Name: Stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 배우세요 식물 잎 조직에서 기공 가드 세포를 분리하고 농축하는 개선된 테이프-껍질 방법을 통해 생리학적 및 생화학적 분석을 위한 고품질 샘플을 준비하는 기술을.

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우리는 다니엘 첸에서 디지털 영상 제작 팀의 벅 홀 고등학교 동영상 편집에 감사 합니다. Stomatal 가드 셀 proteomics, metabolomics 첸 실험실에서에이 연구는 미국 국립 과학 재단 (0818051, 1158000 및 1412547)에서 교부 금에 의해 지원 되었습니다. Wenwen 홍콩 중국 장학금 위원회에 의해 지원 됩니다. 박사 Qiuying Pang 중국 장학금 위원회 국가 자연 과학 재단의 중국 (31570396)에 의해 지원 됩니다.

1. 성장 하는 식물
<ol><li>Potting 혼합물에 씨를 출 아 할. 식물 성장 성장 챔버에 140 µmol 광자 m−2의 − 1 의 광도와 22 ° C 및 16 h 8 h 조명의 photoperiod 어두운 18 ° C에서 2 주 동안.</li>
	<li>4"직경 남 비는 토양을 포함으로 개별적으로 비슷한 크기의 묘를 이식 하 고 성장 단계 1.1에서에서 설명 하는 추가 동일한 조건에서 3 주. 참고: 습 한 토양을 유지 하는 일주일에 두 번 수돗물 식물 물.</li>
</ol>2입니다. 풍부한 Stomata의 준비
<ol><li>메스와 개별 5 주 된 A. thaliana 식물의 잎을 제거 합니다.</li>
	<li>원피스 abaxial (아래) 쪽으로 준수와 준수는 잎의 adaxial (위) 쪽으로 다른 조각 각 잎 투명 스카치 테이프의 두 가지를 연결 합니다. 5 잎에 테이프를 두고 s.</li>
	<li>부드러운 껍질 떨어져 포장과 가드 세포 mesophyll 세포를 가진 adaxial 측 abaxial 측을 분리 각 손에 집게 손가락 및 엄지를 사용 하는 테이프의 두 가지.</li>
	<li>장소 여 stomata의 60 mL에 나뭇잎의 abaxial 측면에서 껍질 40 m m × 12 m m 크기 페 트리 (50 m m KCl, 10mm MES-코, pH 6.2 1 m 코 조정) 버퍼링은 수집 된 요리.<ol>
<li>모든 샘플 껍질 수집 될 때까지 위의 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.1 단계에 명시 된 빛 조건에서 성장 챔버에 껍질을 포함 하는 배양 접시를 놓습니다. Stomata를 완전히 여 2 h에 대 한 빛 아래 껍질을 남겨 주세요.</li>
	<li>장소는 150 m m x 20 m m 소화 효소 혼합물 (0.7% cellulase R-10, 0.025% macerozyme R-10, 0.1% (w/v) polyvinylpyrrolidone-40, 및 0.25% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 55% 기본 솔루션 (0.55 M sorbitol, 0.5 m m에서에서 세포 벽의 50 mL를 포함 하는 배양 접시에 껍질 CaCl2, 0.5 m m MgCl2, 0.5 m m 의약품, 10 µ M KH2포4, 5 mM 4 morpholineethanesulfonic 산 (MES) pH 5.7에서 1 m 코 조정).</li>
	<li>20 분 50 rpm에서 배양 접시에 상호 통에 껍질을 흔들어.</li>
	<li>껍질에서에서 제거 효소 솔루션 핀셋으로 후 20 분 물 50 mL를 포함 하는 150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 껍질을 전송 합니다.</li>
	<li>15 대 한 껍질을 씻어 전송 피 펫을 사용 하 여, 모든 잔여 효소 솔루션을 제거 하는 물 10 mL로 두 번 s.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여 단계 2.4에서에서 사용 되는 버퍼를 열고 신선한 stomata의 50 mL와 150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 껍질을 배치. 1 h 단계 복구 stomata 있도록 1.1에서에서 명시 된 조명 조건에 대 한 품 어.</li>
</ol>3. Abscisic 산 (ABA) 치료 및 Stomata 움직임 분석 결과
