감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

이 분석 시리즈의 전반적인 목표는 마우스 난모세포를 사용하여 감수분열 I 동안 인간 유전자 기능을 조사하는 것입니다. 이러한 방법은 모계 이수성에 대한 유전적 소인이 있는지 여부와 같은 인간 생식 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 마우스 난모세포를 포유류 감수분열의 모델로 사용한다는 것인데, 이는 유전자 기능 연구를 위해 인간 난자에 접근할 수 없다는 점을 감안할 때 유용합니다.

이 방법에 대한 아이디어는 체외 수정 시술을 받은 여성의 엑솜 염기서열 분석을 통해 산모의 나이로 설명할 수 없는 배아 이수성 비율의 염기서열을 분석했을 때 처음 떠올랐습니다. 이미지 분석 단계는 배우기 어렵고 엄격한 분석 매개변수를 정의하는 것이 엄격함과 재현성의 핵심이기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 검증된 클로닝 전략을 사용하여 관심 유전자의 full-length coding sequence를 in vitro transcription vector의 다중 클로닝 영역에 삽입합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 삽입 및 결실을 생성하는 경우 DNA를 돌연변이화합니다. 다음으로, 돌연변이가 유발된 DNA를 박테리아 숙주로 변환합니다. 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 플라스미드를 분리 및 정제합니다.

그런 다음 정제된 DNA의 단일 제한 효소 분해를 사용하여 최종 산물을 선형화합니다. 검증된 DNA 클린업 프로토콜 또는 키트를 사용하여 분해된 산물을 정제합니다. 그리고 30마이크로리터의 RNase/DNase-free 물에서 용리합니다.

in vitro에서 제조업체의 프로토콜에 따라 T7 중합효소를 사용하여 DNA를 전사합니다. 마지막으로, 제조업체의 프로토콜에 따라 실리카 매트릭스 스핀 컬럼 기반 핵산 정제 키트를 사용하여 30마이크로리터의 RNase/DNase-free 물에서 RNA를 정제하고 용리합니다. 미세주입을 위해 난모세포를 동일한 그룹으로 나눕니다.

한 그룹에는 실험용 mRNA를, 다른 그룹에는 야생형 대조군 NPB 또는 GFP mRNA를 미세주입합니다. 유리 피펫 입구가 난모세포 직경보다 약간 큰 손 또는 입으로 작동되는 피펫팅 장치를 사용하여 배아 품질의 미네랄 오일로 덮인 페트리 접시에 있는 100마이크로리터의 밀리논이 없는 배양 배지 한 방울로 난모세포를 이동합니다. 그런 다음, 감수 분열 I.의 중기까지 충분한 성숙을 허용하기 위해 섭씨 37도에서 5 % CO2에서 7 시간 동안 난모 세포를 배양하고, 배양 후, 동일한 피펫 장치를 사용하여 난모 세포를 중앙 웰에 700 마이크로 리터의 사전 냉각 MEM 수집 배지와 외부 링에 500 마이크로 리터의 물을 포함하는 센터 웰 장기 배양 접시로 옮깁니다.

접시를 얼음 위에 7분 동안 놓습니다. 난모세포를 1x PBS에 400마이크로리터의 2%파라포름알데히드가 들어 있는 투명한 유리 스폿 플레이트의 우물로 옮겨 난모세포를 고정합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 면역염색 후 컨포칼 현미경에서 40-63x 대물렌즈를 사용하여 난모세포를 이미지화합니다. 작업 목표에 최적화된 Z-평면에서 작은 단계를 캡처하고 중상 스핀들의 전체 영역을 이미지화합니다. kinetochore 미세소관 부착 상태를 식별하려면 먼저 파일을 ImageJ 도구 모음으로 끌어다 놓아 이미지를 엽니다.

열린 Z-시리즈에서 이미지 드롭다운 메뉴로 이동하고 Color 하위 탭에서 Merge Channels를 클릭하여 모든 채널을 표시합니다. 분석가가 마우스 난모세포에서 키네토코어에 대한 어떤 유형의 부착이 가능한지 숙지하는 것이 중요합니다. 이미지의 품질은 이러한 데이터를 적절하게 분석하는 능력에 큰 영향을 미칩니다.

이미지 하단의 토글을 사용하여 각 Z 슬라이스를 이동하고 동체형 미세소관 부착을 확인합니다. 동일한 피펫 장치를 사용하여 난모세포를 오일 아래의 100마이크로리터 방울의 밀리논이 없는 배양 배지로 옮깁니다. 이전과 같이 감수분열 I의 중기까지 충분한 성숙을 위해 7시간 동안 난모세포를 배양합니다.

그런 다음 난모세포를 중앙 웰에 monastrol을 포함하는 700마이크로리터의 배양 배지와 주변 고리에 400마이크로리터의 물을 포함하는 중앙 웰 장기 배양 접시로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 100마이크로리터의 CZB 배양 배지 3방울을 통해 난모세포를 이동시켜 모나스트롤을 헹굽니다.

