Name: 기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 배우세요 기간 태반의 태아 막에서 기본 인간 탈피세포를 고립하는 방법을. 이 기술은 고수율과 세포 생존율을 제공하며, 인간 생식 및 임신 합병증 연구에 활용됩니다.

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저자는이 연구에 사용 된 인간의 표본에 대 한 기증자, RCWIH BioBank 마운트 시 나이 병원/UHN 산부인과 부서 및 산부인과 감사 하 고 싶습니다. 우리는 잿 물 실험실, 특히 그녀의 방법 개발에 대 한 박사 캐롤라인 덩크의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 버로우즈 환영 기금 (부여 #1013759)에 의해 지원 됩니다.

Placentae 선택 제왕 섹션을 겪고 노동 여성에 건강 한 용어에서 수집 됩니다. 수집, 처리, 그리고 인간의 샘플의 일회용 마운트 시 나이 병원 윤리 위원회의 지침을 준수 합니다. 서 면된 동의 각 환자에 게 서 얻어진 다. 이 연구는 마운트 시 나이 병원에서 연구 윤리 위원회에 의해 승인 됩니다.
1입니다. 준비
참고: 모든 단계 증기 두건에서 실시 되어야 하 고 모든 수술 장비 통해 압력솥 증기 두건에 배치 하기 전에 소독 해야 합니다. (병, 50 mL 튜브, 등) 다른 모든 자료는 70% 에탄올 용액으로 살 균 해야 합니다. 항상 착용 개인 보호 장비에 항상 유해 쓰레기 (연구실 코트, 장갑, 긴 머리를 다시 묶어, 등)와 함께 작업 하는 경우.
<ol><li>
효소 소화 솔루션 (최종 솔루션: 200 mL)
	<ol>
<li>플라스틱의 HBSS-180 mL / 500 mL 비 커에 살 균 감동적인 자석을 추가 하 고 플레이트 실 온에서 교 반에-.</li>
		<li>밖으로 무게 추가 하 고 다음 HBSS/솔루션에 천천히 순차적으로: 20 mL FBS, 400 mg 콜라 2 ([최종] = 2 mg/mL), 20 mg 간장 콩 트립 신 억제제 ([최종] = 0.1 mg/mL), 30 mg DNase 1 ([최종] = 0.15 mg/mL), 및 200mg BSA ([최종] = 1 mg/mL)</li>
		<li>감동 중간 속도를 설정 하 고 10-20 분 (교 반 하면서 주석 포 일 또는 파라핀 필름 커버) 파문 혼합물 허용.</li>
		<li>플라스틱 퍼 널을 사용 하 여 250 mL 유리 병에 혼합된 솔루션을 부 어 하 고 증기 두건에.</li>
		<li>플라스틱 가기 여과 장치 (0.22 μ m 멤브레인 필터, 500 mL), aliquot 20 mL 50 mL 튜브 (총 10 관) 및 사용까지-20 ° C에서 저장소를 통해 솔루션을 전달 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RPMI 1640 미디어 (세척 솔루션 및 10% 완전 한 성장 매체는 2%)
	<ol>
<li>RPMI 1640와 FBS 증기 두건에서 유리 병에 결합 합니다.</li>
		<li><li><li><li></ol></li><li></ol><ol><li><li><ol><li><li><li> </li></ol></li><li><li> </li></ol><ol><li><li> </li><li><li><ol><li><li></ol></li><li><li><li><li><li></ol><ol><li><li> </li><li><li> </li><li><li><li><li><li><li><li><ol><li><li> </li><li><li><li> <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57443/57443eq1v2.jpg"> </li></ol></li><li> </li></ol>