<ol><li>150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 15 분 stomatal 개통 버퍼의 50 mL 또는 stomatal 개통 버퍼의 적절 한 치료 시간이 10 µ M ABA의 최종 농도 50 mL 30 ° C에서 풍부한 stomata 껍질을 품 어.</li>
	<li>5, 15, 30 분 동안 50 rpm에서 통에 껍질을 놓습니다. 각 시간 간격 후 핀셋으로 껍질을 제거 하 고 단계 3.3 이미징 단계를 따릅니다.</li>
	<li>가벼운 현미경으로 ABA 치료 후 stomata ABA 치료 전과 다양 한 시간 점에서 이미지를 받아.<ol>
<li>껍질을가지고 고 유리 현미경 슬라이드 위에 놓습니다.</li>
		<li>슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 무대를 조정 하는 껍질의 이미지를 시각화할 수 있습니다.</li>
		<li>벌금을 조정 하 고 가드 셀의 깨끗 한 이미지를 현미경에 집중 코스.</li>
		<li>40 X 확대에서 여러 stomata의 여러 이미지를 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>60 stomatal apertures ImageJ8를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	<li>표준 오류 및 p-값 < 0.05 60 stomatal 조리개 측정의 의미를 계산 합니다.</li>
</ol>4. 단백질 추출 및 SDS 페이지 분리
<ol><li>15 대 한 껍질을 갈아 냉장된 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 껍질을 충당 하기 위해 충분 한 액체 질소에 s.</li>
	<li>50 껍질 당 포화 트리 스 페 놀 (pH 8.8)의 3 개 mL를 추가 및 3 mL 단백질 추출 버퍼 (자당 0.9 M, 0.1 M Tris HCl, 0.01 M EDTA, 0.4 %2-Mercaptoethanol, 1mm 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물의 10 µ L) 박격포를 피 펫을 다음 5 addi의 껍질을 갈아 증기 두건에서 tional 분입니다.</li>
	<li>추출은 피 펫을 사용 하 여 전송 하 고는 오크에 금속 핀셋을 사용 하 여 껍질 원심 관 50 rpm에서 1 h 4 ° c.에 대 한 통에 선동</li>
	<li>오크 릿지 원심 분리기 튜브에서 껍질을 제거 하 고 원심 10 분 동안 5000 x g에서 추출. 다음 전송 최고 페 놀 단계는 피 펫을 사용 하 여 새로운 깨끗 한 마이크로 원심 튜브.</li>
	<li>침전은 페 놀 100% 메탄올에 얼음 처럼 차가운 0.1 M 염화 아세테이트의 5 볼륨을 추가 하 여 단백질을 추출. 짧게 소용돌이 하룻밤-20 ° c.에 품 어</li>
	<li>20 분 동안 4 ° C에서 20000 x g에서 centrifuge, 천천히는 튜브 붓는 여는 상쾌한 가만히 따르다 고 튜브에 단백질 펠 릿을 유지 합니다.</li>
	<li>메탄올에 0.1 M 염화 아세테이트로 두 번 단백질 펠 릿을 세척 그리고 두 번 80% 아세톤과 함께 한 번 100% 찬 아세톤. 참고: 세척 단백질의 튜브에 지정 된 시 약의 10 mL를 추가 하 여 수행 됩니다. 5 분, 10 분 동안 4 ° C에서 15000 x g에서 원심 분리 뒤 50 rpm에서 통에 교 반 하십시오. 그런 다음 튜브만 단백질 펠 릿을 유지 시 약을 붓는 다.</li>
	<li>펠 릿을 100% 찬 아세톤의 1 mL을 추가 하 고 다시 천천히 위아래로 pipetting으로 일시 중단.</li>
	<li>2 mL 마이크로 원심 관에 피 펫을 통해 단백질 정지를 전송 후 5 분 동안 4 ° C에서 20000 x g에서 원심.</li>
	<li>튜브에서 decanting 하 여 아세톤을 제거 하 고 10 분 동안 증기 두건에서 펠 릿 건조.</li>
	<li>마이크로 원심 튜브 해산 버퍼 (8 M 요소, 0.5 %SDS, pH 8.5에서 30 mM Tris HCl)의 200 µ L에서에서 단백질 분해와 20000 x g 20 분 및 수집 새로운 튜브에 상쾌한 15 ° c에서 30 분 원심 분리기에 대 한 소용돌이.</li>
	<li>다음 단백질 정량화 프로토콜9단백질 농도 계량.</li>
	<li>단백질 분리에 대 한 단백질 견본을 사용 하 여 젤 전기 이동 법 프로토콜10다음으로.</li>
</ol>

