Name: 방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 배우세요 Pseudomonas aeruginosa 감염 후 폐 내피 세포에서 세포독성 아밀로이드를 생성하고 분석하는 방법을. 이 단순하고 신뢰할 수 있는 프로토콜은 생체 내외 모델 모두에 적용 가능합니다.

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이 연구는 NIH 교부 금 HL66299 TS, RB, 및 SL, TS에 HL60024 및 HL136869 mf에 의해 부품에 투자 되었다.

모든 동물 절차 검토 했다 기관 동물 관리 위원회의는 남쪽 알라바 마의 대학에 의해 승인 하 고 모든 연방, 주, 및 현지 규정에 따라 수행 했다. 쥐 폐 microvascular 내 피 세포 (PMVECs)의 기본 문화 폐 생물학의 사우스 알라바 마 대학의 센터에서 셀 문화 핵심 시설에서 얻은 했다. 셀 앞에서 설명한 절차16를 사용 하 여 준비 되었다.
1입니다. 세포 독성 Supernatants의 세대
참고: 여기, 우리가 피 녹 농 균의 두 가지 변종이 사용: PA103 그대로 유형 III 분 비 시스템이 감염, 및 ∆PcrV는 유형 III 분 비 체계 부족 하는 동안 대상 셀에 ExoU 및 ExoT exoenzymes를 전송할 수 있는 접종을 다음 대상 셀에 exoenzymes 전송의 능력이.
<ol><li>보 글 보 너 (VB) 한 천 격판덮개17 에 박테리아를 행진 하 고 37 ° c.에 하룻밤 성장<ol>
<li>접시를 준비 하려면 확인 다음 재고 솔루션 (보 글 보 너 염; 10 x 주식): 2 세대 MgSO4, 20 g 구 연산 (자유로운 산), 100 g K2포4및 35 g NaH2포4측정. 1 L와 느린 배기 15 분 압력솥 ddH2O를 추가 합니다.</li>
		<li>450 mL ddH2O 한 천 7.5 g와 압력솥 위와 같이 배치 합니다.</li>
		<li>압력가 마로 소독, 다음 두 솔루션을 50 ° C 물 목욕으로 놓습니다.</li>
		<li>천 하 10 x VB 재고 소금 솔루션 50 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>400 µ g/l (사용 중인 피 녹 농 균 의 변종)에 carbenicillin를 추가 하 고 플라스 크를 소용돌이로 잘 섞어.</li>
		<li>장소 5 mL 개별 멸 균 문화 요리에 VB agar 솔루션의 응고, 및 다음 세균성 시드의 날 때까지 4 ° C에서 저장 한을 수 있습니다.</li>
		<li>세균성 시드 날, 미리 37 ° C에 접시를 따뜻하게 하 고 메 마른 루프를 사용 하 여 격판덮개에 박테리아를 행진 합니다. 장소는 37 ° C 배양 기에서 접시 하룻밤.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 Griffonia simplicifolia 와 긍정적인 얼룩에 의해 PMVEC 순도 확인 lectin 및 형광으로 부정적인 얼룩이 지기 나선 pomatia lectin (동맥 내 피 세포에 대 한 표식). Aliquot 세포와 동결에 액체 질소입니다.</li>
	<li>실험, 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 10% 태아 둔감 한 혈 청, 보충을 유지 하 고 5% CO2를 포함 하는 37 ° C 배양 기에서 세포 성장. 세포를 사용 하 여 구절 5-15에서.<ol>
<li>세포 독성 supernatants의 생성, 2 x 106 셀 개별 150 cm 요리에 접시 및 합류 달성 될 때까지 3-4 일에 대 한 성장. 실험 (아래 참조) 당 두 접시를 사용 합니다.</li>
		<li>세포 독성 supernatants의 분석, 대 한 6-잘의 개별 우물으로 플레이트 1 x 105 셀 접시 하 고 4 일 합류 달성 될 때까지 성장 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>상쾌한 생산, 세척 단계 1.3.1 인산 염 버퍼 염 분에서에서 PMVECs의 두 150 cm 요리 중 하나, trypsinize, 및 다음 셀 계산 (우리는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라; 테이블의 자료를 참조). PMVECs와 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 다른 접시를 세척 하 고 중 긴장 20: 1의 감염 (MOI)의 다양성에 피 녹 농 균 의 감염. 이것은 다음과 같이 얻을 수 있습니다:<ol>