그런 다음 난모세포를 중앙 고리에 700마이크로리터의 배양 배지와 프로테아좀 억제제가 들어 있는 새로운 센터웰 장기 배양 접시로 옮깁니다. 외부 링에 400마이크로리터의 물을 넣고 3시간 동안 배양합니다. 다음으로, PBS에 400마이크로리터의 2%파라포름알데히드가 들어 있는 투명 유리 스폿 플레이트의 웰에 실온에서 20분 동안 난모세포를 옮겨 난모세포를 고정합니다.

컨포칼 현미경에서 40-63x 대물렌즈를 사용하여 난모세포를 이미지화하고, Z-평면에서 1미크론 단계 미만을 캡처하고, 중기 방추체의 전체 영역을 이미지화합니다. 염색체 정렬 상태를 식별하려면 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 엽니다. 그런 다음 이미지를 ImageJ 제어판으로 드래그합니다.

개방형 Z 시리즈에서 포인트 도구를 사용하여 이미지의 스핀들 폴 위에 도구를 놓고 이미지를 클릭하여 해당 Z 슬라이스의 각 스핀들 폴 끝에 있는 점을 표시합니다. 키보드의 명령 버튼과 T 버튼을 동시에 눌러 이러한 포인트를 ROI Manager에 추가합니다. ROI Manager에서 특정 지점을 강조 표시하고 Measure 버튼을 클릭하여 각 세트 위치에 대한 특정 좌표를 결정합니다.

이렇게 하면 각 점(각각 X1, Y1 및 X1, Y2 점)에 대한 X 및 Y 좌표가 포함된 결과 테이블이 제공됩니다. 다음으로, 실제 Z 좌표를 결정합니다. 이것은 스핀들 폴이 스택 두께로 식별된 Z 스택에서 특정 Z 슬라이스의 슬라이스 번호를 곱하여 수행됩니다.

이것은 각각 Z1 및 Z2 포인트가 됩니다. 피타고라스 정리 방정식을 사용하여 이전에 정의된 X, Y 및 Z 좌표와 함께 방추 길이를 결정합니다. 다음으로 스핀들 미드존을 결정합니다.

이것은 스핀들 길이의 1/2로 계산됩니다. ImageJ 도구 모음에서 선 아이콘을 클릭하고 한 스핀들 폴에서 스핀들 중간영역까지의 선을 그립니다. 길이가 ImageJ 도구 모음에 표시됩니다.

엄격한 염색체 정렬 매개변수를 정의하면 강력한 정량 분석이 가능하며, 이는 데이터 재현성에 중요합니다. line measurement 도구를 사용하여 spindle midzone에서 염색체 거리를 평가하여 염색체 정렬 상태를 결정합니다. ImageJ 도구 모음에서 선 아이콘을 클릭하고 스핀들 중간영역에서 염색체까지 선을 그립니다.

길이가 ImageJ 도구 모음에 표시됩니다. 방추체 중간영역에서 4미크론보다 큰 염색체는 정렬되지 않은 것으로 간주됩니다. 난모세포가 면역염색 및 이미징을 거친 후 올바른 미세소관 동맥 부착물을 평가할 수 있습니다.

정상적인 부착물에서, 2가의 각 자매 kinetochore 쌍은 반대쪽 극에서 방추 미세소관에 부착됩니다. 최대 세 가지 유형의 비정상적인 부착물이 관찰될 수 있습니다. 한 가지 예는 키네토코어와 접촉하는 미세소관이 없을 때 발생합니다.

또는 미세소관이 잘못 결합하여 syntelic 또는 merotelic 부착을 생성할 수 있습니다. Syntelic 부착은 단일 극에서 뻗어나온 미세소관에 부착된 두 쌍의 자매 kinetochores와 함께 형성됩니다. 메로텔릭 부착은 한 쌍의 자매 키네토코레스가 반대쪽 극에 부착될 때 발생합니다.

난모세포가 유도된 정렬 불량에서 회복된 후, 염색체가 재정렬되는 능력은 이미징을 통해 평가됩니다. 이 예에서 하나의 염색체 2가는 방추체 중간영역에서 4미크론 이상 떨어진 곳에 위치하기 때문에 잘못 정렬된 것으로 간주됩니다. 유전자 변이 기능을 평가하는 데 적합한 분석을 선택할 때는 연구 중인 인간 유전자 변이가 과발현되고 있으며 동시에 내인성 마우스 동족체를 고갈시켜야 할 수도 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 인간화 마우스 균주를 생성하는 CRISPR-Cas9와 같은 다른 방법을 수행하여 유전자 변이가 난자 및 배아의 품질에 어떤 영향을 미치는지, 그리고 개인의 생식 건강에 영향을 미치는지 이해하는 것과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 생식 유전학 분야의 연구자들이 인간의 모계 이수성에 대한 다른 원인 요인을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 유전자 확인은 이수성을 교정하는 연구를 위한 강력한 진단과 기초를 제공할 수 있습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 행운을 빕니다.