Name: Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 배우세요 형광 분자 단층 촬영(FMT)을 활용한 교모세포종 비침습적 실시간 영상화 방법. 이 기술은 종양 진행과 치료 반응을 정량적으로 평가하여 뇌종양 생물학 연구에 활용됩니다.

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우리 닥터 프레드릭 랭, 메릴랜드 앤더슨 암 센터를 GBM PDX neurospheres에 대 한 감사합니다. 이 작품은 패배 GBM 연구 협력, 국가 뇌 종양 학회 (프랭크 나리), R01-NS080939 (프랭크 나리), 제임스 미 맥도 넬 재단 (프랭크 나리);의 자회사에 의해 지원 되었다 호르헤 베 니 테 스는 수상에서에 미국 뇌 종양 협회 (ABTA);에 의해 지원 되었다 Ciro Zanca 미국-이탈리아어 암 재단 박사 후 연구 친교에 의해 부분적으로 지원 되었다. 프랭크 푸 르 나리 암 연구에 대 한 루드비히 연구소에서 추가 지원과 급여를 받습니다.

실험적인 연구 동물 lentivirus transduce 암 세포를 같은 전염 성 요원의 활용 기관 동물 관리 프로그램 및 기관 biosafety 위원회에 의해 사전 승인을 받아야 합니다. 이 프로토콜은 캘리포니아 대학 샌디에고 (UCSD)의 동물 보호 지침을 따릅니다.
1. FP635 또는 FP720 구문 세포종 세포의 라벨
<ol><li>생산 및 Tiscornia 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 프로토콜에 따라 lentivirus 정화 12
</li>
	<li>DMEM 플러스 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 15 cm 접시; 인간의 glioma 셀 라인에서 문화 약 2.0 x 106 셀 DMEM과 문화 2.0 x 106 인간의 세포종 환자 파생 (GBM-PDX) 분야 또는 F12 B27와 1:1 매체와 인간 재조합 표 피 성장 인자 (EGF, 20 ng/mL) 및 FGF 보완 / (10 ng/mL) T75 플라스 크에.</li>
	<li>모든 셀에서 37 ° C, 5% CO2, 그리고 100% 상대 습도 유지 합니다.</li>
	<li>세포 분열<ol>
<li>Glioma 셀:는 상쾌한 접시에서 제거 하 고 glioma 세포를 트립 신 1 X의 3-5 mL를 추가.</li>
		<li>GBM 분야: 15 mL 튜브에 세포를 pipetting으로 세포를 수집.<ol>
<li>탁상 원심 분리기를 사용 하 여 실 온에서 5 분 동안 200 x g에 GBM 분야 아래로 회전 합니다.</li>
			<li>제거는 상쾌한 고 세포 분리 솔루션의 3-5 mL를 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>10-15 분 동안 37 ° C에서 모든 셀을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조심 스럽게 몇 번 위아래로 pipetting으로 세포 분열 (분야 및 glioma 셀 완료 해리) 및 5 분 동안 200 x g에 아래로 회전.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 여러 번 위아래로 pipetting으로 매체의 5 mL로 세포를 resuspend. Trypan 블루 제외 하 여 세포 생존 능력을 결정 합니다.</li>
	<li>플레이트 1.0 x 106 10 cm 접시에 대상 셀의 pipetting으로 매체의 5 mL와 함께.</li>
	<li>감염 (MOI) Tiscornia 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 5의 다양성에서 형광 단백질을 표현 lentivirus와 셀 transduce 12 고 37 ° c.에 품 어</li>
	<li>24 시간 후 transduced 세포에서 매체를 제거, 신선한 매체의 5 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 추가 48 h에 대 한 품 어</li>
	<li>1.4-1.6 단계에 설명 된 대로 단일 셀 서 스 펜 션에 감염 된 세포를 분리. 5 분 동안 200 x g에서 셀 아래로 회전 하 고 솔루션을 정렬의 500 µ L에서 resuspend (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 1 %FBS).</li>
