Name: 마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 학습하세요 토끼 활액에서 중간엽 줄기세포를 마그네틱 활성화 세포 분류법으로 분리·정화하는 간단하고 경제적인 방법을. 이 기술은 재생의학 연구에 활용될 수 있습니다.

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이 연구는 다음 교부 금에 의해 재정적으로 지원 되었다: 중국의 자연 과학 재단 (No. 81572198; No. 81772394); 심천 대학 (No. 2016031638); 높은 수준의 의료 분야 건설을 위한 기금 광 동성, 중국 (번호의 의료 연구 재단 A2016314); 심천 과학 및 기술 프로젝트 (제 JCYJ20170306092215436; 롤 JCYJ20170412150609690; 롤 JCYJ20170413161800287; 롤 SGLH20161209105517753; 롤 JCYJ20160301111338144)입니다.

모든 동물 실험 지역 윤리 위원회 지침에 따라 실시 했다 그리고 모든 동물성 절차 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 심천 제 2 인민 병원, 심천 대학으로 승인 했다.
1. 격리와 rbSF-MSCs 문화
<ol><li>
동물 절차에 대 한 준비
	<ol>
<li>RbSF의 컬렉션에 대 한 skeletally 성숙 여성 뉴질랜드 백색 토끼를 준비-MSCs. 마 취와 arthrocentesis 절차 전에 어느 날 토끼의 임상 시험 수행. 참고: 검 무게 (2.0-2.5 k g), 성별 (여성), 고 체온, 호흡 속도 심장 박동을 포함 해야 합니다. 임상적으로 건강 한 토끼에 대 한 매개 변수 간격 있으며 호흡 속도 대 한 30-50 분, 심장 박동에 대 한 220-280 분 38-39 ° C 온도 대 한.</li>
		<li>동물 마 취 전에 6 h에 대 한 빠른.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
준비 및 동물 마 취에 대 한 절차
	<ol>
<li>감 금 소를 가진 토끼를 억제 ( 재료의 표참조), 다음 3 %pentobarbital 나트륨 전신 마 취에 대 한 1 mL/kg의 복용량에 한계 귀 정 맥에 주사 하 고.</li>
		<li>토끼 편안한 휴식 등 쪽 위치에 놓습니다.</li>
		<li>마 취 동안 토끼의 체온, 심장 박동, 호흡 속도 모니터링 합니다.</li>
		<li>그것의 눈에 안과 연 고를 사용 하 여 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해.</li>
		<li>Guedel의 분류14다음 마 취의 깊이 평가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MSCs 절연 및 재배에 대 한 준비
	<ol>
<li>RbSF-MSCs를 육성, 상업 문화 매체의 500 mL 준비 보충 ( 재료의 표참조) 10% 상업 보충 ( 재료의 표참조), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 그리고 1% 페니실린-스.</li>
		<li>물 욕조에 37 ° C에서 배양을 품 어.</li>
		<li>세포 분리 및 세포 세척에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 500 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>무릎 구멍 arthrocentesis 절차에 대 한 100 mL isotonic 식 염 수 솔루션의 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
토끼의 무릎에서 관절 활 액 흐름이 uid의 컬렉션
	<ol>
<li>크기는 무릎 주위에 지역 약 5 x 5 cm를 선택 하 고 안전 전기 면도기를 사용 하 여이 영역에서 토끼 머리를 면도.</li>
		<li>또는 소독 절차 사이트 3 povidone 요오드 솔루션 및 75% 에탄올 x. 영역은 완전히 말린 후, 무 균 커튼 적용.</li>
		<li>3-4 x, isotonic 식 염 수 솔루션을 사용 하 여 살 균 피하 주사기 (2 mL), 측면 관절 공간에서 무릎 관절 구멍으로 무릎을 이동 1-2 mL를 주사 하 고 실 온에서 모든 활 액 액체를 빨 아.</li>