<ol><li>Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li>
<li>Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+SC+%22Decidualization+and+relevance+to+menstruation%22">Decidualization and relevance to menstruation</a>. , Cambridge University press. 187-212 (1990).</li>
<li>Kariya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+inhibits+in+vitro+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).</li>
<li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).</li>
<li>Wu, W. -X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+decidualization+and+prolactin+mRNA+and+production+at+different+stages+of+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy.</a> Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).</li>
<li>Bell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+secretion+of+protein+by+the+endometrium+and+decidua%5BTitle%5D)+AND+%22Implantation%3A+Biology+and+Clinical+Aspects%22%5BJournal%5D)">Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua.</a> Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).</li>
<li>Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+natural+killer+cells%3A+key+regulators+of+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Decidual natural killer cells: key regulators of placental development.</a> Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).</li>
<li>Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytosis+and+monocytic+infiltration+of+decidua+in+early+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy.</a> Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).</li>
<li>Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+colony-+stimulating+factor-1+in+the+human+uterus+and+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).</li>
<li>Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cachectin%2Ftumor+necrosis+factor-alpha+formation+in+human+decidua.+Potential+role+of+cytokines+in+infection-induced+preterm+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor.</a> Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).</li>
<li>Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+lymphocyte+alloreactivity+by+early+gestational+human+decidua.+II.+Characterization+of+the+suppressor+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms.</a> Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).</li>
<li>Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infiltration+of+myeloid+cells+into+decidua+is+a+critical+early+event+in+the+labour+cascade+and+post-partum+uterine+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).</li>
<li>Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+density+and+pro-inflammatory+cytokine+expression+in+human+fetal+membranes%2C+decidua%2C+cervix+and+myometrium+before+and+during+labour+at+term%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term.</a> Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).</li>
<li>Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+maternal+leukocytes+are+activated+in+response+to+cytokines+secreted+by+uterine+tissues+of+pregnant+women%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women.</a> Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).</li>
<li>Hamilton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+infiltrate+the+human+and+rat+decidua+during+term+and+preterm+labor%3A+evidence+that+decidual+inflammation+precedes+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor.</a> Biology of Reproduction. 86, 39(2011).</li>
<li>Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+infection-induced+preterm+labour%5BTitle%5D)+AND+%22Reprodution+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Cytokines and infection-induced preterm labour.</a> Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).</li>
<li>Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leukocyte+traffic+and+activation+in+parturition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Society+for+Gynecologic+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of leukocyte traffic and activation in parturition.</a> Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).</li>
<li>Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+in+term+and+preterm+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune cells in term and preterm labor.</a> Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).</li>
<li>Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+leukocytes+from+the+human+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).</li>
<li>Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolation+of+cells+from+the+human+fetal-maternal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface.</a> Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).</li>
<li>Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+establishing+primary+human+endometrial+stromal+cells+from+hysterectomy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens.</a> Journal of Visualized experiments. 87, (2014).</li>
<li>Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+derived+from+human+placenta+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue.</a> Journal of Visualized experiments. 112, (2016).</li>
<li>De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+endometrial+epithelial+and+stromal+cells+for+in+vitro+decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization.</a> Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).</li>
<li>Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+and+activation+status+of+maternal+and+peripheral+blood+leukocytes+during+pregnancy+and+labour%2C+both+term+and+preterm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).</li>
</ol>

저자 공개할 게 없다

여기에 설명 된 프로토콜은 비용은 매우 간단 하 기본 decidual 세포를 고립 시키기를 위한 효과적인 방법 전체 인간의 용어 placentae의 태아 세포 막에서 수집 하는 시간을 보여 줍니다. 이 프로토콜의 성공은 두 가지 중요 한 요소, (1) 태아 막 및 (2) 치료는 decidual 세포 프로토콜 통해 처리의 chorion 계층에서 근 근이 살아가고 decidual의 효율에 따라 달라 집니다. 그것은 중요 한 chorion 조직 오염 보장 하 여 아무도 실수로 포함 decidual 된다고 하는 동안 및 식별 하 고 제거 하는 세척 단계 (decidua 및 chorion 형태학에 차이 중 어떤 오염 든 지에 의해 제어 됩니다. 수 수는 decidua와 실수로 수집 될 수 있습니다 있는 chorion의 쉬운 제거를 위한). Decidual 셀은 깨지기 따라서 빠르고 빈번한 pipetting 감소 가능성에 발생할 수 있습니다. 좋습니다, 그럼, 피 펫 배출 속도 설정을 느린 유지 한다 고 최소 pipetting 셀 때 사용...