	<li>FACS 튜브에 세포 현 탁 액을 플라스틱. 공동의 4', 죽은 세포를 제외 하려면 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dihydrochloride 1 µ L/mL로 세포 얼룩. 네거티브 컨트롤 흐름 cytometer 게이츠를 설정 하는 데 필요한 (비 불리고 세포와 세포 transduced 비 DAPI 스테인드 /).</li>
	<li>Basu 외 에 설명 된 대로 솔루션을 정렬에 DAPI 음수가 형광 양성 세포를 정렬 13, 15 mL 원뿔 튜브로 정렬된 셀을 수집.</li>
	<li>5 분 동안 200 x g에서 정렬된 셀 아래로 회전 시키십시오, 상쾌한, 제거 하 고 문화 매체의 5 mL에 resuspend. 시드 pipetting으로 10 cm 접시에 정렬 된 셀입니다. 적어도 48 72 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>해리 셀 정렬된 셀 확장 단계 1.4-1.6 그리고 vivo에서 실험에 대 한 여러 요리에 도금. 셀 정렬 준비 및 정화에 대 한 자세한 내용은 참고: Basu 외. 13
</li>
</ol>2. intracranial 주입 세포종 세포 iRFP 태그의 Immunodeficient 마우스
참고: 시작 하기 전에 수술, 수술 실 및 도구 절차에 대 한 깨끗 한 되어 있는지 확인. Immunodeficient athymic 누드 (Foxn1nu) 남성 또는 여성 쥐, 4-5 주 오래 된과 intracranial 주사에 대 한 17-19 g 사이 사용 합니다. 도착 후 그리고 수술 전에 동물은 적어도 3 일 동안 보관 한다.
<ol><li>세포 준비<ol>
<li>수확 하 고 형광 긍정적인 glioma 셀 단일 세포 현 탁 액 (1.4-1.6 단계)로 해리 동물 당 주입 당 PBS의 2-5 µ L에서 0.5 또는 1.0 x 106 셀 resuspend. 얼음에 장소와 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 플라스틱.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마 취 준비 및 관리<ol>
<li>케 타 민 (100mg/kg) 및 마우스 몸 무게의 20 그램 당 xylazine (10 mg/kg)를 포함 하는 염 분 해결책의 200 µ L를 준비 합니다. 그리고 무게는 동물 마 취의 적절 한 복용량을 계산.</li>
		<li>마 취의 복 주사를 제공 하 고 탈수를 방지 하기 위해 눈에 안과 연 고를 적용. 이 단계에 대 한 자세한 내용은 참조 캐슬 린 외. 14 장소 37 ° c.에 미리 데워 진된 물 열 패드에 동물</li>
		<li>그는 동물은 취 발가락 핀치 응답 (페달 반사), 모니터링 하 여 일반적으로 5-10 분 이내 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Intracranial 주입<ol>
<li>5 µ L 로드 세포 현 탁 액 및 프로브 홀더에서 마운트 해밀턴 주사기 (바늘 무뚝뚝한 끝).</li>
		<li>작은 동물 정위 적 프레임에 마우스를 놓고 귀 바, Cetin 외. 설명된 내용을 따라 니 어댑터를 사용 하 여 머리를 수정 15
</li>
		<li>70% 에탄올과 betadine 솔루션으로 머리를 소독. 있는지 확인 외과 사이트 완료 살 균 합니다. 작은 메스와 중간 절 개를 수행 하 고 피부와 연결 어 조직.</li>
		<li>해밀턴 주사기는 micromanipulator를 사용 하 여 bregma 지점에 놓습니다.</li>
		<li>프로브 홀더 1.0 m m anteroposterior와 2.0 m m 측면 bregma 지점에서 이동 합니다. 이 위치를 연필로 표시 합니다.</li>
		<li>이 위치에서 주의깊게 확인 구멍 두개골에 micromotor 휴대용 드릴 혈관 표시 될 때까지 아래쪽으로 약간의 압력을 적용 하 여. 거미 집 모양의 교 및 뇌 실질을 방해 하지 않습니다.</li>
		<li>버 구멍에 바늘을 소개 하 고 사전 pial 표면 아래 3.0 m m.</li>
		<li>볼륨 (2-5 µ L) 및 유량 (1 µ L/min) 사출 동력된 stereotaxic 인젝터를 사용 하 여 설정 하거나 수동으로 주사를 수행 합니다.</li>
