방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

이 방법은 폐 치료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 병원 내 폐렴에서 살아남은 환자가 왜 그렇게 나쁜 장기적 결과를 보이는가? 이 방법의 장점은 간단하고 신뢰할 수 있다는 것인데, 이는 실험실에 오는 모든 사람이 배울 수 있고 다음 날 유용하고 반복 가능한 데이터를 생성할 수 있다는 것을 의미합니다. 이러한 분석 방법은 in vitro에서 배양된 세포의 감염에 대한 통찰력을 제공하는 데 적용할 수 있지만 동물 모델 및 인간 환자에게도 적용할 수 있습니다.

세포독성 상등액을 생산하려면 HBSS로 150cm 접시의 내피 세포를 세척하고 녹농균 집락을 540나노미터에서 0.25의 흡광도로 희석합니다. 박테리아 세포를 더 희석하여 HBSS 20 밀리리터 중 20 대 1의 감염 배수를 허용하고 박테리아를 내피 세포의 플레이트에 파종합니다. 그런 다음 감염된 세포를 섭씨 37도, 5%CO2 인큐베이터에 4-5시간 동안 넣습니다.

박테리아와 내피 세포의 배양은 적절한 시간 동안 발생하는 것이 중요합니다. 배양이 너무 짧으면 아밀로이드가 상층액으로 방출되지 않습니다. 배양이 너무 길면 세포는 실제로 용해되어 모든 내용물을 상층액으로 방출합니다.

적절한 배양 기간 동안 우리가 사용하는 지표는 내피 단층의 틈 형성입니다. 광학 현미경으로 세포 단층에서 갭이 관찰될 수 있는 경우, 원심분리를 위해 상등액을 수확하여 세포 파편을 제거합니다. 0.2미크론 필터가 장착된 주사기에 상층액을 디캔팅하고 필터를 통해 상층액을 통과시켜 오염 박테리아를 제거합니다.

그런 다음 세포 독성 테스트를 위해 1.5ml의 멸균 상등액을 따로 보관하고 나머지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 수확된 상층액의 세포 독성을 평가하기 위해 1.5ml의 필터 멸균 상등액 분취액을 합류 폐 미세혈관 내피 세포 배양이 포함된 6웰 플레이트의 단일 웰에 추가합니다. 플레이트를 CO2 인큐베이터에 21-24시간 동안 넣습니다.

그런 다음 처리된 배양 및 대조 배양 영역의 이미지를 얻습니다. 이미지를 사용자 지정 imagej 매크로로 가져오고 대비를 15% 채도 픽셀로 조정합니다. 대비가 조정된 이미지를 복제하고 배경 빼기를 사용하여 시야 내의 온전한 세포와 갭 영역 모두의 고대비 이미지를 얻을 수 있습니다.

원본 이미지에서 이 고대비 이미지를 빼고 이미지 계산기 및 기능을 사용하여 결과 이미지를 원본 이미지와 결합합니다. threshold 함수를 사용하여 결합된 이미지를 갭은 검은색이고 온전한 셀은 흰색인 마스크로 변환합니다. 그리고 binary erode 함수를 사용하여 이미지에서 노이즈를 제거합니다.

그런 다음 영역 분율을 사용하여 결과 이미지 내에서 검은색 픽셀과 흰색 픽셀의 비율을 측정합니다. 그리고 각 처리 시점에 대한 분수 면적을 최대 갭 면적의 백분율로 표시하고 표현합니다. 상층액 내의 아밀로이드를 정량화하려면 1밀리리터 분광광도계 큐벳에 있는 PBS 1밀리리터에 새로 준비되고 여과된 50X 티오플라빈 T 원액 20마이크로리터를 추가하고 희석된 샘플을 분광형광도계에 로드합니다.

425 나노미터 여기를 사용하여 기준선 형광 방출을 측정합니다. 450나노미터에서 575나노미터까지의 형광 방출을 2나노미터 단위로 스캔합니다. 그런 다음 425나노미터 여기와 482나노미터 방출을 사용하여 60초 동안 0.2초마다 데이터를 수집하여 타임랩스 스캔을 수행하도록 기기를 설정합니다.

20초 후에 스캔을 일시 중지하고 10마이크로리터의 필터 멸균 상층액을 큐벳에 넣습니다. 반전으로 혼합한 후 큐벳을 분광형광측정기에 다시 로드하고 마지막 40초 동안 시간 기반 스캔을 재개합니다. 타임 랩스가 완료되면 원래 스캔 설정을 사용하여 최종 형광 방출 스펙트럼 스캔을 수행합니다.

폐 미세혈관 내피 세포의 합류층에 P.aeruginosa를 추가하면 세포 사이에 갭 형성이 유도됩니다. imagej를 사용하여 치료 첫 12시간 동안 입증된 상층아 세포 독성을 평가하면 여전히 건강한 융합 세포 단층을 미시적 필드 내의 모든 흰색 영역으로 시각화할 수 있습니다. 그러나 PA 103에 감염된 배양액에서 채취한 상등액을 첨가한 후 18시간이 지나면 세포가 없는 배양 접시의 면적이 선형으로 증가하면서 단층의 틈을 감지할 수 있으며, 이 시점에서 온전한 세포는 거의 관찰되지 않습니다.

세포 독성의 마커로 젖산 탈수소 효소 방출을 사용하여 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. 젖산 탈수소 효소는 세포 독성 상층액 첨가 후 18 시간에 처음 검출되고 36 시간에 최대 세포 사멸이 측정 될 때까지 선형 방식으로 증가합니다. 상등액은 또한 면역블롯 분석을 통해 평가하거나 상등액 내 세포독성 아밀로이드의 존재를 결정하기 위해 아밀로이드 결합에 의해 유도된 확인 변화로 인한 티오플라빈 T 형광 강도의 변화를 측정하여 평가할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 녹농균에 내피 세포가 감염된 후 세포 독성 상등액을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한, 이러한 상층액에 존재하는 세포독소를 특성화하고 분석하는 데 필요한 분석 유형에 대해 잘 알고 있어야 합니다.