<li>P. 녹 농 균,540 0.25 = 2 x 108 CFUs/mL 명이. 이 희석을 준비 하려면 1 mL HBSS 1 mL 일회용 cuvette을 추가 합니다. 0.25의 OD540 는 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 하는 때 달성 될 때까지 단계 1.1에서에서 준비 된 접시의 충분 한 박테리아를 다쳤어요. 다음 단계는 박테리아를 필요 합니다 얼마나 많은 계산을 제공할 것입니다.</li>
		<li>문화 접시에 있는 PMVECs의 수 결정 되 면 (1.4 위의 단계), 박테리아는 PMVECs를 포함 하는 두 번째, 비 trypsinized 문화 접시에 추가 수 수 확인. 예를 들어 결정 되는 PMVECs의 문화 접시 107 셀 x 1.3를 포함 다음 준비 107 셀 x 20 박테리아/셀 x 1 mL/2 x 108 CFUs x 1.3 = 1.3 mL 박테리아.</li>
		<li>희석 박테리아의 1.3 mL HBSS로 20 mL의 최종 볼륨을 150 cm 접시의 전체 표면 액체, 커버 될 수 있다 다음 PMVECs의 접시에 희석된 박테리아를 추가.</li>
		<li>PMVECs 간격 셀 단층에 형성 하는 접시를 현미경으로 관찰 하면 볼 수 있습니다 때까지 4-5 시간, 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 박테리아와 주사 (참조 그림 1 갭 형성의 적절 한 수준에 대 한)를 품 어.</li>
		<li>상쾌한, 수집 다음 세포 파편을 제거 하는 탁상 원심 분리기에서 2000 x g에서 10 분 원심. 참고: 모든 탁상용 원심 분리기 생성 충분 한 g 수 강제 작은 unlysed 세포와 큰 세포 파편이이 단계에 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>박테리아를 제거 하는 필터에 통과 상쾌한 다음 그것의 끝에 연결 된 0.2 µ m 필터 주사기에는 상쾌한 하 거 라.</li>
		<li>메 마른 상쾌한의 약 수를 사용 하 여 세포 독성 시험 (2.1 참조) 나중에 사용-80 ° C에서 상쾌한의 나머지 부분을 고정 하 고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 세포 독성 Supernatants의 분석
<ol><li>세포 독성 분석 실험<ol>
<li>6 잘 요리에서 PMVECs 합류까지 성장. 워시 우물 한번 HBSS, 다음 추가할 필터 소독 상쾌한 (어느 PA103 또는 ∆PcrV 주사 셀에서 수집)의 1.5 mL 개별 웰 스. 부정적인 통제로 또 다른 우물을 메 마른 HBSS를 추가 합니다.</li>
		<li>21-24 h에 대 한 CO2 인큐베이터에 접시에 놓은 다음 셀 살인/세포 독성에 대 한 관찰 (다음 단계 참조). 추가 실험에 대 한 세포 독성을 전시 supernatants 사용 하 고 그 셀 죽이 표시 되지 않는 삭제.</li>
		<li>셀 죽의 정량<ol>
<li>상용 LDH 시험 키트와 제조 업체의 사용 하 여 죽은 세포에서 측정 젖 산 효소 (LDH) 릴리스 절차를 권장 합니다.</li>
			<li>또는, 계량 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 현미경으로 세포 살해. 이 위해, 미세한 이미지와 그대로 셀을 포함 하는 문화 접시의 영역 기록 다음 셀 (지표는 단층에 세포 죽음의) 부족 한 영역을 계량 사용자 지정 ImageJ (국립 보건원) 매크로 (참조 보충 코딩 파일을 사용 하 여 ). 원하는 경우 매크로 단계 다음과 같이 수동으로 수행:<ol>
<li>매크로에 이미지 (RGB 또는 Tiff 형식)을 입력 하 고 15% 포화 픽셀 대비를 조정 합니다. 대비 조정 이미지를 복제 하 보기의 필드 내에서 세포와 간격 영역의 높은 콘트라스트 이미지를 "배경 빼기" 명령을 수행 합니다.</li>
				<li>이 이미지는 원래 이미지에서 빼기 하 고 이미지 계산기 "AND" 함수를 사용 하 여 원본 이미지와 결과 이미지를 결합. 블랙 (간격) 및 임계값 기능 (최소 0, 최대 5 개), 화이트 (셀) 마스크 결과 이미지를 변환 하 고 "이진 침식" 함수를 사용 하 여 이미지에서 노이즈를 제거.</li>
				<li>"지역 분수" 측정을 사용 하 여 결과 이미지에서 흰색 픽셀을 검정의 비율을 측정 합니다. 줄거리와 각 치료 시간에 대 한 익스프레스 소수 지역 최대 간격 영역의 % 포인트.</li>
				<li>계산 방법 및 Tukey의 포스트 hoc 테스트, p 값이 0.05 중요 하 게 고려 보다 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 비교 합니다.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>문화 supernatants에 아 밀 로이드, oligomeric 타우, 및 Aβ의 존재를 확립 immunoblot 분석을 사용 합니다. Immunoblot 분석 표준 절차10,11,12, 전기 이동 법 전에 적어도 10 문화 supernatants 집중 제외를 사용 하 여 수행 합니다.<ol>