		<li>주입 후 1.0 m 마다 1 분을 오름차순으로 바늘을 점차적으로 제거 하 고 70% 에탄올 주사 사이트를 청소 합니다.</li>
		<li>가까운 피부 상처 수술 스테이플 또는 외과 봉합 (바늘이 라고도 함) 하 여 고 캐슬 린 외. 14 대 한 자세한 내용입니다은.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동물 복구<ol>
<li>동물 물 열 패드 (37 ° C)에 전송 하 고 전체 복구까지 체온, 호흡 속도 심장 박동을 모니터링. 표준 프로토콜 당 무 통을 관리 합니다. 참고: 정위 적 절차에 대 한 자세한 내용은, 수술, 그리고 좌표를 참조 다른 보고서5,,1415.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. FMT 이미징
참고: 실험 목표에 따라 iRFP 태그 세포종 세포 수 모니터링 비보 전에, 하는 동안, 또는 치료 후. 목적, 이미징 동물 isoflurane 유도 챔버를 사용 하 여 anesthetize, 스캔 및 이미지 FMT 영상의 도킹 스테이션에서 동안 이미징 카세트에서 유지.
<ol><li>감 금 소 및 isoflurane 유도 실에서 장소에서 동물을 제거 합니다. 챔버를 닫고 산소 흐름 및 기화 기 3-5%.</li>
	<li>동물을 모니터링 때까지 그것은 완전히 마 취, 일반적으로 1-2 분 무 의식 내의 동물 해야 응답 하지 외부 자극에.</li>
	<li>약 실에서 마 취 동물을 제거 하 고 동물에에서 넣어 이미징 카세트 헤드 어댑터를 먼저 배치 하 여 아래로 향하게 하는 동물을 배치 하 여 다음. 머리는 카세트의 중앙에 위치 하 고 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>상단에 카세트의 상단 접시를 놓고 17 m m까지 조정 노브를 조입니다.</li>
	<li>일단 그 동물 안전에 이미징 카세트, 카세트는 isoflurane 동물 마 취 유지 하 양수는 FMT 영상의 내부 도킹 스테이션에 삽입 하 여 이미지를 진행.</li>
	<li>소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭 하 여 영상 및 분석기 소프트웨어를 실행 합니다.</li>
	<li>"실험적인 탭" 창에서 "데이터베이스" 및 "연구 그룹"을 선택 합니다.</li>
	<li>"스캔 탭" 창에가 고 "제목 선택"을 클릭 하 여 이미지에 주제를 선택 합니다. 또한, "레이저 채널" 패널에 레이저 채널을 선택 합니다. FP635 표시 된 셀에 대 한 "레이저 채널 635 nm"를 선택 하 고 "채널 680 nm 레이저" FP720 표시 된 셀을 선택 합니다.</li>
	<li>"스캔 탭" 창에서 "캡처" 옵션을 클릭 하 여 이미지를 취득 합니다. 다음을 클릭 하 고 소스 위치, 일반적으로 동측 측에 대 한 20-25 소스 내에서 수를 결정된을 캡처한 이미지에서 검색 필드를 끌어 검색 필드를 조정 합니다.</li>
	<li>"재건 대기열에 추가" 옵션 확인 하 고 "검색 탭" 창에서 "스캔"을 누르십시오.</li>
	<li>스캔 완료 될 때까지 하 고 영상 카세트 도킹 스테이션에서 제거.</li>
	<li>카세트의 상단 플레이트를 제거 하 고 감 금 소 동물 다시 넣습니다.</li>
	<li>동물의 나머지 부분에 대 한 3.1 3.12 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>4. 이미지 분석
<ol><li>영상 및 분석기 소프트웨어에서 "분석 탭" 창을 선택 합니다.</li>
	<li>데이터 집합의 "분석 탭" 창 "데이터 집합 선택" 패널에서 "+" 버튼을 클릭 하 여 분석을 로드 합니다.</li>
	<li>이미지 "분석 탭" 창에서 로드 되 면 "분석 탭" 윈도우의 왼쪽된 상단에 있는 둥글지 아이콘을 선택 하 여 관심 (ROI) 분석의 영역을 수행 합니다.</li>
	<li>오른쪽 "분석 탭" 창에서 "임계값" 열을 클릭 하 여 "통계 데이터" 패널에서 0 임계값을 조정 합니다.</li>
	<li>"통계 데이터" 패널의 총 가치는 쥐의 뇌에 이식 하는 형광 태그 세포종 세포에서 신호를 나타냅니다.</li>
	<li>동물의 나머지 부분에 대 한 4.2-4.4 단계를 반복 합니다. 로드 하거나 클릭 하 여 새로운 주제를 제거는 "+" 또는 "−" 버튼, "분석 탭" 창의 "데이터 집합 선택" 패널에 각각. : FMT 이미징 및 소프트웨어 동작에 대 한 자세한 내용은 참고20.
</li>
</ol>