가장 적극적인 성인 여성 조직 중 하나 endometrium 난소 호르몬, 에스트로겐 (E2)과 황 체 호르몬 (P4)에 의해 자극에 대 한 응답에서 각 생리 주기를 개장 하는 극적인 겪 습. 일컬어 임신 endometrium decidua P4 기반 차별화 E2 지배 증식 단계 결과로 postovulatory 단계의 끝에 의해 형성 되는 매우 중요 한 생식 조직 이다. Decidual 셀 성공적인 blastocyst 이식 한 태아 이식 모성 관용을 유지 하기 위한 utero placental 인터페이스의 개발을 위한 호르몬 요인의 분 비에 대 한 책임이 있습니다.
Decidualization는 주입 및 후속 decidual 나선형 동맥의 리 모델링 필요 합니다. 자궁내 막 기질 세포 decidualization을, P4 및 캠프, 통제 생리 주기1의 후반 luteal 단계를 겪는 다. 이 프로세스는 주위 혈관 및 개장 하는 맥 관 구조에 규제를 밀매 하는 백혈구의 역할을 제안 하는 기질에 걸쳐 확산 시작 됩니다. 이 세포 변환 원형 형태, 증가 핵 크기 및 거친 바인딩과 그물 및 Golgi 기구2의 확장 특징 이다. Decidualized stromal 세포 paracrine 요인 blastocyst 이식 지원 수 있으며 수많은 호르몬 (즉, prolactin), 신생 성장 인자, 인슐린 성장 인자 의무적인 단백질-1의 분 비에 의해 특징 (IGFBP-1), 스타 글란 딘 (PG) E (세포내 캠프의 자극), cytokines, 세포 외 기질 구성 요소 및 태 반 착상 및 개발3,,45,6에 대 한 필수적인 영양소 .
Decidual 셀 인구 decidualized stromal 세포와 전적으로 이루어진 하지 하지만 또한 큰, 임신 특정 decidual 백혈구 인구를 포함 되어 있습니다. Decidualization 과도 지역화 된 부 종 및 자연적인 살인자 (NK) 세포, T 세포, 수지상 세포, 대 식 세포의 유입을 포함 됩니다. 가장 큰 백혈구 부분 모집단은 자 궁 NK 세포, cytokines의 소스는 decidua 및 신생 요인 decidualization 과정에서 원조 하 고 증가 수 있습니다 침투 모든 모성 백혈구의 약 50-70%를 구성 임신7전체 수입니다. 대 식 세포, 면역 세포의 두 번째로 큰 부분 모집단을 되 고 이식 사이트 발견 하 고 임신8증가. Cytokines의 근원 그리고 성장 요소 (CSF-1)9, 종양 괴 사 인자 α (TNFα)10 및 스타 글란 딘을 자극 하는 식민지 같은 요인 (PG) E11.
임신, 내내 그리고 기간 노동 전에 decidua cytokines 및 발산 모성 주변 백혈구 활성화 및 노동 시작 자 궁 조직으로 마이그레이션하기에 대 한 책임의 주요 원천이 다. 동물 연구를 보여주는 수많은 프로 염증 성 cytokines 있습니다 마우스 decidua에 최대 통제 노동, 동안와 같은 TNF-, 일리노이-6, 일리노이-12, IL-1b12. 인간의 decidua에서 프로 염증 성 cytokines 일리노이-1b, 일리노이-6와 IL-8 (주요 호 중구 chemoattractant) 노동13에 비해 노동 하는 동안 더 높은 식 전시. 이러한 decidual 조직14;으로 활성화 및 백혈구의 유입에서 cytokines 결과 분 비 myometrial 4-fold, 가 두 인접 한 자 궁 조직 사이 활성화의 나타내는 더 큰 앞 decidual 침투 기간 노동, 동안 decidual 대 식 세포와 두 인간 호 중구 침투와 쥐에서 증가 볼 15. 백혈구 침투 이러한 PGs myometrium16의 동기 수축 활성화의 생산, 매트릭스 metalloproteinases (MMPs) 막 시작17,18, 파열 뿐만 아니라 증폭 자 궁 활성화 과정 ('cytokine 폭풍우') 프로 염증 성 cytokines.
Decidual 세포 이식 과정, 초기 임신 기간에 노동의 활성화에 참여 하는 고에 산 모-신생아 공차를 유지에 중요 한 역할을 하는 등의 많은 중요 한 기능으로 인해 다른 병 리 중 발생할 수 있는 임신입니다. 예를 들어, 회귀 이식 실패와 반복 임신 손실 (1) 불 임; decidual 성숙의 오류 로부터 발생할 수 있습니다. (2) 자궁내 성장 금지 (IUGR)과 부적 절 한 개발 및 부전 decidua/태 반 또는; decidual myometrial에 손상 된 혈관 변환의 자간 전 증 (3) 조산 뿐만 아니라 있는 조기 decidual 활성화에서 발생할 수 있습니다.
이러한 주요 질환, 인간 생체 내에 연구의 윤리적이 고 실질적인 제한 함께 비추어 이해의 목적으로 생체 외에서 분석을 위해 필수적 이다 기본 인간 decidual 세포 라인을 설립 하 고 임신 합병증의 임상 관리를 개선. 따라서, 우리의 연구의 목적은 높은 셀 생산량 및 생존 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집 된 인간의 기본 decidual 셀의 격리에 대 한 허용 하는 프로토콜을 개발 했다. 이 현재 프로토콜 명확 하 게 설명 합니다 시간 및 비용 effective 메서드는 세포 decidual의 특정 하위의 분리에 대 한 생체 외에서 분석의 다양 한 사용 될. 풍부의 특성화 및 기간과 비교를 첫 번째 또는 두 번째 임신에서 decidual 부분 모집단의 표현 형 인간의 임신 기간 내내 그들의 역할을 정의 하는 데 중요 하다.