		<li>4 h 이내 어떤 파편 든 지 제거 하 40 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 synovial ﬂuid를 필터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RbSF-MSCs의 문화
	<ol>
<li>50 mL 원심 분리기 튜브에 실 온에서 10 분 원심 1500 rpm에서 필터링 된 ﬂuid를 수집 합니다.</li>
		<li>원심 분리 후에 상쾌한 삭제, PBS 가진 펠 릿을 세척, 완전 한 문화 매체와 펠 릿 resuspend 그리고 접시 100mm 요리에서 매체.</li>
		<li>37 ° c 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 요리를 품 어.</li>
		<li>48 h 후 어떤 비 부착 한 세포를 제거 하는 신선한 매체와 요리를 보충. 대체 매체 통로 0 (P0)으로 2 주 동안 일주일에 두 번. 참고: 약 1 × 104 부착 셀을 하 고 있어야 합니다. SF에서 가능한 셀/ml은 약 2 × 102/mL.</li>
		<li>14 일 후 초기 도금 따르고, 많은 식민지 문화 요리에서 형성 해야한다. 직경에서 2 m m 보다 큰 식민지를 선택 합니다. 선택 된 식민지 접시 바닥에 그들의 둘레를 추적 하 여 위치를 표시 합니다.</li>
		<li>식민지 < 2 폭 mm, 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 삭제 합니다. 복제 실린더를 사용 하 여 0.25 %trypsin 약 5 µ L로 선택 된 식민지를 소화 하 고 통과 1 (P1)로 새로운 접시에 식민지를 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수술 동물 치료
	<ol>
<li>수술 후 모니터링 및 마 취에서 회복 기관 표준 운영 절차를 따르십시오.</li>
		<li>의식 회복 될 때까지 10 분 마다 토끼의 생체 신호를 모니터링 합니다. 마지막으로, 의식 동물 케이지 전송. 그것은 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사를 수술을 겪고 있다 토끼를 반환 하지 않습니다.</li>
		<li>후 작업, 0.1 %povidone 요오드, 2 3 일 동안 하루 x 사이트를 소독.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CD90 긍정적인 자기 활성화 셀 정렬 (맥) rbSF-MSCs 및 주 문화
<ol><li>
샘플 준비
	<ol>
<li>80 %confluency, 매체, 발음 한 다음 0.25%의 1-2 mL을 추가 셀 주위에 도달 하는 때 각 요리에 트립 신-EDTA.</li>
		<li>셀 분리 수 있도록 2-3 분 요리를 품 어.</li>
		<li>세포 분리는 일단 비활성화는 트립 신 문화 매체의 동일한 금액을 추가 합니다.</li>
		<li>40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 통과, 15 mL 튜브에 여과 액을 수집 하 고 실 온에서 10 분 600 × g에서 셀 아래로 회전.</li>
		<li>버퍼를 실행 하는 맥에서 셀 펠 릿 resuspend (PBS, pH 7.2, 0.5% 소 혈 청 알 부 민와 2 mM EDTA) 및 셀 수를 계산 하는 다음.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마그네틱 라벨 참고: 자기 활성화 셀 정렬 열, 서, 및 구분 기호 ( 자료의 표참조)를 포함 하는 키트 rbSF-MSCs를 정렬 합니다.<ol>
<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 300 × g에서 세포 현 탁 액을 원심 완전히는 상쾌한 발음.</li>
		<li>107 총 셀 당 물의 resuspension 버퍼의 80 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>107 총 셀에 대 한 단일 클로 널 항 토끼 CD90 항 체로 활용 하는 microbeads의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 15 분 동안 4 ° C에서 그들을 품 어 다음 자석 구슬 및 셀 튜브에 균등 하 게 섞는다.</li>
		<li>튜브, 107 셀 당 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 셀을 씻어 4 ° C에서 10 분 동안 300 × g에서 원심. 원심 분리 후에 상쾌한 폐기.</li>