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</ol>

저자 관심 없음 충돌 선언합니다.

종양 xenografts 암 연구에 광범위 하 게 사용 되 고 다양 한 잘 설립 된 이미징 기술 개발 되었습니다: 라스; 자기 공명 영상 (MRI); 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 계산 된 단층 촬영 (CT); FMT입니다. 각이 방법 마다 장점과 단점을 함께 제공 하지만 궁극적으로 제공 하는 정보의 종류와 서로 보완. 가장 일반적으로 사용 되는 vivo에서 이미징 기술 중 하나입니다 씨5,6,,78. 라스 및 FMT 두 세포 공학 (luciferase 효소 또는 적외선 형광 단백질) 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 필요 합니다. 씨는 더 작은 종양 질량에 대 한 민감한 하지만 최대 배포 10-12 분;에 신체에 도달 하는 기판 (소)의 복 주입 필요 하지만 가벼운 냉각 및 수...

암은 산업화 된 세계에서 인간에서 질병 관련 된 죽음의 주요 원인 중 하나입니다. 매우 높은 사망자와 새로운 처리는 시급히 필요. 세포종 님 (GBM)는 매우 치명적인 뇌 암, 뇌 종양, 실질, 그리고 면역 세포의 이질적인 인구의 구성 유형의 이다. 미국의 중앙 두뇌 종양 레지스트리 따르면 기본 악성 및 비 악성 뇌종양의 발생률 100000 당 대략 22 경우입니다. 약 11, 000의 새로운 사례는 20171미국에서 진단 되는으로 예상 된다.
전 임상 연구는 마약, 절차, 또는 인 간에 있는 테스트 전에 효과적 치료의 가능성을 조사. 전 임상 연구의 초기 실험실 단계 중 하나는 인간의 종이 식 모델로 정의 호스트 유기 체에 이식 하는 암 세포를 사용 하 여 약물 치료에 대 한 잠재적인 분자 표적 식별 됩니다. 이 컨텍스트에서 intracranial 뇌 종양이 종이 식 모델 환자 파생 xenografts (PDXs)를 사용 하 여 널리 사용 된 뇌 종양 생물학, 진행, 진화, 그리고 치료 응답, 연구와 바이오 마커 개발에 대 한 더 많은 최근 마약 검사, 및 맞춤 의학2,,34.
가장 저렴 하 고 비-침략 적 vivo에서 이미징 intracranial xenografts 모니터링 하는 방법 중 하나입니다 생물 발광 영상 (BLI)5,6,,78. 그러나, 일부 씨 한계는 기판 관리 및 가용성, 효소 안정성, 그리고 가벼운 냉각 및 수집9이미징 동안 비 산을 포함 합니다. 여기 우리는 이미징 방법 전 임상 세포종 모델을 모니터링 하는 대신 적외선 FMT를 보고 합니다. 이 방법, 신호 수집 및 intracranially 이식된 PDXs의 정량화에 표현 한 근 적외선 형광 단백질 iRFP72010,11 (FP720 이제 되 나) 또는 turboFP635 (이제 되 나 FP635), 이미징 시스템 FMT와 함께 수행 됩니다. FMT 기술을 사용 하 여, 종양 수 orthotopic 모니터링 비보 전에, 동안, 또는 치료, 임상 관찰에 대 한 비-침략 적, 기판 및 양적 방식.