<table><tbody><tr><td>행크' 칼슘과 마그네슘이 함유된 균형 잡힌 소금 용액</td><td>시설에서 준비(LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank' 칼슘과 마그네슘이 없는 균형 잡힌 소금 용액</td><td>시설에서 준비 (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>기저귀 패드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>대형 수술 용 가위</td><td>AL Medical</td><td>2018-12-20.</td><td></td></tr><tr><td>대형 수술 겸자</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 일회용 셀 스크레이퍼(25cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>250mm(크기 60메쉬) 금속 체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1020-5EA</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 손잡이가 있는 일회용 메스(#21)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>멸균 플라스틱 페트리 접시(직경 10cm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>멸균 검체 용기 (소변 컵, 4.5 oz)</td><td>VWR</td><td>25384-146</td><td></td></tr><tr><td>나일론 필터 (70 mm)</td><td>VWR/Corning</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>Qiagen</td><td>79217</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% 용액</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배양 매체</td><td>Invitrogen</td><td>11835-055</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Normocin (50mg/mL)</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL)</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 2, 동결 건조 분말</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>대두 트립신 억제제, 분말</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003-250mg</td><td></td></tr><tr><td>DNase 분말</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA 분말)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>스피닝 디스크 컨포칼 현미경 - Leica DMI 6000B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미징 유세포 분석기 - Image Stream MK2</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEA 소프트웨어</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC 복합 Vimentin 항체</td><td>R& D Systems</td><td>IC2105A</td><td></td></tr><tr><td>APC H7-conjugated CD45 항체</td><td>BD</td><td>641399</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated Cytokeratin 항체</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-080-101</td><td></td></tr><tr><td>PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody</td><td>Novus</td><td>NBP2-47941PCP</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450 Fixable Viability dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin 1차 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7558</td><td></td></tr><tr><td>CD45 1차 항체</td><td>Dako</td><td>M0701</td><td></td></tr><tr><td>사이토케라틴 1차 항체</td><td>Dako</td><td>M0821</td><td></td></tr><tr><td>사이토케라틴 7 1차 항체</td><td>Dako</td><td>M7018</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>염소 IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2028</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 2차 항체</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11058</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

기간 placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 decidual 세포의 고립

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Decidua, 일컬어 임신 endometrium, 비판적으로 중요 한 생식 조직 이다. Decidualized stromal 세포와 면역 세포의 주로 구성 decidual 세포는 호르몬 및 염증 성 요소는 성공적인 blastocyst 주입, placental 개발에 대 한 중요 한 역할의 분 비에 대 한 책임은 용어 및 preterm 노동의 개시입니다. 많은 임신 합병증은 다른 세포 인구 decidua 구성의 정밀한 균형의 물결에서 발생할 수 있습니다. 특정 decidual 세포 유형의 비율 변경 수 있습니다 이러한 중요 한 프로세스를 방해 하 고 배아 이식 실패, 자궁내 성장 제한, 자간 전 증 임신의 심각한 합병증 개발의 위험을 증가 하 고 preterm 노동입니다. 여기에 설명 된 프로토콜 비용 및 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 효과적인 방법 용어 placentae의 태아 세포 막에서 수집 하는 시간을 보여 줍니다. 결합 하 여 효소 소화와 부드러운 기계적 장애 decidual 조직, 고수익 decidual 셀 chorion 오염 거의 없이 함께 얻은 것입니다. 중요 한 것은, 격리 decidual 셀 특징 이었다 (stromal 세포 (55-60%), 백혈구 (35%), trophoblast (0.01%) 세포 또는 상피 (1%)) 유지 높은 생존 능력 (80%)는 멀티 컬러 이미징 흐름 cytometry 분석 결과 의해 확인 되었다. 이 프로토콜에 decidua parietalis 이며 첫 번째 및 두 번째 임신 placentae을 적용할 수 있습니다. 절연, 일단 decidual 세포는 다양 한 임신 합병증에 다른 decidual 셀 부분 모집단의 역할을 이해 하는 것을 목표로 하는 실험적인 응용 프로그램에 대 한 사용할 수 있습니다.

