Name: 급속 한 비보에 평가 보조의 세포 독성 T 림프 톨 생성 기능의 백신 개발에 대 한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 학습하세요 CFSE 염색 OT-I CD8+ T 세포 증식을 모니터링하여 세포독성 T 림프구를 생성하는 백신 보조제의 효능을 4일 만에 평가하는 방법을. 이 기술은 면역학 및 백신 개발 연구에 필수적입니다.

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우리는 우리의 기술 도우미에 게 빚을: 미국 형제와 H. Shkarlet, 실험 절차 동안 우리를 도운. 이 작품은 EU 보조금 (UniVax, 계약 번호 601738, 및 TRANSVAC2, 계약 번호 730964), 및 헬름홀츠 협회 부여 (하이-IDR)에 의해 부분적으로 투자 되었다. 자금 출처 조사에 영향을 주지 않았다 디자인, 원고 또는 게시를 위해 제출 하는 결정의 세대.

이 연구에 사용 된 모든 마우스 C57BL/6 배경에서 했다. 모든 동물 병원 체 자유로운 조건에서 유지 했다. 모든 실험은 (TierSchG BGBl 독일 동물 보호 법률의 규범에 따르면 수행 했다. 내가 S 1105; 25.05.1998) 허가 번호 33.4-42502-04-13/1281 및 162280에서 색 소니의 낮은 위원회 동물 실험의 윤리 및 국가 사무실 (낮은 색 소니 국가 사무실의 소비자 보호 및 식품 안전)에 의해 승인 했다.
1. CFSE OT의 얼룩-나 T 세포와 입양 전송
참고: OT-난 마우스 transgenically 생성된 동물 고정된 α와 β 사슬 함께 OVA의 면역 지배 펩 티 드를 인식 하는 T 세포 수용 체 (TCR)를 표현 하는 SIINFEKL10,11. 결과적으로, 이러한 마우스 수가 상당히 높은 SIINFEKL 전용 CD8+ T 세포 (97%)12 13정상 또는 OVA-예방 접종을 마우스 (≤ 1%) 비해.
<ol><li>추적 CD8의 절연 OT에서+ T 세포-나 쥐 T 림프 구 특정은 Thy1는는 (Thy1.1) 대립 유전자 표현:<ol>
<li>6-9 주 된 OT를 안락사-나 CO2 흡입에 의해 쥐 뒤에 자 궁 경부 전위14. 피부 외과 플라이어 집게의 도움으로 몸에서 피부를 분리 수술가 위로 절단 하 여 비장 및 주요 림프절 (사 타 구니, 겨드랑이, 자 궁 경부 쌍만) 해 부 고에 넣어 접시 (60 x 15 m m) 각각 포함 하는 100 µ m 기 공 메쉬 컵 조직 연 삭 및 셀 릴리스에 대 한.</li>
		<li>얼음에 있는 완전 한 RPMI 매체 (RPMI 1640, 10 %v / v, FCS 100 U/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스)의 3-5 ml 접시 (각각 하나의 메쉬 컵)를 유지 합니다.</li>
		<li>주사기 나 비슷한 무 균 악기의 도움으로 장기 매 시 (사전 절단 불필요) 15 mL 원심 분리기 튜브에 결과 단일 세포 현 탁 액을 수집.</li>
		<li>300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한. 원심 분리에 의해 차가운 PBS의 10 mL에 세포를 세척 하 고 다시 염화 암모늄 버퍼 (ACK 버퍼, 상용)의 1 mL/비장에 펠 릿을 일시 중단 하 여 비장에서 적혈구를 lyse. 얼음에 1.5 분에 대 한 셀을 품 어 하 고 이후 원심 분리 (으로 이전)에 의해 차가운 PBS의 10 mL로 세포를 씻어.</li>
		<li>다시 1 ml의 PBS (pH 7.2) 포함 5% 태아 둔감 한 혈 청 자석 절연에 대 한 같은 튜브에 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마그네틱 격리를 수행 하려면 CD8의 부정적인 선택을 진행+ T 제조업체 지침에 따라 자기 절연 키트를 사용 하 여 셀 또는 프로토콜15게시.</li>
	<li>CFSE 얼룩을 수행 하려면 먼저 CD8 수 계산+ T 세포 OT에서 얻은-난 자동된 셀 카운터 (입자 카운터)를 사용 하 여 마우스. 1-5 107 셀/mL 15 ml 송 골 매 관에 빛에서 보호 하는 37 ° C에서 7 분 5 µ M PBS에 CFSE와 1-5 mL의 볼륨에 배 얼룩.</li>
	<li>CFSE는 세포를 소 태아 혈 청의 같은 볼륨 (1:1)를 추가 하 여 얼룩을 냉각 하 고 빛 으로부터 보호 하는 37 ° C에서 추가적인 7 분에 대 한 그들을 품 어. PBS의 10 mL와 함께 셀을 두 번 세척.</li>
	<li>자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 3-5 100 µ L에 106 셀/마우스 배를 정 맥 주사 3-5 107 셀/mL PBS의 배을 셀 수 설정 (i.v.) 꼬리 정 맥을 통해.</li>
	<li>꼬리 정 맥 주사를 수행 하려면 적절 한 restrainers에 마우스를 고정. 다시 영역 및 쥐 꼬리 정 맥 혈관 확장을 허용 하도록 1-3 분 거리 20 ~ 25 cm 사이 붉은 빛 램프를 사용 하 여 주입에 쥐의 꼬리를 따뜻한. 참고:이 쉽게 정 맥 검색 및 세포 현 탁 액의 관리에 도움이 됩니다.</li>