<table><tbody><tr><td>DMEM/고혈당&nbsp;</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30022.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>혁신적인 세포 기술</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>인간 재조합 EGF&nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>인간 재조합 FGF</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2634</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-00</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>p24 엘리사&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Zoetis</td><td>NADA 043-403</td><td>규제 물질</td></tr><tr><td>연고</td><td>Dechron</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>흡수성 봉합사</td><td>CpMedical</td><td>VQ392</td><td></td></tr><tr><td>5 ul 주사기</td><td>Hamilton</td><td>26200-U</td><td>카탈로그 번호 판매 Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>세포 분류기</td><td>Sony</td><td>SH8007</td><td></td></tr><tr><td>마우스 스테레오택시 프레임&nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>모터화된 스테레오택시 인젝터</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>마이크로모터 핸드헬드 드릴</td><td>Foredom</td><td>K1070</td><td></td></tr><tr><td>마우스 워밍 패드&nbsp;</td><td>Ken Scientific Corporation</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>형광 단층 촬영 시스템&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>FMT 2500 XL</td><td></td></tr><tr><td>TrueQuant 이미징 소프트웨어&nbsp;</td><td>퍼킨 엘머&nbsp;</td><td></td><td></td>7005319</tr><tr><td>Ultra-centrifuge Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392049</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 100mm 접시</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 150mm 접시</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-203</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 T75</td><td>Corning</td><td>430720U</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 Avanti J-20</td><td>Beckman Coulter</td><td>J320XP-IM-5</td><td></td></tr><tr><td>튜브, 폴리프로필렌, Thinwall, 5.0 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>326819</td><td></td></tr>관<tr><td>, Thinwall, 폴리프로필렌, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Athymic 누드 마우스</td><td>Charles River Laboratories</td><td>스트레인 코드&nbsp; 490 (동형접합성)</td><td>기관 동물 관리 프로그램 및 기관 생물안전성 위원회의 사전 승인이 필요합니다.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

vivo에서 이미징 세포종 xenografts의 형광 분자 단층 촬영

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Tumorigenicity는 종양을 형성 하는 암 세포의 기능 대량. 널리 사용 방식은 셀 tumorigenic 확인 암 세포와 immunodeficient 쥐를 피하 주입 되 고 만져 서 후 종양 질량을 측정 하 여. 암 세포의 Orthotopic 주사 가장 밀접 하 게 공부 되 고 종양의 기원의 조직 microenvironment에이 종이 식을 소개 하고자 합니다. 뇌 암 연구의 암 세포는 뇌의 독특한 microenvironment에서 종양 형성과 분석 수 있도록 intracranial 주입을 필요 합니다. Vivo에서 이미징 intracranial xenografts의 즉시 orthotopically engrafted 쥐의 종양 질량을 모니터링합니다. 여기 우리 뇌 종양 xenografts의 형광 분자 단층 (FMT)를 사용 하 여를 보고합니다. 암 세포는 먼저 가까운 적외선 형광 단백질으로 불리고 하 고 immunocompromised 쥐의 뇌에 주입. 동물 다음 시간의 연장된 기간 동안 종양 질량에 대 한 정량적 정보를 검색 합니다. 셀 라벨 미리 각 마우스에서 종양의, 재현성, 비용 효과적이 고 신뢰할 수 있는 정량화 할 수 있습니다. 우리는 이미징 기판, 주입에 대 한 필요성을 제거 하 고 따라서 동물에 스트레스 감소. 이 접근의 제한; 매우 작은 질량을 감지 하는 무 능력에 의해 표시 됩니다. 그러나, 그것은 다른 기술 보다 더 큰 대 중을 위한 더 나은 해결책이 있다. 그것은 약물 치료의 효 험 또는 glioma 셀 라인 및 환자 파생 된 샘플의 유전 변경 평가에 적용할 수 있습니다.

세포종 세포 U87EGFRvIII (U87 셀-EGF 수용 체 변형 III 표현) 1.2 단계에 따라 경작 했다. Lentivirus 생산과 단계 1.1에 따라 정화 했다. 바이러스 농도 p24에 의해 결정 되었다 ELISA 분석. 셀은 lentivirus 단계 1.8에 따르면 적외선 형광 단백질을 운반으로 불리고 있었다. FP72010,11 인코딩 플라스 미드 박사 V.V. Verkhusha에서 제공한 친절 하 게 그리고 FP635 벡터 상업용 공급 업체에서 구입한. 대상 셀 FACS 상위 10% 형광 세포 인구 (그림 1A)에 대 한 풍부 하 게 정렬 했다. 형광 신호를 증가 형광 단층 촬영 시스템의 감도 향상 시킵니다. Orthotopic 이식 전에 붙일 라는 세포의 신호 강도 확인 하기 위해 우리 FMT 영...