효율성과 격리 된 셀의 유효성을 검사, 그들은 두 가지 방법으로 특징 했다: cytometry와 immunocytochemistry (ICC). 4 세포 인구를 표적으로 했다; 팬 백혈구 마커 CD45 decidual 면역 세포를 식별 하는 데 사용 되었다, cytokeratin 상피/내 피 세포를 감지 하는 데 사용 했다 및 cytokeratin 7 어떤 감지 하는 데 사용 되었다 마지막으로, decidualized stromal 세포 안티 vimentin 항 체에 의해 발견 된 잠재적인 trophoblast (chorion 또는 placental) 오염.
멀티 컬러 이미징 cytometry에 의해 특성화에 대 한 갓 격리 decidual 세포는 세포 생존 능력을 결정 하는 고칠 수 염료와 스테인드 했다. 셀 permeabilized 및 고정, vimentin ...

이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할 연구

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

이 세포 분리 프로토콜의 전반적인 목표는 수율이 높은 말단 세포 생존율을 가진 1차 탈피 세포를 분리하는 방법을 개발하는 것입니다. 이 방법은 배반포 이식 및 분만 시작에서 낙엽의 역할과 같은 인간 생식 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 다양한 임신 관련 병리학에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 높은 생존 말단 수율을 가진 1차 탈피 세포의 분리를 위한 시간 및 비용 효율적인 방법을 제공한다는 것입니다. 먼저 랙에 50ml 튜브 5개를 놓고 흄 후드에 HBSS 및 HBSS 2병을 그대로 둡니다. 그런 다음 적절하게 라벨링된 튜브에 25ml의 HBSS를 피펫팅합니다.다음으로, 흄 후드에 겹쳐진 기저귀를 놓습니다. 그런 다음 용기에서 태반이라는 용어를 꺼내 흄 후드에 넣습니다. 기저귀 패드에 태반을 모체 쪽이 위로 향하게 하여 놓습니다.태반이 모계 쪽이 아래를 향하고 있으면 추가 기저귀를 사용하여 태반을 뒤집습니다. 멤브레인이 파열된 지점을 찾고 가위와 집게를 사용하여 절개하여 멤브레인이 펼쳐지고 흄 후드 표면에 평평하게 놓일 수 있도록 합니다. 그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 융모막에서 탈락 조직을 부드럽게 긁어냅니다.조직을 25ml의 HBSS가 들어 있는 50ml 튜브로 옮기십시오.이 혈전에도 일부 탈피 세포가 포함되어 있으므로 작은 혈전도 수집해야 합니다. 50ml 튜브를 부드럽게 흔들어 수집된 조직을 씻은 다음 250마이크로미터 금속 체에 조직을 통과시킵니다. HBSS로 세척 과정을 두 번 반복한 다음 새 튜브에서 HBSS로 두 번 세척합니다.융모막 오염은 실 모양과 밝은 색상으로 인해 쉽게 볼 수 있으며 세척 후 제거할 수 있습니다. 세척 후 20ml의 효소 분해 용액이 들어 있는 멸균 50ml 튜브에 조직을 넣어 전체 텀 태아 막에서 얻은 전체 decidua를 소화합니다. 파라핀 필름을 사용하여 튜브의 캡을 밀봉하십시오.그런 다음 섭씨 37도의 흔들리는 수조에서 튜브를 배양합니다. 타이머를 20분으로 설정합니다. 배양이 끝나면 파라핀 필름을 제거합니다.70% 에탄올을 사용하여 소화된 조직이 포함된 튜브의 표면을 살균하고 흄 후드 아래에 놓습니다. 튜브를 짧게 흔듭니다. 다음으로, 금속 체를 통해 세포 현탁액을 새로운 멸균 표본 용기에 통과시킵니다.효소 반응을 중단하기 위해 세포 현탁액을 동일한 부피의 배양 배지로 희석합니다. 세포 현탁액을 새 50ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 420G에서 섭씨 4도에서 11분 동안 세포를 원심분리합니다.