<li>상쾌한 집중, 상쾌한의 1-2 mL 인 막 10 kDa의 분자량 컷오프는 원심 필터 단위에 배치 합니다. 그런 다음 필터 단위 배치 탁상용 원심 분리기 및 원심 분리기 2000 x g 필요한 정도의 농도가 될 때까지 (보통 45-60 분)를 달성.</li>
			<li>집중 되어 표면에 뜨는11 에서 단백질의 양을 결정 하 고 젤의 개별 우물으로 동일한 양의 샘플을 로드 합니다.</li>
			<li>니트로, 단백질 전송 다음 A11 안티 아 밀 로이드 항 체, T22 안티 oligomeric 타우 항 체, 또는 뒤에 적절 한 2 차 항 체는 MOAB2 안티-Aβ 항 체도 말 프로브 젤을 실행 합니다. 개발 표준 화학 절차를 사용 하 여도 말.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Thioflavin T 시험을 하기 위해 계량 supernatants에서 amyloids thioflavin T 형광 (ThT)를 사용 합니다. 이러한 측정 supernatants 살 균 하는 필터를 사용 합니다.<ol>
<li>10 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)로 8 mg thioflavin T (ThT)를 일시 중단 하 여 재고 솔루션 (50 x) thioflavin T 준비 합니다. 혼합 후, 0.22 μ m 필터 입자 제거를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
			<li>측정을 위해 1 mL 분 광 광도 계 베트에 PBS의 1 mL를 ThT 주식의 20 µ L를 추가 합니다. 장소는 spectrofluorimeter로 희석된 샘플입니다.</li>
			<li>측정 기준 형광 방출 425 nm 여기를 사용 하 여 및 2 nm 단위로 450-575 nm에서 형광 방출 스캔 합니다.</li>
			<li>425 nm 여기를 사용 하 여 시간 경과 검사 수행 및 482 nm 방출, 데이터 취득 모든 0.2의 60에 대 한 s.</li>
			<li>초기 20 시간 경과 검사의 측정 빈 베트에 형광. 20 s, 검사를 일시 중지 하 고는 베트에 필터 살 균 상쾌한의 10 µ L를 추가. 반전으로는 베트를 혼합 하 고는 spectrofluorimeter로 다시 다음 장소.</li>
			<li>최종 40 획득 시간을 기준으로 검색을 다시 시작 데이터의 s.</li>
			<li>완료 되 면 시간 경과 스캔, 2.1.5.3에 같이 동일한 설정을 사용 하 여 최종 형광 방출 스펙트럼 스캔을 수행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pneumonia+really+the+old+man%27s+friend%3F+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li>
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<li>Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y+is+a+promiscuous+cyclase+that+increases+endothelial+tau+phosphorylation+and+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability.</a> J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).</li>
<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343(2013).</li>
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<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible%2C+cytotoxic+prion+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li>
<li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Molec+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li>
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<li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li>
<li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li>
</ol>