<ol><li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+interactions+in+stomatal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li>
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<li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents%2C+chaotropes%2C+dyes%2C+and+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언.

가드 셀 모델 시스템 식물에서 신호 전달 메커니즘 연구 이며 연구에 사용 하는 샘플의 준비는 생물학 질문에 가장 적합 한 보장 하는 것이 중요 하다. 식물 연구 지역 사회 내에서 가드 셀에 증가 관심에도 불구 하 고 보편적인 메서드는 stomatal 운동 및 생리학 있도록 stomatal 가드 셀을 준비 하는 방법에 대 한 공부 분자 변화 뿐만 아니라 시스템입니다. 그들을 도전 많은 부분에서 그들의 작은 크기, 낮은 풍요와 그것을 더 많거나 적은 전체 잎에서 그들을 제거 어렵게 만들 수 있는 독특한 구조를 지정할 수 있습니다.
이 프로토콜 개발된 테이프-껍질 메서드를 사용 하 여 그들을 분리 하는 이러한 장애물을 극복 하는 방법에 대 한 방법의 제공 한다. 이 프로토콜에 표시 하는 방법 그대로 stomatal 가드 세포, 생리 적으로 자극에 응답 상태를 유지 하기 위한 방법을 제공 합니다. 이 샘플의 준비는 탠덤 질량 태그 (TMT) 또는 대 한 Isobaric 태그를 이용 하 ...