		<li>107 셀 당 버퍼의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
자력 분리
	<ol>
<li>장소는 열 열 자석 분리기의 자기장으로 앞에 날개.</li>
		<li>107 셀 당 버퍼의 500 µ L 자석 분리기 (MS) 열을 씻어.</li>
		<li>열에 단일 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 이러한 레이블이 셀을 삭제 하는 자기장을 통과 하는 부정적인 세포를 하자.</li>
		<li>107 셀 당 열 버퍼의 500 µ L 1-2 x를 세척 하 고 흐름을 통해 삭제.</li>
		<li>원심 분리기 튜브 (15 mL)에 열을 전송 합니다.</li>
		<li>107 셀 당 버퍼의 1 mL는 열을 추가 하 고 즉시에 자석으로 레이블이 지정 된 셀에 밖으로 플러시 열에 플런저를 밀어.</li>
		<li>CD90의 순도 높이기 위해 두 번째 MS 열 상기 절차 반복+ 세포, eluted 분수의 질을 높일 수 있습니다.</li>
		<li>10 분 동안 300 × g에서 세포 현 탁 액을 원심, 상쾌한, 발음 그리고 문화 매체와 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화는 CD90의+ rbSF-MSCs
	<ol>
<li>마그네틱 활성화 된 세포 분류 후 100 mm 접시에 셀을 예방.</li>
		<li>5% CO2습도 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 요리를 품 어.</li>
		<li>주 문화의 합류 점 80-90% 달성, 약 7-10 일 때 0.25% Trypsin EDTA와 통로와 부착 세포 소화 통로 2 (P2)을 1:2 희석에 그들.</li>
		<li>통과 셀 통로 3 (P3), 체 외에서 분석 실험을 위해 사용 될 수 있는 동일한 메서드를 사용 합니다. 참고: 하위 문화 정화 후 약 1 x 107 rbSF-MSCs 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. rbSF-MSCs의 식별
<ol><li>
Cytometry에 의해 rbSF MSCs의 표면 표식 확인
	<ol>
<li>MSCs P3에 80-90% 합칠 때, PBS로 세포 세척 하 고 0.25%의 1 mL와 함께 그들을 치료 트립 신-EDTA. 그런 다음 셀 분리 될 때까지 2-3 분 동안 37 ° C에서 MSCs 품 어.</li>
		<li>PBS의 10 mL를 사용 하 여 셀을 수확, 원뿔 튜브 (15 mL)에 그들을 전송 하 고 실 온에서 5 분 동안 300 × g에서 원심.</li>
		<li>supernatants 삭제 합니다. PBS의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 1.5 mL 튜브에 그것을 전송.</li>
		<li>FITC 활용 및 PE 활용 된 항 체의 (isotype, FITC CD34/PE CD45, FITC CD105/PE CD44) 4 ° c.에 어둠 속에서 1 시간에 1: 100 희석을 품 어</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 300 × g에이 혼합물을 원심 고 PBS로 두 번 셀 때마다 5 분 300 × g에서 원심 분리 하 여 세척. supernatants 삭제 합니다.</li>
		<li>PBS의 500 µ L에 셀 resuspend, 라운드-하단 튜브 (5 mL)에 세포 현 탁 액 전송 및 교류 cytometer를 사용 하 여 분석. 참고: 두 개의 형광 채널을 갖춘 cytometer에서 데이터 수집: 533/30 고 585/40. 각 isotype 형광에 isotype 컨트롤을 사용 하 여 적절 한 레이저 전압을 조정 하 고 피크의 왼쪽 및 오른쪽 가장자리를 표시 하는 형광 막대 그래프를 얻을 하는 데 필요한 최소 강도 설정 합니다. 통계 분석에 대 한 10000 이벤트의 최소를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RbSF-MSCs의 multidifferentiation 참고: 사용 P3 rbSF-MSCs는 생체 외에서 multidifferentiation 분석 실험에 대 한.<ol>
<li>
Osteogenic 차별화
		<ol>