필요한 경우 나머지 소화되지 않은 조직을 20ml의 신선한 효소 분해 용액이 들어 있는 새 50ml 튜브에 넣고 분해 과정을 반복합니다. 두 번째로 분해를 수행하는 경우 세포 현탁액이 있는 첫 번째 튜브를 얼음 위에 두십시오. 두 번째 분해가 완료되면 두 세포 현탁액을 결합합니다.원심분리 후 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 상층액을 제거하기 위해 수동 피펫이 필요할 수 있습니다. 그런 다음 세척 버퍼에 셀 펠릿을 다시 매달아 놓습니다.세포를 세척한 후 원심분리 과정을 반복합니다. 원심분리 과정이 끝나면 상층액을 흡인하고 세포 펠릿을 5ml의 세척 완충액과 35ml의 적혈구 용해 완충액에 다시 현탁시킵니다. 적혈구를 용해시키기 위해서는 배양의 시작과 끝에서 튜브를 잠시 와류로 만듭니다.그런 다음 세포 현탁액을 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후 원심분리 과정을 반복합니다. 원심분리 후 상층액을 흡인하고 펠릿을 40ml의 세척 완충액에 다시 현탁시킨 다음 세포를 70마이크로미터 나일론 필터에 통과시켜 세포 덩어리를 배제합니다.원심분리 과정을 반복합니다. 원심분리가 완료되면 상층액을 흡입합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 10 밀리리터의 배양 배지에 다시 현탁시킵니다.Trypan blue 염료 배제 방법을 사용하여 혈구계로 세포 수를 계산합니다. 탈피세포 집단의 세포 유형 구성을 결정하기 위해 multi-color imaging 유세포 분석 게이팅 전략이 개발되었습니다. 이 분석은 연속 게이팅을 사용하여 세포 이중선과 세포 파편을 배제하는 것을 보여줍니다.파편이 없는 단일 세포 집단이 얻어지면 고정 생존도 염료를 사용하여 세포 생존율을 측정합니다. 이 분석은 블루 게이팅으로 표시된 총 탈피 세포 집단의 80% 생존 가능성을 보여줍니다. 다음으로, 분리된 탈피 세포를 형광단 접합 마우스 단클론 항체로 염색합니다.이는 기질, 면역, 상피 및 영양막 세포 마커의 존재와 생존 염료를 분석하기 위한 것입니다. 이 마커는 탈락한 세포 유형을 결정합니다. 유세포 분석 형광 이미지는 4가지 마커와 생존도 염료 모두에 대해 양성 염색된 세포를 보여줍니다.그런 다음 이러한 마커를 사용하여 탈피 세포 집단에서 각 세포 유형의 백분율을 결정합니다. 흥미롭게도, Vimentin 양성 기질 세포가 가장 많은 세포 집단을 구성하는 반면, 영양막 세포는 거의 없습니다. 이러한 결과는 분리된 1차 인간 탈피 세포의 순도와 높은 생존력을 보여줍니다.여기서, 얻어진 점도표는 positive cell type population에 대한 게이팅을 보여줍니다. Fluorescent minus one control은 true positive decidual cell population을 정확하게 게이트하는 데 사용됩니다. 다음으로, 캡처된 회전 디스크 컨포칼 현미경 이미지를 사용하여 탈피 세포 집단이 주로 영양막 세포 오염이 없는 Vimentin 양성 기질 세포로 구성되어 있음을 보여줌으로써 유세포 분석 결과를 검증합니다.이 기술을 숙달하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 탈피 세포를 다양한 방법으로 분석하여 유전자 및 단백질 발현을 검사할 수 있으며, 이는 임신 합병증에서 발생하는 세포 변화를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 개발하는 동안 중요한 조혈 기관으로 태반을 확인했습니다. 우리는 조혈 줄기 세포 (HSCs)이 생성되는 독특한 microenvironmental 틈새의 태반에서 확장 둘 발견했습니다. 여기, 우리는 마우스 태반에 HSCs의 격리 및 시각화에 필요한 실험 기법을 설명합니다.