종양 세포의 Orthotopic intracranial 주사 공부 뇌 종양 생물학, 진행, 진화, 그리고 치료 응답을 암 연구에 사용 되었습니다. 여기 선물이 형광 분자의 단층 촬영 종양 xenografts 실시간 intravital 이미징 및 종양의 정량화 임상 세포종 모델에서 대량 제공.

Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 형광 분자 단층 촬영 또는 FMT를 사용하여 전임상 뇌종양 이미징 모델을 확립하는 것입니다. 이 방법은 뇌종양 생물학, 암 연구 및 약물 발견 분야에서 종양의 공격성, 이질성 및 치료 반응성에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비침습적, 봉합사가 필요 없고 정량적인 방식으로 치료 전, 치료 중 또는 치료 후에 종양을 생체 내에서 모니터링할 수 있다는 것입니다.이 기술의 또 다른 장점은 동물의 다른 장기에 이식 된 다른 유형의 이종 이식 모델에 적용 할 수 있다는 것입니다. 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 배양을 위해 5ml의 배지에 있는 10-6번째 교모세포종 세포를 10cm 접시에 1번 파종하는 것으로 시작합니다. 다음 날 아침, 렌티바이러스로 세포를 transduction하여 5의 감염 다중도에서 적절한 관심 형광 단백질을 발현하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.24시간 후, 상층액을 5ml의 신선한 배지로 교체하고 배양액을 48시간 더 배양합니다. 배양이 끝나면 배지를 섭씨 37도에서 10-15분 동안 3-5ml의 트립슨으로 교체한 다음 분리된 세포를 완전히 해리하기 위해 조심스럽게 피펫팅합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 500마이크로리터의 분류 용액에 다시 현탁시킵니다.세포를 적절한 수의 팩스 튜브로 분할하고 죽은 세포 배제를 위해 DAPI로 세포를 공동 염색합니다. 그런 다음 튜브를 유세포 분석기에 로드하고 형광 구조 발현에 따라 살아있는 세포를 새로운 분류 용액이 들어 있는 15ml 원추형 튜브로 분류합니다. 원심분리 후, 양성 DAPI 음성 세포를 5ml의 배양 배지에 다시 현탁시키고 48-72시간 동안 섭씨 37도에서 배양하기 위해 새로운 10cm 접시에 파종합니다.배양이 끝나면 후속 in vivo 실험을 위해 파종을 위해 세포를 여러 접시로 분할합니다. 주사 당일, 형광 양성 신경교종세포를 단일 세포 현탁액으로 해리하고 얼음 위의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에서 동물 농도당 주입당 PBS 2-5마이크로리터당 6번째 세포까지 0.5 또는 1배 10으로 다시 현탁시킵니다. 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인한 후, 면역 결핍 Athymic Nude 수혜자 마우스의 눈에 연고를 바르고 주사를 위한 세포와 함께 뭉툭한 끝 바늘이 장착된 5마이크로리터 해밀턴 주사기를 로드합니다.주사기를 프로브 홀더에 장착하고

fluorescence-molecular-tomography-for-vivo-imaging-glioblastoma

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

루시페라제 - 수정된 인간의 뇌 종양의 xenografts은 종양 성장과 bioluminescence 이미징을 사용하여 치료에 대한 응답의 후속 모니터링과 athymic 생쥐에 intracranially 설정할 수 있습니다. 생존 분석과 함께, bioluminescence 모니터링 뇌 종양 치료를위한 고려되는 요법의 사전 임상 시험을위한 필수적인 연구 도구입니다.

Bioluminescence 이미징을 사용하여 종양 성장과 치료에 반응 이후 분석 Intracranial 뇌종양의 Xenografts 구축

C57BL에 GL261 셀 / 6 마​​우스의 Intracranial 이식은 인간 glioblastoma multiforme의의 특징 중 많은 것들을 요점을 되풀이하다 악성 gliomas을 생산하고 있습니다. 우리는 우리가 사용할 수 있도록 안정 루시페라제 표현 GL261 세포를...