<li>Osteogenic 유도 매체 준비: DMEM basic (1x) L-아 스 코르 빈 산-2-인산 염, α-glycerophosphate의 10 m m 100의 50mm 포함 dexamethasone의 nM.</li>
			<li>6 잘 조직 문화 접시에 103 셀/c m2 에서 셀 씨 고 osteogenic 유도 매체에 문화.</li>
			<li>3 주 동안 3 일 마다 유도 매체를 변경 합니다.</li>
			<li>분화가 완료 된 후 실 온에서 30 분 동안 4% 포름알데히드와 셀을 수정, 셀 얼룩 5 분, 그리고 다음 세척 그들 3에 대 한 1% 알리자린 레드 PBS15x.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Adipogenic 차별화
		<ol>
<li>Adipogenic 유도 매체 준비: DMEM basic (1 x) indomethacin의 100 m m, 재조합 인간 인슐린의 10 mg/mL, dexamethasone의 1 m m와 0.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine의 구성 된.</li>
			<li>Adipogenic 유도 매체에 3 주 동안 P3 rbSF-MSCs를 취급 합니다.</li>
			<li>3 주 후, 기름 빨간 O를 사용 하 여 adipogenic 차별화를 확인 하는 중립 지질 그들을 얼룩. 실 온에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 셀을 수정 하 고 그들을 씻어 다음 PBS163 배.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Chondrogenic 차별화
		<ol>
<li>Chondrogenic 유도 매체 준비: DMEM basic (1 x)으로 구성 된 TGFβ1, 1%의 10 ng/mL의 그것의 보충, L-프롤린, 100 nM dexamethasone의, 나트륨 pyruvate의 L-아 스 코르 빈 산-2-인산 염, 및 1 m m의 50mm의 0.35 m m.</li>
			<li>펠 릿 chondrogenic 유도 배양을 사용 합니다. 5 × 105 P3 rbSF-MSCs는 펠 릿을 형성 하는 폴 리 프로필 렌 튜브 (15 mL)에서 10 분 1500 rpm에서 원심</li>
			<li>Chondrogenic 유도 매체와 3 주 동안 알 약을 문화.</li>
			<li>3 주 동안 3 일 마다 매체를 변경 합니다.</li>
			<li>3 주 유도 후 파라핀으로 셀 펠 릿을 포함, 4 m m 조각으로 섹션 및 0.1%를 사용 하 여 얼룩 톨루이 블루 실내 온도17시 30 분.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
총 RNA 추출 및 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석
	<ol>
<li>분리 상업 RNA 적 출을 사용 하 여 3 주 분화 유도 후 세포의 총 RNA 키트 ( 재료의 표참조).<ol>
<li>문화 접시에 있는 문화 매체를 제거 하 고 격리 시 약의 1 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>솔루션은 동 질 때까지 반복 pipetting으로 세포를 lyse. 3 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.</li>
			<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 lysate를 전송할.</li>
			<li>클로 프롬의 100 µ L을 추가 하 고 손으로 15 x, 그것을 흔들어 3 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.</li>
			<li>4 ° c.에 15 분 동안 12000 × g에서 관을 원심 새로운 1.5 mL microcentrifuge 관으로는 supernatants 전송.</li>
			<li>소 프로 파 놀의 500 µ L을 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 RNA 침전.</li>
			<li>12000 × g에서 원심 분리기는 10 minat 위한 4 ° c. RNA 펠 릿은 튜브의 맨 아래에 표시 되어야 합니다.</li>
			<li>제거는 상쾌한 고 75% 에탄올 500 µ L를 추가 합니다. 짧게 RNA 펠 릿을 세척을 몇 초 동안 튜브를 회전 합니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 7500 × g에서 원심</li>