	<li>(손으로 쥐와 램프 사이 배치) 확인 그것 너무 쥐에 대 한 뜨거운 고 꼬리 정 맥 명확 하 게 표시 될 때, 주입은. 셀 25 게이지 바늘161 mL 주사기를 사용 하 여 측면 또는 지 느 러 미 꼬리 정 맥에 주사.</li>
</ol>2. 예방접종 (보조 + OVA도 무료)
<ol><li>OT와 이식 생쥐를 배치-마 취 챔버 (1.7, 그림 1단계) 세포와 산소에서 isoflurane 마 취 기계14에 의해 관리.</li>
	<li>마우스 마 취에서 완전히 잠들 때, 약 실에서 그것을 꺼내와 gluteus superficialis (측면 허리)를 통해 깨끗 한 주사를 수행 하기 위해 전기 머리 트리밍 기계를 사용 하 여 영역에 마우스의 모피를 면도 와 응용 분야의 좋은 보기.</li>
	<li>백신, 25 게이지 바늘을 사용 하 여 면도 영역에 사우스 캐롤라이나의 50 µ L을 주입.</li>
</ol>3. 림프 톨 및 흐름 Cytometry 분석에 대 한 얼룩의 격리
<ol><li>림프 톨 및 splenocytes의 격리<ol>
<li>뒤에 자 궁 경부 전위 공동2 흡입에 의해 예방 접종된 마우스를 안락사.</li>
		<li>배출 및 먼 림프절과 비장 추출 하 고 조직 연 삭 및 셀 출시 100 µ m 기 공 메쉬 컵 포함 된 별도 접시에 그들을 배치. 1.1.3 통해 1.1.2 단계.</li>
		<li>원심 분리 후에 상쾌한 가만히 따르다와 다시 셀 펠 릿 잔해 PBS의 동일한 볼륨에 (약 100 µ L) 일시 중단.</li>
	</ol>
</li>
	<li>교류 cytometry 분석에 대 한 얼룩<ol>
<li>15 mL 원심 분리기 튜브에 표 1에 표시 된 농도에서 착 항 체를 포함 하는 마스터 믹스를 준비, 얼룩 믹스 집중 따라서 2 x 열매를 산출. 샘플 당 100 µ L를 마스터 믹스의 충분 한 볼륨을 준비 합니다. 셀 및 마스터 혼합 1:1 혼합 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 품 어. 참고: 샘플 당 최종 착 볼륨 200 µ L (항 체 마스터 믹스의 셀 릿 + 100 µ L의 100 µ L) 이어야 한다.</li>
		<li>1.1.3, PBS의 10 mL를 두 번 추가에 설명 된 대로 셀 원심 분리에 의해 두 번 세척.</li>
		<li>다시 0.5-1에 얼룩진된 셀 중단 수집 및 전송 중단 교류 cytometer 튜브에 대 한 PBS의 mL. 항상 얼음 샘플을 유지 하 고 빛 으로부터 보호.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cytometry
<ol><li>항상 사전에 70-100 µ m 필터를 사용 하 여 셀 샘플 필터.</li>
	<li>표 1 (구슬 또는 셀)에 대 한 자세한 fluorophores에 대 한 하나의 얼룩 보상 컨트롤을 준비 합니다. 참고: 보상 한다 cytometer 또는 분석 소프트웨어17,,1819 에서 수행 되며 모든 샘플에 적용.</li>
	<li>그림2 제어 전략을 따릅니다. 앞으로 피해 지역 (그림 2A), 그리고 다시 사이드 분산형 및 측면 분산형 영역 (특수, 그림 2B) 남자를 제외 하려면 넓은 대 앞으로 살포 높이에 짧게, 게이트 인구.</li>
	<li>문 사실 CFSE 차별을 위해 BV 650 (자동-형광) FITC (CFSE) 대를 그려서 그림 2B 에서 인구 스테인드 높은 자동 형광 세포에서 세포. 구슬 또는 보상 컨트롤로 BV 650에 활용 된 항 체로 얼룩진 셀을 포함 합니다. 이 그림 (그림 2C) FITC 대 BV 650의 OT 게이트 하는 데 사용 됩니다-난 CFSE 셀 스테인드.</li>
	<li>받는 사람 마우스 대 기증자에서 파생 된 세포를 구별 하기 위해 APC (CD8) 대 Pe-Cy7 (Thy1.1-CD90.1-)에 대 한 그림 2 C 에서 인구를 게이트. 참고: 셀 OT에서 파생 된-난 기증자 마우스는 Thy1.1+ (CD90.1), 반면 WT (C57BL/6, 받는 사람) 마우스 파생 셀 Thy1.2+ (CD90.2) (그림 2D). 일부 연구소는 OT-난 Thy1.2 배경과 WT (C57BL/6)는 Thy1.1에 있는 쥐. 오티에 대 한 Thy1.2에 대 한 항 체를 사용 해야 하는 경우에-게이팅 셀.</li>
	<li>다시 CD8 게이트+ BV 450 (CD4)를 구성 하는 게이트에 APC (CD8) 대 그것을 그려서 Thy1.1+ 인구에서 세포 (그림 2E).</li>
	<li>인구는 CD8의 막대 그래프 디스플레이 사용 하 여 그림 2E 에 문이 표시+ (FITC, 530/15 채널-블루 레이저-), CFSE를 보여주는 셀 게이트 증식된 인구 10에서 농도 포함 하 여 수준2 곳 전적인된 제어 (농도 10 ~5, CFSE 얼룩이 지 고 교류 cytometer에서 전압 설정의 효능에 따라)는 (그림 2F).</li>
	<li>죽은 세포 확산 평가를 병행 평가 추가 게이트 (그림 2에에서는 표시 되지 않음) 플로팅 FITC 대 L/D 마커 (450/20 채널, UV 레이저)를 확인 합니다.</li>
	<li>취득 보상 컨트롤에 대 한 적어도 5000 이벤트 및 교류 cytometer에서 샘플에서 10.000 이벤트 (게이트 E, 그림 2). 낮은 또는 중간 흐름에는 cytometer 실행 (20.000 이벤트/s의 유량을 초과 하지 않는).</li>
</ol>