이후 3D로 Intracranial 주입 VIVO에서</emMurine Gliomas의> 발광 생물 이미징

미만성 형광 tomography는 잠복기로 높은 걸쳐 상대적으로 저렴한 비용과 잠재적인 접근 방식을...

암 생체 현지화위한 작은 동물의 계산된 Tomography 주 도형 시간 도메인 미만성 형광 Tomography

우리는 누드 마우스 및 이후 일련의 뇌에 인간 glioblastoma multiforme의 세포의 정확한, stereotactic 주입을위한 통합 방법을...

Stereotactic Intracranial 주입 및<em&gt; 생체에</emGlioblastoma의 Multiforme의 마우스 모델 시스템에서 종양 Xenografts의&gt; 발광 생물 이미징

이 비디오에서는 적외선 형광 단백질 또는 iRFP를 발현하기 위해 신경교종 세포를 유전적으로 조작하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 형광 태그가 지정된 신경교종 세포는 뇌종양의 발달을 이해하기 위한 심층 조직 이미징에 유용합니다.

신경교종 세포의 형광 라벨링: 심부 조직 이미징을 위해 형광 단백질을 발현하는 신경교종 세포를 얻기 위한 렌티바이러스 벡터 기반 형질주입 방법

이 비디오에서는 마우스 모델에서 형광 단백질이 태그된 교모세포종 이종이식편의 생체 내 이미징을 위한 형광 분자 단층 촬영 또는 FMT에 대해 설명합니다. 이 기술은 분자 수준에서 항종양 치료제의 효과를 밝히는 데 유용합니다.

형광 분자 단층 촬영: 마우스 모델에서 형광 단백질 태그가 지정된 교모세포종 이종이식편의 생체 내 이미징을 위한 이미징 기술

출처: Clark, AJ, et al. 교모세포종에 대한 면역적격 동물 모델의 생물발광 영상. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 루시페라아제 발현 종양 세포와 루시페린을 사용하여 종양 성장을 비침습적으로 정량화하는 면역 적격 마우스 모델에서 교모세포종 진행을 추적하기 위한 생물 발광 이미징을 보여줍니다.

교모세포종에 대한 면역적격 마우스 모델의 생물발광 이미징

우리는 종양의 성장하는 동안 재생에 일반적으로 생물 물리학 적 제약 조건을 되풀이되었습니다의 intravital 두 광자 현미경을위한 마우스에서 대뇌 피질의 소성을 glioblastoma의 모델을 설립했다. 종양 위의 두개골을 대체 만성 유리 창에는 두 개의 광자 현미경에 의해 시간이 지남에 따라 종양의 진행을 추적 할 수 있습니다.

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

GL261 신경교종 세포는 교모세포종의 유용한 면역 역량 동물 모델을 제공합니다. 이 프로토콜의 목표는 생체 내 생물 발광 이미징을 사용하여 두개내 종양 성장을 모니터링하기 위한 적절한 기술을 시연하고, 종양 면역학 연구를 위한 루시페라제 변형 GL261 세포의 유용성 및 교모세포종 치료를 위한 면역 요법 접근법을 검증하는 것입니다.

교 모세포종에 대한 면역 적격 동물 모델의 생물 발광 영상

여기 우리가 사용 발광, x 선, 그리고 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 이미징 공부 어떻게 억제 mTOR 활동 영향이 종이 식 모델에서 골 engrafted 발성 종양. 이로써 순수 관련, 비-침략 적, 및 복합 요법 골 engrafted 발성 종양에서 vivo에서대상의 안티 발성 효과의 분석.

다 발성 골 수 Xenografts 노 그 쥐에서의 복합 발광 및 양자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 영상

우리는 마우스 모델에서 형광 표지된 산화철 나노입자를 교모세포종에 전달하는 종양 전달에 대한 이광자 현미경에 대한 새로운 접근 방식을 제시합니다.

쥐 모델에서 교모세포종의 Two-Photon Intravital Microscopy

배우세요 형광 분자 단층 촬영(FMT)을 활용한 교모세포종 비침습적 실시간 영상화 방법. 이 기술은 종양 진행과 치료 반응을 정량적으로 평가하여 뇌종양 생물학 연구에 활용됩니다.

Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영

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