			<li>잔여 에탄올을 제거 합니다.</li>
			<li>DEPC 물 10 µ L에서 RNA 펠 릿을 녹이 고 얼음에 튜브를 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>반대로 cDNA DNA 합성으로 총 RNA 녹음 키트 ( 재료의 표참조). 참고: 얼음에 모두 다음 절차를 수행 합니다.<ol>
<li>반전 녹음 방송 마스터 믹스를 준비 합니다.</li>
			<li>RNA의 1 µ g 각 튜브를 DNase 취급 RNA의 25 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>PCR 열 cycler를 사용 하 여 다음과 같은 온도에서 혼합물을 품 어: 26 ° C (anneal 하 임의 hexamers 수 있도록) 10 분, 45 분 (반전 녹음 방송)와 75 ° C 10 분 (비활성화는 역전사) 42 ° C.</li>
			<li>즉시 분석 정량 실시간 PCR에 의해 결과 cDNA 또는-20 ° c.에 그것을 저장합니다</li>
		</ol>
</li>
		<li>실시간 정량 PCR 시스템과 유전자 표정 분석을 수행 합니다.<ol>
<li>QRT-PCR 주인 혼합 사용 ( 재료의 표참조) PCR을 수행 하. GAPDH, Runx2, Agg를 가진 PCR 뇌관은 표 1에 나열 됩니다.</li>
			<li>유전자 발현 2−ΔΔCT 메서드를 사용 하 여 계산 합니다.</li>
			<li>표준 통계 소프트웨어를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다. 독립 표본 t-검정을 사용 하 여 그룹 방법 비교.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

활 액 액체에 MSCs의 존재 휴대에 기초를 둔 치료에 대 한 대안을 제공합니다. 이전 연구 부상 사이트 후 부상 기간5와 긍정적으로 상관 될 수 있습니다 그들의 활 액 액체에 중간 엽 줄기 세포의 높은 금액을 포함 나타났습니다. 활 액 액체에 MSCs 부상18,19후 자연 치유 향상을 위한 조직에 도움이 될 수 있습니다. 문학에서 SF MSCs의 임상 적용 거의 적용 되었습니다 주로 하기 때문에 관절에 SF MSCs의 메커니즘 남아 정의 되지 않은20. 존스 외. 21 보고는 무릎 관절에 hSF-MSC 숫자는 크게 7-fold 증가 관절염 (OA)의 초기 단계. 그들은 증가 SF MSCs 관절의 생리 적 항상성 유지에 기여할 수 있는 생각.
<p class="jove_con...

MSCs 연골 병 변을 위해 특히 재생 의학에 대 한 귀중 한 소스 제안 되어 있다. MSCs, chondrocytes, osteoblasts, adipocytes, 골격 myocytes 및 내장 stromal 세포를 포함 하 여 광범위 하 게 그들의 높은 확장 속도 멀티 혈통 차별화 잠재적인1인해 줄기 세포 이식에 대 한 영역을 확장 합니다. MSCs는 골격 근육, 막, 골 수 및 지방 조직2,,34에서 격리 될 수 있습니다. 결과 또한 conﬁrmed 활 액 액체에서 MSCs의 존재 그리고 이전 연구는 관절 재생5,6유망한 후보자로 활 액 액체 파생 MSCs (SF-MSCs)를 발견 했다.
그러나, 연구와 임상 실험 인간의 샘플에 많은 윤리적 문제에 적용 됩니다. 대신, 토끼 고 가장 일반적으로 사용 되는 동물 종 MSCs의 이식 연골 손상을 복구할 수 있습니다 설명 하기 위해 계속. 최근 몇 년 동안, 연구원의 증가 수는 토끼 중간 엽 줄기 세포 (rbMSCs) 모두 공부 생체 외에서 그리고 vivo에서이 세포는 그들의 세포질 생물학 및 조직 생리학에서 인간의 비슷합니다 MSCs. 마찬가지로, rbMSCs는 인간의 MSCs에서 스핀 들 섬유 형태를 표시 하는 플라스틱 표면에 고착 할 수 있다. 또한, 토끼 중간 엽 샘플 간단 하 고 쉽게7을 얻을 수 있다. 또한, 가장 중요 한 포인트는 rbMSCs CD44, CD90, CD105, 등 표면 마커를 표현 하 고 기준으로 MSC 인구의 식별에 대 한 동의 잠재적인 다중 계보 차별화 유지 되는 세포 치료8,9에 대 한 국제 사회에 의해 정의. 특히, synovial 유체 chondroprogenitors 때 TGF-β1, 따라서 그들 phenotypically 관절 연골 재생10,11, 적당 한 셀 소스 만들기에 의해 유도 된 비 hypertrophic chondrogenesis 할 수 있다 12.
