마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

이 방법은 활액에서 직접 중간엽 줄기세포를 정제하는 절차를 제공함으로써 줄기세포 분야의 분류 프로토콜에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 토끼 활액에서 MACS를 분리하고 정제하기 위한 간단하고 경제적인 프로토콜을 확립했다는 것입니다. 일반적으로 연구에서는 이 방법으로 인해 세포 집단의 플루팅이 단일 세포 현탁액 생성에 의존하기 때문에 많은 노력을 기울입니다.

우리는 현재 FDA에서 임상 적용을 위해 자기 활성화 세포 분류 방법만 승인되었다는 사실을 알게 되었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 동물 마취와 함께 이 절차를 시작합니다. 토끼의 무릎에서 관절 활액을 채취하려면 무릎 주위로 약 5 x 5cm 크기의 부위를 선택합니다.

이 부위 주변의 토끼털은 안전 전기 면도기를 사용하여 면도합니다. 또는 포비돈 요오드 용액과 75% 에탄올로 시술 부위를 3회 소독합니다. 그런 다음 영역이 완전히 건조된 후 멸균 커튼을 적용합니다.

멸균 피하 주사기를 사용하여 1-2ml의 등장성 식염수 용액을 측면 관절 공간에서 무릎 관절 구멍으로 주입합니다. 무릎을 3-4회 움직인 다음 실온에서 모든 활액을 흡인합니다. 40미크론 나일론 셀 스트레이너를 통해 활액을 여과하여 4시간 이내에 이물질을 제거합니다.

토끼 SF-MSC를 배양하려면 여과된 유체를 50ml 원심분리 튜브에 수집하고 실온에서 10분 동안 1, 500rpm으로 원심분리합니다. 원심분리 후 상등액을 버리고 펠릿을 PBS로 세척합니다. 펠릿을 완전한 배양 배지로 재현탁시킨 후 배지를 100ml 접시에 플레이트화합니다.

산화탄소가 37%인 가습된 분위기에서 섭씨 5도의 접시를 배양합니다. 48시간 후, 접시에 새로운 배지를 보충하여 부착되지 않는 세포를 제거합니다. 배지를 일주일에 두 번, 2주 동안 Passage Zero로 교체하십시오.

초기 도금 후 14일이 지나면 배양 접시에 많은 군체가 형성되어야 합니다. 직경이 2mm보다 큰 콜로니를 선택합니다. 접시 바닥에서 둘레를 추적하여 선택한 군체가 있는 위치를 표시합니다.

너비가 2mm 미만인 군체는 세포 스크레이퍼를 사용하여 폐기합니다. 클로닝 실린더를 사용하여 선택한 콜로니를 약 5마이크로리터의 0.25%트립신으로 분해하고 콜로니를 새로운 접시로 옮겨 통과시킵니다. 세포가 약 80% 포화도에 도달하면 배지를 흡인합니다.

그런 다음 각 접시에 0.25%트립신 EDTA를 1-2밀리리터 첨가합니다. 세포가 분리될 수 있도록 접시를 2-3분 동안 배양합니다. 세포가 분리되면 트립신을 비활성화하기 위해 동일한 양의 배양 배지를 추가합니다.

40미크론 세포 여과기에 세포 현탁액을 통과시키고 15ml 튜브에 여과액을 수집합니다. 그런 다음 실온에서 10분 동안 600배 G로 셀을 스핀다운합니다. MACS Running Buffer에서 셀 펠릿을 다시 중단합니다.

자기 라벨링을 수행하려면 혈구계를 사용하여 세포 수를 확인하십시오. 섭씨 4도에서 10분 동안 300배 G로 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상등액을 완전히 흡인시킨 후 총 1,000만 개의 세포당 80마이크로리터의 재현탁 완충액을 추가합니다.

총 1,000만 개의 세포에 대해 단클론 항토끼 CD90 항체와 결합된 20마이크로리터의 마이크로비드를 추가합니다. 튜브에서 마그네틱 비드와 셀을 골고루 혼합합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 어둠 속에서 15분 동안 배양합니다.

튜브에 1,000만 개의 세포당 1밀리리터의 완충액을 첨가한 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 300배 G로 원심분리하여 세포를 세척합니다. 원심분리 후 상층액을 폐기하십시오. 펠릿을 1,000만 개의 세포당 500마이크로리터의 완충액에 재현탁합니다.