보고서에 없음입니다.

여기 방법 간단한 체 외에 유기 체를 일으키는 폐 렴으로 감염 시 세포 독성 amyloids의 세대의 데모를 허용 하는 설명 되어 있습니다. 이러한 방법에는 세포 배양 세포 독성 분석 실험, immunoblotting, 소설 현미경 방법 및 ThT 바인딩을 사용 하 여 죽이 세포의 정량 포함 됩니다. 그들은 자연 (그림 2 및 그림 4)에서 아 밀 로이드 이며 전시 프리온12의 특성 세포 독성 대리인의 분석은 설명 했다. 폐 렴 중 세포 독성 프리온 분자의 세대에 그들의 병원 방전에 따라 폐 렴 생존자에서 높은 사망률에 대 한 잠재적인 설명을 제공 한다. 실험 진행 중에는이 가능성을 테스트 합니다.
기술된 연구의 모든 주요 이벤트의 세포 독성 상쾌한 세대 이며 두 가지 중요 한 변수...

폐 렴 생존 하는 환자의 병원 방전1,을 따르는 달에서 사망률 높은2,,34,,56. 대부분의 경우, 죽음은 치기5,6뿐만 아니라 최종 기관 실패 신장, 폐, 심장, 또는 간 이벤트의 어떤 종류에 의해 발생 합니다. 이 환자 인구에 있는 높은 사망 율을 위한 이유는 결코 설립 되었습니다.
폐 렴으로 인수 되 고 중 커뮤니티-분류 또는 병원 인수 (nosocomial), 그리고 폐 렴을 일으킬 수 있는 에이전트 포함 박테리아, 바이러스, 버섯, 그리고 화학 제품. 병원내 폐 렴의 주요 원인 중 하나는 녹 농 균박테리아입니다. P. 농 균 exoenzymes 대상 셀7,8의 세포질에 직접 되 나 다양 한 이펙터 분자 전송 유형 III 분 비 시스템을 사용 하는 그램 음성 유기 체 이다. 폐 내 피 세포의 감염, 동안에 exoenzymes 대상 microtubule 관련 단백질 타우9,,1011,12의 내 피 형태를 포함 하 여 다양 한 세포내 단백질 , 폐 기능 그리고, 때때로, 죽음 감소 심각한 폐 부 증의 결과로 내 피 장벽 붕괴에 지도.
앞에서 설명 했 듯이, 초기 폐 렴을 생존 하는 환자의 병원 방전에 따라 첫 12 개월에 사망률 높은 있다. 이 현상을 설명 하는 잠재적인 메커니즘은 빈약한 장기 결과 리드 초기 감염 시 생성 되는 장 독 소의 일부 형식을. 두 가지 관찰이이 가능성을 지원합니다. 첫째, 교양 폐 내 피 세포 처음 P. 농 균 으로 취급 되는 박테리아는 항생제13에 의해 사망 후 주일 대에 실패 합니다. 둘째, 수명이 긴 prions 및 에이전트 프리온 특성을 가진 다양 한 인간과 동물 질환, 신 경계14,15와 관련 된 질병 특히 입증 되었습니다.
폐 감염 시 수명이 긴 세포 독성 대리인의 잠재적인 생산을 조사 하기 위한 방법 적 설명 했습니다. 일련의 간단한 체 외에서 분석 설명 되어 있습니다 여기 cytotoxin 생산 및 사용 하는 일반적인 폐 렴 원인이 에이전트, P. 녹 농 균감염 다음 활동 조사를 위해 사용할 수 있습니다. 이 분석 실험 조사 가능한 cytotoxin 유도 감염 원인이 폐 렴, 다른 에이전트를 사용 하 여 다음에 쉽게 적응할 수 있어야 하 고 또한 생성 된 supernatants 전체에서 cytotoxins의 효과 조사 하는 데 유용 해야 기관 또는 동물입니다. 마지막으로,는 여기에 설명 된 가능성이 가장 분석 실험 동물 및 인간의 생물 학적 체액 폐 렴 중 cytotoxins의 생산을 위한 테스트에 적응할 수 있을 것입니다.