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<li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+NOG+mice+as+a+model+for+tuberculosis+vaccine-induced+immunity%3A+a+comparative+analysis+with+the+mouse+and+guinea+pig+models+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis.</a> Immunology. 152, 150-162 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

현대 백신은 이상적으로 composedof 정화 항 리, 바이러스 같은 입자, 나노 입자 또는 라이브 벡터 처럼 전달 시스템의 가능한 추가 adjuvants. 백신을 디자인할 때 중요 한 부분은 임상 필요에 따라 올바른 보조 제를 선택 하는. 범위에 속하는 체액 세포 면역 응답 (또는 둘 다) 대, 조직의 면역 반응 (또는 둘 다), 대 로컬의 선거 및 백신 대상 모집단에 생성 해야 하는 메모리의 종류를 선호 포함할 수 있었다. 보조 평가의 1 개의 중요 한 양상은 빠르게 CTL을 생성 하는 용량을 결정 하는. 우리 여기에 급속 하 게 OT를 측정 하 여는 CTL 응답에서 vivo에서 마우스 모델에서의 기능을 결정을 이미 알려진된 기술에 기반 하는 방법 제시-난 CD8 T 세포 확산. 이 방법은 수 adjuvants 여 elicited 면역 반응의 힘의 예측에 대 한 (OT의 확산-내가 T 셀)만 4 작업 일에. 이 방법은 더 이상 adjuvants 면역 반응 (전신 대 로컬) 측면에서 행동 및 그것의 효과적인 ...

