에 유전자 의 취득에서.

특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭

본 프로토콜은 인공 매체를 사용하여 피어싱 빨아 먹는 곤충으로부터 충분한 타액을 수집하는 방법을 설명합니다. 이것은 곤충 타액을 수집하고 곤충 먹이 기법과 벡터 매개 바이러스 전송에 타액 기능을 연구하기위한 편리한 방법입니다.

라오델파엑스 스트리아텔루스 타액 컬렉션을 위한 2층 멤브레인 샌드위치 방법

세균에 의해 생산된 dsRNA의 경구 투여는, 예쁜꼬 마선충에서 일상적으로 사용되는 RNA 간섭(RNAi)에 대한 전달 방법으로서, 성인 모기에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 주사를 사용하지 않고도 강력한 역 유전학 연구 및 전송 차단 벡터 연구를 가능하게합니다.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

여기에서는 유전자 기능 연구를 용이하게하기 위해 Bursaphelenchus xylophilus 에서 RNA 간섭에 대한 상세한 담그는 방법을 소개합니다.

파인우드 선충류에서의 RNA 간섭의 적용, Bursaphelenchus xylophilus

RNA 간섭(RNAi)의 조작은 Trichogramma 말벌과 같이 크기가 작은 많은 기생충 종에서 만만치 않은 도전을 제시합니다. 이 연구는 Trichogramma denrolimi에서 효율적인 RNAi 방법을 설명했습니다. 본 방법론은 Trichogramma 말벌의 유전자 조절을 조사하기 위한 강력한 모델을 제공합니다.

계란 기생충의 RNA 간섭, Trichogramma dendrolimi Matsumura

여기에는 누에 Bombyx mori 유충에서 키토산/dsRNA 나노입자 전달을 통해 유전자 침묵을 유도하기 위한 프로토콜이 제시되어 있습니다.

키토산/dsRNA 나노입자 전달을 통한 누에 Bombyx mori 의 유충 RNA 간섭

배우세요 식물 수관 조직을 통한 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법으로 Hemipteran 해충에서 RNA 간섭을 유도하는 기술입니다. 이 방법은 유전자 특이적 dsRNA를 활용하여 생체 내 유전자 침묵을 유도하고 농업 해충 관리에 활용할 수 있습니다.

체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

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