<table><tbody><tr><td>토끼 항 베타 아밀로이드</td><td>Thermo</td><td>71-5800</td><td></td></tr><tr><td>A11 아밀로이드 올리고머 항체</td><td>StressMarq</td><td>SPC-506D</td><td></td></tr><tr><td>T22 안티 타우 올리고머 항체</td><td>EMD Millipore</td><td>ABN454</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.22 미크론 주사기 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HRP 염소 안티 토끼 IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721-1</td><td></td></tr><tr><td>균주 PA103 및 &Delta; PcrV</td><td></td><td></td><td>녹농균의 이러한 균주는 Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td></tr>, <tr><td>FITC, Griffonia lectin,</td><td>Sigma Aldrich</td>, <td>L9381</td><td></td></tr>, <tr><td>TRITC Helix pomatia lectin,</td><td>Sigma Aldrich</td>, <td>L1261</td><td></td></tr>, <tr><td>Agar</td>, <td>Fisher</td>, <td>BP1423-500</td><td></td></tr>, <tr><td>0.22 micron nitrocellulose</td><td>BioRad</td>, <td>162-0112</td><td>에서 수득하였다.</td></tr><tr><td>유형 2 콜라겐 분해 효소</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Fetal 소 세럼</td><td>Hyclone</td><td>SH30898.03IH</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin Disodium salt</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>795496-500G</td><td></td></tr><tr><td>인산마그네슘 헵타하이드레이트</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP021914221</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>G Biosciences</td><td>50-103-5801</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트</td><td>시그마</td><td>S9506-500G</td><td></td></tr><tr><td>백작 자동화 세포 계수기</td><td>Invitrogen</td><td>C10277</td><td></td></tr></tbody></table>

방법 감지 세포 독성 amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

누가 살아남을 폐 렴 환자 병원 방전을 따르는 달에서 사망률 높은 있다. 그것은 폐 렴 중 폐 조직의 감염 이후의 끝 기관 실패를 이끌어 낼 수 있는 오래 된 cytotoxins의 생산에 결과 가설 되었습니다. 생체 외에서 분석 실험 폐 감염 시 cytotoxins 생산 가설 테스트를 개발 했습니다. 고립 된 쥐 폐 동맥 내 피 세포 및 박테리아 녹 농 균 모델 시스템으로 사용 되 고 cytoxins 내 피 세포의 감염 박테리아에 의해 다음의 생산 세포 배양 뒤를 사용 하 여 설명 된다 젖 산 효소 분석 실험 및 ImageJ 기술을 활용 하 여 새로운 미세한 메서드를 사용 하 여 직접 정량. 이러한 cytotoxins의 녹말 체 자연 및 immunoblotting 및 A11 안티 아 밀 로이드 항 체를 사용 하 여 immunodepletion thioflavin T 바인딩 분석 실험에 의해 입증 되었다. Immunoblotting를 사용 하 여 추가 분석 oligomeric 타우와 Aβ 생산 했 고 피 녹 농 균에 의해 감염에 따라 내 피 세포에 의해 발표는 설명 했다. 이러한 방법은 인간의 임상 샘플의 분석에 쉽게 적응할 수 있어야 합니다.

간단한 생체 외에서 시험 셀 박테리아 P. 녹 농 균감염의 supernatants에 cytotoxins의 존재에 대 한 분석 결과를 개발 되었습니다. 기본적으로, 감염 된 세포에서 배양 후 세균 또한 4 h 수집, 박테리아의 표면에 뜨는, 문화 살 균 필터에 의해 제거 되 고 살 균 상쾌한 셀의 새로운 인구에 추가 됩니다. 셀은 다음 상쾌한의 추가 후에 21-24 h를 관찰 하 고 셀 죽이 정량.
PMVECs의 confluent 레이어에 P. 녹 농 균 의 추가 셀 사이 간격의 형성을 유도합니다. Vivo에서, 갭 형성 폐부종과 폐 기능 감소에 지도 한다. 분석 결과 설명된에서 갭 형성은 사용 시간-포인트 심사에 대 한 셀 문화 supernatants PA103 가진 외피의 충분 한 기간으로 cyto...

간단한 방법은 다음 폐 피 내 막의 감염 세포 독성 amyloids의 생산 위한 녹 농 균에 의해 설명 되어 있습니다.