세포 독성 T 세포 (CTL) 유도 하는 백신은 주요 치료 개입 싸움 암1의 특정 유형을 위해 개발 되었습니다. CTL은 또한 세포내 병원 체2에 대 한 예방 백신에 대 한 중요 합니다. 또한, CTL 누구 또한 초기 생활 감염5에 대처 하기 위해 CTL에 따라 신생아3,4 등 위험 인구에 기능적으로 활성 몇 면역 방어 메커니즘 중 하나입니다. 이와 관련, 백신 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 CTL 응답 (졸업생)을 유도 하지 않는 한 보조 제와 함께 개발 된 유아6에 감염 시 심각한 합병증에 지도 하는 백신의 완전 한 실패 귀착되는. 예방 접종의 이러한 부정적인 효과 CD8에 의해 반전 될 수 있다+ T 세포 응답7. 우리는 이전 인터페론 유전자 (스 팅) 주 작동 근의 어떤 자극에 의해 elicited (유형 I interferons) 주요 cytokines의 확산을 측정 하 여 일부 이러한 adjuvants8에 의해 생성 된 CTL 응답 필수적입니다 증명 하고있다 오티-예방 접종 및 기능을 유도 하는 CTL의 관찰에서 이러한 결과 사용 하 여 확장 예방 접종 일정9후 나 T 세포. OT의 확산의 측정-난 CD8+ T 세포는 야생 타입 (WT) C57BL/6 받는 사람 마우스 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 염료 희석은 생성 하는 백신의 보조 능력의 강력한 추정 크로스-SIINFEKL, (ovalbumin, OVA의 면역 지배 펩타이드)의 프라이 밍 이 기술은 OT의 확산의 평가 위해 널리 이용 된다-내가 CD8+ 및 OT II CD4+ T 세포. 예를 들어 그것은 WT 동물에서 항 원 리콜 후 백신 효능을 측정 하거나 선택한 cytokines (코 쥐)의 부재에 사용 되었습니다. CFSE 스테인드 OT의 수동 전송 후 짧은 프로토콜 (실험 4 일)는 고안-난 CD8+ T 세포, 50의 1 개의 복용량의 구성 된 피하 (사우스 캐롤라이나) 면역 테스트 adjuvants 보충도 없는 OVA의 µ g 관리 (그림 1)입니다. 예방 접종 후 48 h 결과의 후속 CTL 응답을 생성 하는 보조의 용량의 신뢰할 수 있는 증거를 제공 한다. 이 전략에 의해 비장 (또는 먼 림프절) CTL 활동을 측정 하 여 응답의 범위 뿐만 아니라 예방 접종 후 배출 림프 노드의 로컬 면역 반응의 힘을 평가 가능 하다.