그러나, SF MSCs의 절연 탯, 지방 조직, 말 초 혈액 및 골 수를 포함 하 여 다른 조직에서 크게 다르다. 현재, 비록 흐름 cytometry 방법을 사용 하려면 특정 환경 및 매우 비싼 악기13cytometry 및 immunomagnetic 구슬 기반 정렬 정화 및 SF-MSCs의 정렬에 대 한 가장 일반적인 방식입니다.
이 문서는 흰 토끼 뉴질랜드에서 활 액 액체 샘플의 간단 하 고 최소한 침략 적 컬렉션에 대 한 절차를 제공합니다. 절차 동안, rbSF-MSCs 안정적으로 확장 된 생체 외에서 그리고 CD90 긍정적인 자기 비드 기반 절차와 격리. 마지막으로, 프로토콜에는 높은 순도와 수확된 셀 소스에서 생존 MSCs를 구하는 방법을 보여 줍니다.
이 프로토콜에서 격리 rbSF-MSCs는 그들의 형태학, 특정 마커 및 pluripotency 줄기 세포에 대 한 표현에 따라 특징 이다. CD45와 CD34의 표현 부정적인 반면 교류 cytometry 기반 immunophenotyping CD44 및 CD105의 중요 한 긍정적인 표현을 보여준다. 마지막으로, 분석 결과 생체 외에서 rbSF-MSCs에 대 한이 셀의 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 분화를 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 1703</td><td>37°C에서 따뜻하게; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>MesenGro 보충제</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 M1512</td><td>MSC 배양 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>DMEM basic</td><td>Gibco Inc.</td><td>C11995500BT</td><td>MSC 분화 배지</td></tr><tr><td>등장성 식염수</td><td>Litai, 중국</td><td>5217080305</td><td>Cavity 관절 천자 시술 시약</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>PBS, Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Inc.</td> 무함유<td>10099-141</td><td>MSC 배양 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>포비돈 요오드 용액</td><td>광동, 중국</td><td>150605</td><td>살균제</td></tr><tr><td>75 % 에탄올</td><td>Lircon, 중국</td><td>170917</td><td>살균제</td></tr><tr><td>0.25 % 트립신 / EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td>세포 해리 시약</td></tr><tr><td>1% 페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td>MSC의 구성 요소</td></tr><tr><td>중간 MACS 러닝 버퍼</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160112089</td><td>인산염 완충 식염수(PBS), 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2 mMEDTA</td></tr><tr><td>CD90 항체 결합 MicroBeads</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160801456</td><td>자기 활성화 세포 분류용</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>MSC의 구성 요소 연골 생성 분화</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td>MSC의 성분 골 형성 분화</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td>354352</td><td>1%, MSC의 성분 연골 생성 분화</td></tr><tr><td>L-프롤린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607</td><td>0.35 mM, MSC의 성분</td></tr><tr><td>L-아스코르브산-2-인산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 mM, MSCs 연골 생성 분화</td></tr><tr><td>성분 3-isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>0.5 mM, 지방 생성 분화 성분</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>100 mM, 지방 생성 분화 성분</td></tr><tr><td>TGF&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL, MSCs 연골형성 분화</td></tr> <tr><td>및 알파;-글리세롭스페이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6751</td><td>MSCs 골형성 분화</td></tr><tr><td>성분 CD34 다클론 항체, FITC Conjugated</td><td>Bioss</td><td>bs-0646R-FITC</td><td>조혈 줄기세포 마커</td></tr><tr><td>마우스 antirabbit CD44</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA806GA</td><td>Thy-1 