Stomata 전반적인 생리학과 식물의 적합성에 중요 한 역할을 한다. 이 작은 식물 특정 구조 가드 셀으로 알려진 두 전문된 상피 세포에 의해 형성 되 고 잎의 abaxial 표면에 가장 풍부 하 게 발견 된다. Stomata가 식물 및 분위기,으로 물 증발을 통해 손실 컨트롤 사이 가스의 교환에 대 한 필요 합니다. 가드 셀 (예를 들어, 빛, 습도, 병원 체 접촉, 이산화탄소 수준) 다른 외부의 통합을 통해 stomata 조리개 조절 및 내부 (예., 내 생 호르몬) 자극1,2. 지난 20 년 동안에이 세포 유형은 식물에서 프로세스 신호 공부 셀 모델 시스템 되고있다. 이러한 셀 리프; 총 셀의 작은 분수를 만들 따라서, 그들의 독특한 휴대 조사, 생 화 학적 및 분자 속성 단일 셀 방식으로, 그것은 다른 리프 셀 종류에서 그들을 격리 하는 데 필요한. 과거, 가드 셀 연구는 자주 참여 하고있다 가드 셀 protoplasts (GCP)3,,45의 준비. 이 일반적으로 많은 양의 세포 벽 타락 효소 및 또는 혼합을 통해 기계적 장애를 사용 해야 합니다 그리고 작은 수익률 시간 일반적으로 자주 GCP 샘플을 준비 하는 데 많은 시간이 소요 비용과 시간이 많이 소요 될 입증. 더 중요 한 것은, 가드 셀 stomata 조리개를 조절 하는 완전 한 쌍으로, 행동 하기 때문에 GCP 사용 하 여 가드 셀 신호를 공부 하 고 인공 시스템으로 볼 수 있습니다.
여기, 우리는 그대로 가드 셀 풍성 하 게 하 고 자극에 생리 적인 응답을 유지 stomata를 준비 하는 방법을 개발 했습니다. 이 메서드는 mesophyll 셀 protoplasts6,7를 분리 하는 데 사용 된 방법에 의해 영감을 했다. 우리의 방법에 stomata 투명 스카치 테이프를 먼저 mesophyll 세포의 대부분을 분리 포장과 가드 셀을 포함 하는 abaxial 계층에서 잎의 adaxial 레이어에 연결을 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 이 잎의 각 측에 테이프의 조각을 추가 하 고 그들을 떨어져 필 링을 하면 됩니다. Abaxial 계층에서 셀 광원 stomata 오프닝 버퍼에서 복구할 수 있습니다. 후 나머지 포장도 세포의 세포 벽 타락 효소, 테이프에 가드 셀을 풍성 하 게 뒤에 남겨두고 소량을 사용 하 여 제거 됩니다.
이 간단한 방법에서는, stomatal 가드 셀 실용적이 고 반응 수 신속 하 게 그리고 효율적으로 준비, 농축된 stomatal 가드 세포를 최소의 비용으로 50 껍질에서 1 시간 이내에 복용. 여기에 메서드 protoplasts 준비는 이전 방법 보다는 식물 세포에 더 적은 손상을 부과 했다. 또한, 재료는이 방법은 수율 바람직한 단백질 금액에서 수집. 가장 중요 한 것은, 잎 혼합 대상이 되지 않습니다, 긴 소화 시간과 가드 셀 그대로 유지 하기 때문에 연구의 결과 더 밀접 하 게 가드 셀의 자연적인 생물학의 관련이 있을 것입니다. 이 방법으로 분자 수준에서 변경 stomatal 움직임 실시간에서 상관 수 있다. 따라서,이 준비 메서드를 사용 하 여 연구에서 얻은 지식을 가드 셀 신호에 대 한 보다 포괄적인 이해에 대 한 중요 한 것입니다.
우리 모델; 식물 애기 thaliana 사용 그러나이 프로토콜을 소화 시간에 작은 수정 stomatal 가드 셀 브라 시카 napus 등 다른 식물 종에의 농축에 적용할 수 있습니다. 개념의 증거로 서 우리는이 방법을 통해 농축 stomatal 가드 세포는 가능한 fluorescein diacetate (FDA) 분석 결과 각각 식물 호르몬 abscisic 산 (ABA)를 이용 하 여 연구에 의해 표시 된 것 처럼 자극에 반응 증명 하고있다. 또한, 우리는 높은-품질 단백질이 가드 셀에서 고립 될 수 있다 증명 하고있다. 여기, 우리는이 과정의 상세한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>스테인레스 스틸 수술용 메</td>스 <td>깃털&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>NC9999403</tr><tr><td>스카치 테이프 (3M)</td><td>ULINE</td><td>S-9781</td><td></td></tr><tr><td>페트리 디쉬</td><td>시그마-알드리치</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>셀룰라아제 (Onozuka R-10)&nbsp;</td><td>공급자:Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>21560003-3</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>야쿠르트 제약 산업 Co., Ltd.</td><td>21560003-4</td><td></td></tr><tr><td>DM6000B 현미경&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>PI78443</tr><tr><td>Oak Ridge 고속 PPCO 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3119-0030</td><td></td></tr><tr><td>EZQ 단백질 정량 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 디아세테이트(FDA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>앱시스산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4906</td><td></td></tr><tr><td>Metro Mix 500</td><td>BWI 회사&nbsp;</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 샘플 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Safe Comassie (G-250)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 (2mL)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>국립 보건</td><td></td><td></td>연구소</tr><tr><td>핀셋&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017-1EA</td><td></td></tr><tr><td>12% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 젤</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr></tbody></table>

stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

가드 셀의 연구의 식물의 전반적인 기능에이 세포 유형은 특정 기부금의 지식에 근본적 이다. 그러나, 그것은 종종 어려운 분리 하 고 도전을 제공 따라서 종종 그들을 공부.
이 연구는 stomatal 가드 세포 농축 방법을 설정합니다. 프로토콜 가드 세포를 분리 하 고 세포에서 단백질을 추출에 스카치 테이프를 사용 합니다. 이 방법은 무결성과 가드 셀의 수익률 격리 중 향상과 세포 신호 프로세스와 어떻게 그들이 stomatal 운동 고기 연관의 연구에 대 한 신뢰할 수 있는 샘플을 제공 합니다. 이 방법에서는, 식물 잎 테이프의 두 부분 사이 분할 되었고 abaxial 쪽 제거를 떨어져 벗 겨. 이 프로토콜은 가드 셀을 애기 잎 조직에 적용 되었다. Fluorescein diacetate 생존 능력을 결정 하는 (FDA)와 abscisic 산 (ABA) stomata 운동 ABA에 대 한 응답에서을 평가 하는 세포 치료 했다. 결론적으로,이 프로토콜 증명 농축된 stomatal 가드 셀을 준비 하 고 단백질을 분리 하는 데 유용 합니다. 세포와 단백질의 품질 얻을 여기 생리 및 다른 생물학 연구.

대표 이미지 전에 애기 가드 셀의 전후 mesophyll와 표 피 세포의 소화 그림 1에 표시 됩니다. 효소 활동 및 세포 막의 무결성 (그림 1B 및 1 D)를 측정 하는 FDA를 사용 하 여 mesophyll와 표 피 세포의 제거 전후 가드 세포 생존 능력을 관찰할 수 있습니다. 그림 2 는 stomatal 운동의 애기 ABA 치료에 대 한 응답에서을 보여 줍니다. Stomatal 조리개 ABA 치료의 30 분 후 50% 이상 감소합니다. 그림 2A stomata 운동의 시간 코스입니다. 다양 한 시간 점에서 사진 가벼운 현미경으로 찍은 사진. Stomatal 조리개 ImageJ로 측정 되었다 고 결과 80 조리개 측정 ± 표...

이 프로토콜 생리 및 다른 생물학 학문을 위한 유용한 풍부한 stomatal 가드 셀 준비의 방법을 설명 합니다.

Stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

이 실험의 전반적인 목표는 전사체학, 단백질체학 및 대사체학과 같은 생리학적, 생화학적, 분자 분석을 위해 고품질의 농축 기공 보호 세포를 준비하는 것입니다. 안녕하세요, 제 이름은 쉘든 로렌스입니다. 저는 플로리다 대학교 생물학과 첸 박사 연구실의 대학원생입니다.오늘은 기공의 생리학과 생물학을 연구하는 데 유용한 재료인 식물 잎 조직에서 보호 세포를 분리하는 방법을 보여 드리겠습니다. 이 방법은 보호 세포를 분리하는 새로운 방법으로 간주됩니다. 특히 온전한 보호 세포를 농축할 수 있으며 기공 세포 신호 전달 과정 연구를 위한 신뢰할 수 있는 샘플을 제공합니다.이 방법의 적용은 프로토콜에 대한 약간의 수정만으로 Brassicaceae 식물 및 기타 식물 종으로 확장될 수 있습니다. 보호 세포를 풍부하게 하기 위한 주요 단계가 어려울 수 있으므로 시연이 중요합니다. 시작하려면 5주 된 성숙한 애기장대 식물을 선택하십시오.메스로 잎을 조심스럽게 제거하고 잎 밑부분을 자릅니다. 스카치 테이프 두 조각을 가져다가 그 사이에 절제된 잎을 놓습니다. 테이프 조각의 끝이 붙지 않도록 하면서 양쪽에 부드럽게 압력을 가합니다.이것은 그들 사이에 손가락을 삽입하여 수행할 수 있습니다. 두 개의 테이프를 서로 조심스럽게 떼어내고, 잎의 축방향 쪽에서 떼어낸 껍질을 즉시 기공 개방 완충액에 띄웁니다. 모든 껍질을 모은 후 빛 아래에 두십시오.2시간 동안 그대로 두십시오. 여러 개의 껍질을 벗겨 현미경 슬라이드에 놓습니다. 광학 현미경을 사용하여 렌즈를 조정하여 보호 세포를 보고 열려 있는지 확인합니다.껍질을 세포벽 소화 효소 용액 50ml에 넣습니다. 섭씨 26도에서 띄우고 배양하십시오. 20분 후, 효소 용액에서 껍질을 제거하고 탈이온수로 짧게 두 번 헹구고 신선한 기공 개방 완충액에 넣습니다.절구를 액체 질소로 절구에 넣고 유봉으로 껍질을 갈아줍니다. 그런 다음 텍스트에 설명된 대로 페놀 추출을 수행합니다. 절구공이로 절구에 껍질을 분쇄한 후 추출물과 껍질을 Oak Ridge 원심분리 튜브에 옮기고 섭씨 4도에서 한 시간 동안 셰이커에서 교반합니다.100% 메탄올에 얼음처럼 차가운 0.1mol 아세트산 암모늄 5개를 첨가하여 페놀 추출 단백질을 침전시킵니다. 섭씨 20도에서 하룻밤 동안 단백질을 침전시킨 후 원심분리로 단백질을 수확하고 텍스트에 설명된 대로 펠릿 세척을 수행합니다. 펠릿을 1ml의 차가운 아세톤에 다시 현탁시키고 2mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.원심분리 후 아세톤 상등액을 버리고 펠릿을 10분 동안 건조시킵니다. 단백질 샘플을 용해 완충액에 용해시킵니다. 와류와 원심분리 후 상등액을 수집하고 단백질 농도를 측정합니다.SDS-PAGE 젤을 실행합니다. 분리된 단백질 밴드를 시각화하고 상대적인 단백질 품질을 관찰합니다. 이것은 중엽 세포와 표피 세포의 효소 소화 전후의 애기장대 보호 세포의 대표적인 이미지입니다.중엽 및 표피 세포 제거 전후의 보호 세포 생존력은 효소 활성과 세포막 무결성을 측정하는 플루오레세인 디아세테이트를 사용하여 관찰할 수 있습니다. 보시다시피, 공변세포는 필링과 효소 소화 후에도 여전히 생존할 수 있습니다. 이 예는 ABA 치료에 대한 반응으로 애기장대(Arabidopsis)의 기공 이동을 보여줍니다.공변세포는 치료에 반응하며 ABA 치료 30분 후 기공 조리개가 50% 이상 감소합니다. 기공 운동의 시간 코스입니다. 또한, 각 시점에서의 기공 조리개의 대표적인 이미지가 도시되어 있습니다.단백질 검출, 분리 및 상대적 존재비는 SDS-PAGE에 의해 관찰됩니다. 밴드는 명확하고 뚜렷합니다. 이 방법에서 단백질 추출의 재현성을 강조하기 위해 4개의 생물학적 복제가 포함되어 있습니다.이 방법에 대한 아이디어는 공변세포의 분자 변화를 실시간으로 기공의 움직임과 연관시키려고 했을 때 처음 떠올랐습니다. 마스터링이 완료되면 기공 보호 세포의 단백질 샘플을 몇 시간 내에 준비할 수 있으며 여러 실험에 사용할 수 있습니다. 박리 및 취급하는 동안 가드 세포에 많은 피해를 주지 않도록 기억하는 것이 중요합니다.이 방법에 따라 정상 및 스트레스 조건에서 식물에서 단백질의 redux 반응을 연구하기 위한 isobaric 라벨링과 같은 다른 기술을 적용하여 보호 세포 신호 전달을 조사할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 손상되지 않고 생존 가능한 보호 세포를 분리 및 농축하는 방법과 다운스트림 연구에 적합한 고품질 단백질을 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

공간적 특정 phytochrome 반응의 분자 기초는 조직과 기관이 특정 phytochrome 결함을 전시 유전자 변형 식물을 사용하여 조사 중입니다. 특정 세포의 분리는 microarray 분석에 의해 다음 정렬 것은 공간적 특정 phytochrome 응답에 관련된 유전자를 확인하기 위해 활용되고있는 형광 활성화된 세포로 유도 phytochrome 발색단 고갈을 전시.