<table><tbody><tr><td>BD LSR Fortessa 세포 분석기</td><td>BD</td><td>특별 주문</td><td>유세포 분석기</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>분자 프로브</td><td>C34554</td><td>Proliferation Dye</td></tr><tr><td>MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit</td><td>Biolegend</td><td>480007</td><td>Magnetic Isolation Beads and Antibodies for negative selection of untouched CD8 T cell.</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, UV excitation Molecular</td><td>Probes</td><td>L23105</td><td>Dead Cell Marker</td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal 항체 (HIS51), PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-0900-82</td><td>항체</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD8a 항체</td><td>BioLegend</td><td>100712</td><td>항체</td></tr><tr><td>BV421 Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD</td><td>740007</td><td>항체</td></tr><tr><td>Z2 coulter 입자 수와 크기 해석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>9914591DA</td><td>세포 카운터. Z2 자동 입자/세포 계수기</td></tr><tr><td>EndoGrade Ovalbumin (10 mg)</td><td>Hyglos(독일)</td><td>321000</td><td>Ovalbumin 내독소 무료 테스트 완료.</td></tr><tr><td>세포 스트레이너 100&micro; m 나일론</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>셀 스트레이너(100 &마이크로; M 모공 메쉬 컵).</td></tr><tr><td>샘플 바이알</td><td>Beckman Coulter</td><td>899366014</td><td>Z2 자동 카운터</td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스(CD90.2)</td>용 샘플 바이알<td>Harlan(Rossdorf, 독일)</td><td></td><td>Company는 이제 Envigo</td></tr><tr><td>OT-I(C57BL/6 배경, CD90.1)</td><td>Harlan(Rossdorf, 독일)</td><td></td><td>우리 동물 시설에서 근친 교배입니다. Envigo FACS 튜브를 요청한 회사는 현재</td></tr><tr><td></td><td>Fischer (Corning)</td><td>14-959-5</td><td>Corning Falcon Round-Bottom 폴리스티렌 튜브</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 튜브</td><td>Fischer (Corning)</td><td>05-527-90</td><td>Falcon 15mL 원추형 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>PBS (500 mL)</td><td>Fischer (Gibco)</td><td>20-012-027</td><td>Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2</td></tr><tr><td>Red lamp (heating lamp)</td><td>Dirk Rossmann GmbH (독일)</td><td>405096</td><td>가열 infrred 램프 (100 와트)</td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurane)</td><td>Abbott Laboratories (미국)</td><td>5260.04-05.</td><td>이소플루란 마취제(250mL 플라스크).</td></tr><tr><td>CO2 흡수기가 있는 탁상용 마취 기계/모바일 마취 기계</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td>Isoflurane 마취 기계.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 배지</td><td>Gibco (ThermoFischer에서 배포)</td><td>11-875-093</td><td>기본 배지 글루타민(500mL)</td></tr><tr><td>펜 스트렙트 항생제 용액(Gibco)</td><td>Gibco(ThermoFischer에서 배포)</td><td>15-140-148</td><td>Gibco 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td></tr><tr><td>태아 보빈 혈청(Gibco)</td><td>Gibco(ThermoFischer에서 배포)</td><td>10082147</td><td>소 태아 혈청, 인증, 열 비활성화, 미국 원산지</td></tr><tr><td>ACK 용해 완충액 (100 ml)</td><td>Gibco (ThermoFischer에서 배포)</td><td>A1049201</td><td>염화 칼륨 (ACK) 전혈 용해 버퍼, 비장 현탁액의 적혈구 용해에 적합</td></tr><tr><td>플라스틱 페트리 접시</td><td>Nunc (ThermoFischer에서 배포)</td><td>150340</td><td>60 x 15mm 플라스틱 페트리 접시, 비처리</td></tr><tr><td>세포 덩어리 필터</td><td>CellTrics (Sysmex)</td><td>04-004-2317</td><td>셀트릭스&reg; 50 &뮤; M, 멸균</td></tr></tbody></table>

급속 한 비보에 평가 보조의 세포 독성 t 림프 톨 생성 기능의 백신 개발에 대 한

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

현대 소 단위 백신의 평가의 중화 항 체 생성은 중요 하지만 보조 선택에 대 한 충분 한 보여준다. 따라서, 세포 독성 T 세포 (CTL) 응답을 홍보할 수 있는 체액과 세포 면역 물질로 기능 adjuvants 절실히 필요 합니다. 따라서, 크로스 못쓰게 유도 하 고 이후 CTL 세대 강화 보조 후보자의 충실 한 모니터링 백신 개발에 중요 한 단계를 나타냅니다. 여기에 우리는 SIINFEKL 전용을 사용 하는 방법에 대 한 응용 프로그램을 제시 (OT-나)는 크로스-프레 젠 테이 션 모델 항 ovalbumin (OVA)는 비보에 다른 보조 후보자의 존재를 모니터링 하는 T 세포. 이 메서드는 adjuvants 최고의 크로스 못쓰게 기능을 선택 하는 빠른 테스트를 나타냅니다. CD8 확산+ T 세포 간 못쓰게의 가장 중요 한 표시 이며 그것은 또한 보조 유도 크로스-프레 젠 테이 션의 상관으로 간주 된다. 이 기능은 림프절과 비장 같은 다른 면역 기관에 평가할 수 있습니다. CTL의 정도 모니터링할 수 있습니다, 따라서 로컬의 특성에 통찰력을 주는 (주로 림프절 배수) 또는 조직의 반응 (먼 파선 또는 비장). 이 기술은 더 또한 종래와 유전자 변형 쥐의 다른 긴장에 사용 될 가능성을 제공 하 고 특정 크로스-프레 젠 테이 션 경로 억제할 수 있는 약물 테스트에 대 한 여러 수정 수 있습니다. 요약 하자면, 우리는 여기에 제시 하는 응용 프로그램 개발 하거나 백신 연구와 개발에 대 한 화학 adjuvants 수정 업계 또는 학계에서 백신 연구소에 대 한 유용할 것 이다.