기둥 날개가 앞쪽에 있는 기둥을 자기 분리기의 자기장에 놓습니다. 자기 분리기 컬럼을 천만 개의 셀당 500마이크로리터의 버퍼로 헹굽니다. 단일 세포 현탁액을 컬럼으로 옮깁니다.

음성 세포가 자기장을 통과하여 레이블이 지정되지 않은 세포를 버리도록 합니다. 1,000만 개의 세포당 500마이크로리터의 버퍼로 컬럼을 1-2회 세척하고 플로우 스루를 폐기합니다. 컬럼을 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

열에 1,000만 개의 세포당 1ml의 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 즉시 플런저를 컬럼에 밀어 넣어 자기 라벨링된 셀을 씻어냅니다. 두 번째 자기 분리기 컬럼으로 앞서 언급한 절차를 반복하여 CD90 양성 세포의 순도를 높이면 용리된 분획을 농축할 수 있습니다.

세포 현탁액을 300배 G에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 흡인하고, 펠렛을 배양액으로 재현탁합니다. 자기 활성화 세포 분류 후 100ml 접시에 세포를 접종합니다. 섭씨 37도의 가습 셀 인큐베이터에서 이산화탄소가 5%인 접시를 배양합니다.

1차 배양의 80-90% 합류가 달성되면 약 7-10일에 부착 세포를 0.25% 트립신 EDTA로 소화하고 1-2 희석으로 2 계대를 만들어 2 계대를 만듭니다. 동일한 방법을 사용하여 세포를 in vitro assay에 사용할 수 있는 3번 계대에 전달합니다. 여기에 표시된 것은 도립 현미경으로 MACS 전후의 단층 배양 토끼 SF-MSC의 형태입니다.

분류하기 전에, 부착성 토끼 활액 세포 집단은 이질성을 나타냅니다. 여기에는 타원형, 장방추형, 짧은방추형, 성상형태 등 다양한 세포 유형과 크기가 포함되어 있습니다. 2 통과 6 통로의 주요 형태는 방추 형태학입니다.

CD90을 사용한 MACS에 따라 세포 집단은 균질한 형태를 나타냅니다. 하위 배양을 통해 세포 수가 증가합니다. 유세포 분석 결과 토끼 SF-MSC 세포가 MSC 마커 CD44 및 CD105에 대해 양성인 것으로 나타났습니다.

내피 세포 마커 CD34 및 조혈 세포 마커 CD45에 대해서는 음성입니다. 그 결과, MACS 이전에 토끼 SF-MSC 집단은 약 40%MSC 세포로 구성되었습니다. MACS 이후, 농축된 모집단은 99% 이상의 MSC 세포를 함유했습니다.

여기에 표시된 것은 MAC 분류 전과 후의 CD90 양성 마커에 대한 유세포 분석 분석입니다. Alizarin Red 염색은 3주 동안 골형성 유도 하에 광물화된 결절이 형성되었음을 입증했습니다. 3주간의 지방생성 유도 후, 지질이 풍부한 액포의 축적은 세포 내 오일 레드 O 염색에 의해 검출되었습니다.

몇 주간의 연골 생성 유도 후, 세포 펠릿을 Toluidine Blue 염색으로 조직학적으로 분석했습니다. 양성 산성 프로테오글리칸(proteoglycan)은 연골세포와 같은 세포를 특징지었습니다. 유도 3주 후, 조골세포 마커, 지방형성 마커 및 연골형성 마커의 상대적 mRNA 발현이 검출되었습니다.

이 기술을 숙달하면 2시간에서 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 뉴질랜드 흰 토끼 활액에서 중간엽 줄기 세포의 직접적인 분리와 정제에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 직경이 2ml보다 큰 콜로니를 선택해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

또한 면역자기 분류 전에 단일 세포 현탁액을 생성하는데, 이는 라벨링된 세포에 부착된 원치 않는 세포가 자기 비드에 남아 있기 때문입니다. 이 절차에 따라 중간엽 줄기세포 정제의 안전성과 효능을 다루는 추가 질문에 답하기 위해 형광 활성화 세포 분류와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 관절 연골 재생 분야의 연구자들이 관절 연골 복구에서 이상적인 CD 세포를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

작업은 아치 냉각 벤치에서 수행되었으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 기술의 의미는 관절 연골 손상 치료로 확장되는데, 활액 유래 MASC가 관절 연골 재생에 대한 유망한 후보이기 때문입니다.