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

이 방법은 폐 치료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 병원 내 폐렴에서 살아남은 환자가 왜 그렇게 나쁜 장기적 결과를 보이는가? 이 방법의 장점은 간단하고 신뢰할 수 있다는 것인데, 이는 실험실에 오는 모든 사람이 배울 수 있고 다음 날 유용하고 반복 가능한 데이터를 생성할 수 있다는 것을 의미합니다. 이러한 분석 방법은 in vitro에서 배양된 세포의 감염에 대한 통찰력을 제공하는 데 적용할 수 있지만 동물 모델 및 인간 환자에게도 적용할 수 있습니다.세포독성 상등액을 생산하려면 HBSS로 150cm 접시의 내피 세포를 세척하고 녹농균 집락을 540나노미터에서 0.25의 흡광도로 희석합니다. 박테리아 세포를 더 희석하여 HBSS 20 밀리리터 중 20 대 1의 감염 배수를 허용하고 박테리아를 내피 세포의 플레이트에 파종합니다. 그런 다음 감염된 세포를 섭씨 37도, 5%CO2 인큐베이터에 4-5시간 동안 넣습니다.박테리아와 내피 세포의 배양은 적절한 시간 동안 발생하는 것이 중요합니다. 배양이 너무 짧으면 아밀로이드가 상층액으로 방출되지 않습니다. 배양이 너무 길면 세포는 실제로 용해되어 모든 내용물을 상층액으로 방출합니다.적절한 배양 기간 동안 우리가 사용하는 지표는 내피 단층의 틈 형성입니다. 광학 현미경으로 세포 단층에서 갭이 관찰될 수 있는 경우, 원심분리를 위해 상등액을 수확하여 세포 파편을 제거합니다. 0.2미크론 필터가 장착된 주사기에 상층액을 디캔팅하고 필터를 통해 상층액을 통과시켜 오염 박테리아를 제거합니다.그런 다음 세포 독성 테스트를 위해 1.5ml의 멸균 상등액을 따로 보관하고 나머지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 수확된 상층액의 세포 독성을 평가하기 위해 1.5ml의 필터 멸균 상등액 분취액을 합류 폐 미세혈관 내피 세포 배양이 포함된 6웰 플레이트의 단일 웰에 추가합니다. 플레이트를 CO2 인큐베이터에 21-24시간 동안 넣습니다.그런 다음 처리된 배양 및 대조 배양 영역의 이미지를 얻습니다. 이미지를 사용자 지정 imagej 매크로로 가져오고 대비를 15% 채도 픽셀로 조정합니다. 대비가 조정된 이미지를 복제하고 배경 빼기를 사용하여 시야 내의 온전한 세포와 갭 영역 모두의 고대비 이미지를 얻을 수 있습니다.원본 이미지에서 이 고대비 이미지를 빼고 이미지 계산기 및 기능을 사용하여 결과 이미지를 원본 이미지와 결합합니다. threshold 함수를 사용하여 결합된 이미지를 갭은 검은색이고 온전한 셀은 흰색인 마스크로 변환합니다. 그리고 binary erode 함수를 사용하여 이미지에서 노이즈를 제거합니다.그런 다음 영역 분율을 사용하여 결과 이미지 내에서 검은색 픽셀과 흰색 픽셀의 비율을 측정합니다. 그리고 각 처리 시점에 대한 분수 면적을 최대 갭 면적의 백분율로 표시하고 표현합니다. 상층액 내의 아밀로이드를 정량화하려면 1밀리리터 분광광도계 큐벳에 있는 PBS 1밀리리터에 새로 준비되고 여과된 50X 티오플라빈 T 원액 20마이크로리터를 추가하고 희석된 샘플을 분광형광도계에 로드합니다.425 나노미터 여기를 사용하여 기준선 형광 방출을 측정합니다. 450나노미터에서 575나노미터까지의 형광 방출을 2나노미터 단위로 스캔합니다. 그런 다음 425나노미터 여기와 482나노미터 방출을 사용하여 60초 동안 0.2초마다 데이터를 수집하여 타임랩스 스캔을 수행하도록 기기를 설정합니다.20초 후에 스캔을 일시 중지하고 10마이크로리터의 필터 멸균 상층액을 큐벳에 넣습니다. 반전으로 혼합한 후 큐벳을 분광형광측정기에 다시 로드하고 마지막 40초 동안 시간 기반 스캔을 재개합니다. 타임 랩스가 완료되면 원래 스캔 설정을 사용하여 최종 형광 방출 스펙트럼 스캔을 수행합니다.폐 미세혈관 내피 세포의 합류층에 P.aeruginosa를 추가하면 세포 사이에 갭 형성이 유도됩니다. imagej를 사용하여 치료 첫 12시간 동안 입증된 상층아 세포 독성을 평가하면 여전히 건강한 융합 세포 단층을 미시적 필드 내의 모든 흰색 영역으로 시각화할 수 있습니다. 그러나 PA 103에 감염된 배양액에서 채취한 상등액을 첨가한 후 18시간이 지나면 세포가 없는 배양 접시의 면적이 선형으로 증가하면서 단층의 틈을 감지할 수 있으며, 이 시점에서 온전한 세포는 거의 관찰되지 않습니다.세포 독성의 마커로 젖산 탈수소 효소 방출을 사용하여 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. 젖산 탈수소 효소는 세포 독성 상층액 첨가 후 18 시간에 처음 검출되고 36 시간에 최대 세포 사멸이 측정 될 때까지 선형 방식으로 증가합니다. 상등액은 또한 면역블롯 분석을 통해 평가하거나 상등액 내 세포독성 아밀로이드의 존재를 결정하기 위해 아밀로이드 결합에 의해 유도된 확인 변화로 인한 티오플라빈 T 형광 강도의 변화를 측정하여 평가할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 녹농균에 내피 세포가 감염된 후 세포 독성 상등액을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한, 이러한 상층액에 존재하는 세포독소를 특성화하고 분석하는 데 필요한 분석 유형에 대해 잘 알고 있어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Balczon, R., et al. 녹농균에 의한 폐내피 세포 감염 후 세포독성 아밀로이드를 검출하는 방법. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 아밀로이드 베타 시트 구조에 결합하는 형광 염료인 티오플라빈 T를 사용하여 독성 박테리아에 감염된 폐 내피 세포의 배양 상청액에서 아밀로이드를 정량화하는 프로토콜을 보여줍니다. 기준선에 비해 형광의 증가는 배양 상청액에 아밀로이드가 존재함을 나타냅니다.