Adjuvants (ADJ1 및 ADJ2)의 다른 조합을 사용 하 여 치료를 테스트 하려면 우리 adoptively 전송된 OT의 확산을 측정 하 여 CTL 세대 용량 평가-내가 CD8 cytometry (그림 2)에 의해+ T 세포. 이 위해, 우리는 이전 배출 림프절과 비장 (표 1)에서 격리 된 셀 스테인드. CD8의 확산을 측정 하 여 림프절과 비장,+ T 세포는 CTL 세대 고용량 ADJ2의 배수 림프절 (그림 3)에 비교 될 때 ADJ1, OVA 혼자 또는 PBS 컨트롤 확증 수 있었습니다. 반면, 우리는 관찰 ADJ2 조직 (비장)에 CTL 응답을 생성 하지 못했습니다, 반면 ADJ1 비장 CD8에 의해 확산의 표시 높은 수준의+ T 세포, 하지만 하지만 또한 우수...

선물이 여기 표준 면역학 기술에 대 한 응용 프로그램 (CFSE 스테인드 OT-내가 확산) 빠르게 보조 중재 된 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 세대를 모니터링 하기 위한 vivo에서. 이 빠른 CTL 용량 추정 세포내 병원 체에 대 한 예방 백신으로 치료 암 백신의 개발에 대 한 유용합니다.

급속 한 비보에 평가 보조의 세포 독성 T 림프 톨 생성 기능의 백신 개발에 대 한

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

이 실험의 전반적인 목표는 면역된 수용 동물의 배액 림프절 및 비장에서 양적으로 전달된 CFSE 염색 OT1 CD8 양성 T 세포 증식을 모니터링하여 세포독성 T 림프구를 생성하는 관심 보조제의 능력을 결정하는 것입니다. 이 방법은 세포 독성 세포 반응을 생성하는 보조제의 효능과 같은 백신학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기법의 가장 큰 장점은 보조제의 CTL 용량뿐만 아니라 이것이 국소 또는 전신 상태인지를 결정할 수 있으며 4일 만에 완료할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 Elena Reinhard가 맡을 것입니다. OT1 마우스에서 허벅지 1.1 양성 CD8 양성 T 세포를 분리하기 위해, 먼저 표준 프로토콜에 따라 비장과 서혜부, 겨드랑이 및 자궁경부 림프절을 채취하여 모든 장기를 60mm 페트리 접시에 담은 100 마이크로미터 기공 메쉬 스트레이너에 넣고, 마우스당 3-5밀리리터의 얼음 위에 완전한 배지를 채취합니다. 큰 OT1 비장이나 림프절에서 채취하지 마십시오.이 림프 조직의 T 세포는 백혈병일 수 있으며 자극이 없어 분석 결과를 혼란스럽게 하지 않아도 증식할 수 있으므로 이러한 림프 조직에서 채취하지 마십시오.각 기증 동물에서 모든 장기를 적출한 후 주사기 플런저를 사용하여 메쉬 필터를 통해 샘플을 으깨고 생성된 단일 현탁액을 마우스당 하나의 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 원심분리로 세포를 펠렛화한 다음 10ml의 차가운 PBS로 원심분리 세척합니다. 적혈구 펠릿을 얼음 위의 튜브당 1ml의 염화암모늄 완충액에 용해시킵니다.90초 후, 또 다른 10ml의 PBS로 세포를 세척하고 1ml의 PBS와 튜브당 5%FBS로 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 음성 선택 키트를 사용하여 표준 자기 비드 분리 프로토콜에 따라 CD8 양성 T 세포를 분리하고 자기 비드로 분류된 CD8 양성 T 세포의 수를 계산합니다. 다음으로, T 세포를 개별 15 밀리리터 원뿔형 튜브에서 PBS 농도 1 밀리리터당 7 번째 세포로 1-5 x 10으로 희석하고 각 세포 샘플을 섭씨 37도에서 7 분 동안 5 마이크로 몰 CFSE로 염색하고 빛으로부터 보호합니다.배양이 끝나면 동일한 부피의 FBS로 염색 반응을 소멸시키고 세포를 추가로 7분 동안 섭씨 37도의 인큐베이터에 다시 넣습니다. 두 번째 배양이 끝나면 세척 당 10 밀리리터의 PBS로 세포를 두 번 세