태반에서 조혈 줄기 세포의 분리 및 분석

이 프로토콜에서는, 우리는 Percoll 기울기를 사용하여 trophoblast 세포의 분리에 이어 임신 d10.5에 마우스에서 placentae의 절개를 설명합니다. 우리는 matrigel의 침공 분석에서 분리 된 세포의 사용을 보여줍니다.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

1)에서 세포 지질 방울을 분리 효모 세포, 2) 인간의 태반이 제시하는 두 가지 기술. 두 절차의 핵심은 방울을 함유하는 생성 된 부동 층은 쉽게 눈에 의해 시각을 추출하고, 순도에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 정량화 될 수있는 밀도 구배 원심 분리된다.

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

우리는 현행 cGMP(Good Manufacturing Practices) 지침에 따라 동물성 제품이 없는 시약을 사용하여 인간 양막 상피 세포(hAEC)를 분리하고 배양하는 프로토콜을 설명합니다.

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

본원에 설명된 것은 인간 모체-태아 계면(human maternal-fetal interface)인 decidua basalis와 decidua parietalis의 침투 백혈구를 분리하고 추가로 연구하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 세포 표면 마커의 무결성을 유지하고 유세포 분석 분석으로 입증된 바와 같이 다운스트림 응용 분야에 충분한 생존 세포를 생성합니다.

인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 분리

본 명세서는 마우스의 모체-태아 계면(자궁, 십후 및 태반)에서 조직의 침투하는 백혈구를 분리하고 분석하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 대부분의 세포 표면 마커의 무결성을 유지하고 유세포 분석을 포함한 다운스트림 응용 분야에 충분한 생존 가능한 세포를 생성합니다.

산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

이 프로토콜은 효과적으로 격리 갓 인간 융모 cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 감염 microporation을 사용하여 이들 세포의 DNA 단백질 복합체를 식별하는 방법을 설명한다. 형질 감염된 세포는 웨스턴 블롯에 의해 모니터링 될 수 있고, EMSA는 4 일간의 배양 기간 동안 분석한다.

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

여기에서 우리는 고립과이 조직에서 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)의 확장 다음에 인간의 장기 태반에서 태아와 모체 조직의 절개 방법을 설명합니다.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

이 원고는 저산소증/재산소화 하에서 배양된 면역정제된 인간 융모 세포영양아세포 세포의 독특한 체외 모델을 제시합니다. 이 모델은 멜라토닌과 같은 유망한 치료법이 산화 스트레스 증가 및 태반 기능 변화와 관련된 임신 합병증에 대한 보호 효과를 연구하는 데 적합합니다.

인간의 기본 영양막 세포 멜라토닌에 대해 저산소증의 보호 효과를 연구하기 위해 세포 배양 모델 / 재산 소화에 의한 혼란

이 연구는 분리와 decidualization 분석 결과 생체 외에서 실시 하 인간의 자궁내 막 기질 세포의 문화에 대 한 검증 및 최적화 절차를 선물 한다. 또한,이 연구를 효율적으로 최저의 자세한 방법을 siRNAs를 사용 하 여 인간의 자궁내 막 기질 세포에서 특정 유전자를 제공 한다.

생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

이 프로토콜은 인간 기저 배반의 소추모 및 융모막에서 1차 HLA-G+ 외 영양층(EVT)의 정제, 특성 분석 및 배양을 가능하게 합니다. 1차 EVT 배양은 96시간 동안 생존 가능성을 유지하여, 샘플이 일치한 모체 면역세포와의 공동 배양과 이들의 상호작용에 대한 유동 세포 및 분자 분석을 가능하게 합니다.

표현형 및 기능 분석을 위한 HLA-G+ 외 영양층 정제 인간 임기 태반 조직에서

배우세요 기간 태반의 태아 막에서 기본 인간 탈피세포를 고립하는 방법을. 이 기술은 고수율과 세포 생존율을 제공하며, 인간 생식 및 임신 합병증 연구에 활용됩니다.

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

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