티오플라빈 T 형광을 이용한 박테리아 감염 유도 아밀로이드 정량

출처: Balczon, R., et al. 녹농균에 의한 폐내피 세포 감염 후 세포독성 아밀로이드를 검출하는 방법. J. Vis. Exp. (2018)이 비디오는 녹농균 감염 후 폐 내피 세포에서 세포독성 상청액을 생성하는 절차를 보여줍니다. 박테리아 이펙터 단백질이 숙주 세포 구조를 교란하고 세포독성 아밀로이드 올리고머의 상청액 방출을 유도하는 방법을 간략하게 설명합니다.

쥐 폐내피 세포의 세균 감염 후 세포독성 아밀로이드 획득

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

우리는 endomembrane 파열을 추적하는 방법을 설명하면 세포 내 박테리아에 의해...

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

우리는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 기관내 주입에 의한 쥐 폐 손상 모델을 개발했습니다. 이 모델은 폐렴 중 폐 손상을 모방하며 임상적으로 관련이 있습니다.

녹농균 유발 폐 손상 모델

여기서는 활동 기반 프로브의 제조 및 사용을 설명 (ARN14686, 운데 10 ynyl- N - [(3- S) -2- oxoazetidin -3- 일] 카르 바 메이트)의 검출 및 정량화를 허용 염증성 효소 N -acylethanolamine 산 아미 다 아제의 활성 형태 (NAAA), 모두 생체 외 및 생체있다.

준비 및<em&gt; 생체</em&gt; 액티비티 기반 프로브의 사용을위한<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine 산 아미 다제

여기서, 우리는 녹농균의 작은 식민지 변종을 배양하는 성장 상태를 설명한다. 우리는 또한 전통적인 우론산 카르바졸 분석및 알긴산 특이적 단일클론 항체(mAb) 기반 ELISA를 사용하여 P. aeruginosa에 의해 생성된 외다당류 알긴산의 검출 및 정량화를 위한 2개의 개별적인 방법을 기술한다.

슈도모나스 녹농균의 작은 식민지 변형의 문화와 알긴산의 정량화

당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.- 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

침착성 대 장균 균주에서의 항생제 내성은 전통적인 겐타미신 보호 검사법을 이용한 세균 침입 평가에 도전 과제를 제기합니다. 군락 형성 단위를 열거하여 정량적으로, 그리고 감염된 세포를 면역형광 공초점 현미경으로 시각화하여 정성적으로 평가하는 개선된 방법을 기술한다.

대장균 세포 침범의 정량화 및 시각화를 위한 아미카신 보호 분석

본 논문은 성장의 다른 방법을...

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

배우세요 Pseudomonas aeruginosa 감염 후 폐 내피 세포에서 세포독성 아밀로이드를 생성하고 분석하는 방법을. 이 단순하고 신뢰할 수 있는 프로토콜은 생체 내외 모델 모두에 적용 가능합니다.

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