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

우리는 사는 박테리아에 stomatal 응답을 액세스하는 간단하고 재현성 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 표피 껍질의 사용에 비해 잎사귀의 입힐 수있는 총알과 조작​​은 이전에 보고된 최소화합니다.

전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

이 문서에서는 열대 응답 중 plasmodesmal 투과성 때문에 옥신 기울기를 제어하는​​ 유전자를 선별하기위한 방법을 설명합니다. 이것은 배축 트로픽 반응의 정도의 측정을 포함   애기 장대와 8-hydroxypyrene-1,3,6- trisulfonic 산 (HPTS)로드 그리고 마지막으로 callose 수준의 평가에 의해 plasmodesmal 투과성을 체크.

전략은 트로픽 응답에 Callose 매개 Plasmodesmal 게이팅의 역할을 확인하려면

주기성 시계는 애기 사체의 제에 대한 규제 만 계시로 피드백 유전자의 비율은 알 수없는 남아 있습니다. 여기에서 우리는 신속하게 일시적으로 원형질체에 표시되는 주기성 기자의 발광 이미지를 사용하여 애기 장대의 돌연변이 라인에서 일주기 표현형을 평가하는 방법을 시각화.

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

식물 수정을 위한 기존 방법은 적용 가능성이 제한적입니다. 여기에서 제안된 새로운 펩타이드 유래 기술은 온전한 식물의 원하는 세포 내 구획에 외인성 단백질 또는 유전자를 도입하는 데 있어 단순성과 효율성을 모두 약속합니다.

펩타이드 유래의 방법은 식물의 유전자와 단백질 세포 간 및 Organellar 장벽을 수송하는

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 몇 가지 기본적인 개간 기술의 적절 한 해 부에 대 한 기법을 설명 하 고 생식 구조의 전체 마운트 관측에 대 한 절차를 얼룩이 지기 선정.

전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

이 프로토콜의 목표는 포함 하는 설탕 중간 솔루션으로 집중 치료에 의해 애기 thaliana 묘 cotyledons 클러스터 stomata를 유도 하는 방법 및 엽록체와 같은 세포내 구조를 관찰 하는 방법 그리고 confocal를 사용 하 여 클러스터 된 가드 셀에 microtubules 레이저 현미경 검사 법.

클러스터 Stomata 애기 thaliana 묘에 설탕 솔루션 집중 치료에 의해 위한 유도 시스템

이 논문은 기공 발달을 제어하는 유전자를 특성화하기 위해 표피 껍질을 사용하지 않는 두 가지 표현형 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은 톨루이딘 블루 O-염색 식물 표피를 사용하여 기공 표현형을 분석하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 방법은 기공 리간드를 식별하고 생물학적 활성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

표피 표현형 점수를 통한 기공 발달에 관여하는 유전자 식별

여기에서는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 직접 관찰하고 자동으로 측정하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법은 휴대용 기공 영상 장치와 장치에서 캡처한 잎 이미지를 위해 설계된 이미지 분석 파이프라인을 활용합니다.

Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000

이 프로토콜은 표피 필링, 투명화 기법, AI 보조 영상 분석을 활용하여 두 가지 서로 다른 종의 기공과 표피 특성을 비교 평가하는 방법을 제시합니다. 목표는 농업 응용과 광범위한 식물 연구를 위해 기공 기능의 기저 세포 구조를 고처리량, 재현 가능하게 정량화하는 것입니다.

필링, 클리어링, AI 기반 이미지 분석을 이용한 기공 및 표피 특성 특성

배우세요 식물 잎 조직에서 기공 가드 세포를 분리하고 농축하는 개선된 테이프-껍질 방법을 통해 생리학적 및 생화학적 분석을 위한 고품질 샘플을 준비하는 기술을.

Stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법

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