rapid-vivo-assessment-adjuvant-s-cytotoxic-t-lymphocytes-generation

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

의 생성에 대한 신속, 간단하고 비용 효율적인 프로토콜 기증자 파생 CMV, EBV 감염 또는 교수실을 개발하는 위험 allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 수신자에게 주입을위한 multivirus 특정 CTLs (rCTL을). 이 제조 과정은 GMP 준수하고 전문 센터 이외 T - 세포 immunotherapy의 광범위한 구현을 보장한다.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

이 비디오는 in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte 또는 CTL 생산을 모니터링하는 면역학적 방법을 보여줍니다. 마우스에는 유전자 조작된 증식성 염료 염색 공여체 CD8+ T 림프구가 사전 주입됩니다. 보조제와 함께 오브알부민을 피하 주사하면 세포독성 CD8+ T 림프구가 생성되며, 이는 면역염색 및 유세포 분석을 통해 수확 후 확인됩니다.

보조 매개 세포독성 T 림프구 생성을 모니터링하기 위한 면역학적 기술

생체 내에서 상세히 T 세포 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 면역 반응에 대한 이해의 발전을 위해 중요하다. 여기에서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 동시에&gt; 250 매개 변수를 평가하는 생체 내 T 세포의 분석에서 형광 타겟 어레이 (FTA 체결)의 사용을 설명한다.

T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용<em&gt; 생체 내</em

쥐 백신 접종 모델에서 나노 입자를 사용한 면역에 대한 반응으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 모니터링하기 위한 전체 동물 이미징 및 유세포 분석 기반 기술에 대해 설명합니다.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

이 프로토콜의 목표 vivo에서 의 검출에 대 한 항 원 특정 murine 모델에서 목표 셀의 살인을 허용 하는 것입니다.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

여기, 우리는 흡입 물집 피부 리콜 모델의 데모를 제공합니다. 모델에는 인간의 vivo에서 적응 면역 반응, 예를 들어 백신 개발의 맥락에서에서 연구 간단한 액세스할 수 있습니다.

인간 T 세포 회수 응답에서 Vivo에서 공부 하는 흡입 물집 프로토콜

Immunostimulating 접한의 치료 후 림프 조직의 림프 수지상 세포 활성화 테스트 후속 추출에 대 한 실험 절차를 설명 합니다.

Immunostimulatory 에이전트 평가: 림프 조직 추출 및 주입 경로-종속 수지상 세포 활성화

여기에서는 종양 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 반응에서 면역 우세의 검사를 가능 하 게 하는 유 세포 분석 기반의 생체 사 멸 분석 법을 설명 한다. 이 우아한 분석을 기계 론 적 연구와 약물 효능 테스트에 사용 하는 방법의 예를 제공 합니다.

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

이 프로토콜은 나노 에멀젼 오피오포고닌 D 보조제가 효과적인 세포 면역 반응을 촉진하는지 여부를 평가하기 위한 상세한 방법을 제시합니다.

체외 나노에멀젼 백신 보조제인 오피오포고닌 D의 세포 활성 평가

여기에서는 비강 자가 조립 나노에멀젼 종양 백신의 시험 관 내 및 생체 내 비강 내 진단 및 평가를 위한 자세한 방법을 제시 합니다.

비강 자기조립 나노에멀젼 종양백신의 제조, 특성, 독성 및 효능 평가 In Vitro 및 In Vivo

이 방법론은 소 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)의 생성과 소의 잠재적인 동물용 백신 개발 중 항원 후보의 시험관 내 평가를 위한 적용을 설명합니다.

소 단핵구 유래 수지상 세포를 이용한 백신 면역원성 측정

학습하세요 CFSE 염색 OT-I CD8+ T 세포 증식을 모니터링하여 세포독성 T 림프구를 생성하는 백신 보조제의 효능을 4일 만에 평가하는 방법을. 이 기술은 면역학 및 백신 개발 연구에 필수적입니다.

급속 한 비보에 평가 보조의 세포 독성 T 림프 톨 생성 기능의 백신 개발에 대 한

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