멤브레인 당단백질(MSC 마커)</td></tr><tr><td>CD45(단클론 항체)</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA808GA</td><td>조혈 줄기세포 마커</td></tr><tr><td>CD105 항체</td><td>Genetex</td><td>GTX11415</td><td>MSC 마커</td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030</td><td>침전 RNA 추출 유기상</td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>Wenge, China</td><td>61553</td><td>추출물 총 RNA</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>분리 총 RNA</td></tr><tr><td>SYBR 녹색 마스터 믹스</td><td>Takara Bio, 일본</td><td>RR420A</td><td>PCR 테스트</td></tr><tr><td>cDNA 합성 키트</td><td>Takara Bio, 일본</td><td>RR047A</td><td>상보적 DNA로 역 전사</td></tr><tr><td>Alizarin Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td>칼슘 화합물 염색</td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td>연골 조직의 염색</td></tr><tr><td>오일 레드 O 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391L</td><td>지질 액포 염색</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 분리기</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-102</td><td>자기 활성화 세포 분류용</td></tr><tr><td>MultiStand</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-303</td><td>자기 활성화 세포 분류용</td></tr><tr><td>MS 컬럼</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-201</td><td>자기 활성화 세포 분류용</td></tr><tr><td>셀 스트레이너</td><td>FALCON Inc.</td><td>352340</td><td>40 &뮤; M 나일론</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td>세포 계수</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm 접시</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>세포 배양 접시</td></tr><tr><td>미세 원심분리기 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>RNA 추출 및 PCR</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91050</td><td>감마 멸균</td></tr><tr><td>고속 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>원심분리기</td></tr> 셀 <tr><td>이산화탄소 셀 인큐베이터</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>Real-Time PCR 기기</td><td>Life Tech</td><td>QuantStudio</td><td>Real-Time 정량 중합효소 연쇄 반응</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>세포 분석기</td></tr><tr><td>피펫터</td><td>Eppendorf</td><td>O25456F</td><td>액체</td></tr><tr><td>클로닝 실린더</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3983-50EA</td><td>개별 세포 식민지 분리 및 선택</td></tr><tr><td>멸균 피하 주사기</td><td>Double-Dove, 중국</td><td>131010</td><td>관절 천자 절차</td></tr><tr><td>토끼 케이지</td><td>Zhike, 중국</td><td>ZC-TGD</td><td>토끼 억제</td></tr></tbody></table>

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 세포 기반 치료에 대 한 주요 셀 소스. 관절 강 활 액 액체에서 MSCs 연골 조직 공학에 잠재적으로 사용할 수 있었습니다. 활 액 액체 (SF-MSCs)에서 MSCs 간주 되었습니다 관절 재생을 위한 유망한 후보자 그리고 그들의 잠재적인 치료 혜택 했다 그들 중요 한 연구 주제를 늦게. 뉴질랜드 백색 토끼의 무릎 구멍에서 SF-MSCs 인간의 재생 의학을 평가 하는 최적화 된 변환 모델로 사용할 수 있습니다. CD90 기반 자석 활성화 된 셀 정렬 (맥) 기술을 통해이 프로토콜 성공적으로 토끼 SF-MSCs (rbSF-MSCs)이 토끼 모델에서 가져오고 더 완벽 하 게 유도 하는 그들을 차별화 하 여 이러한 셀의 MSC 표현 형 보여줍니다. osteoblasts, adipocytes, 그리고 chondrocytes입니다. 따라서,이 방법은 세포 생물학 연구와 간단한 장비 및 절차를 사용 하 여 조직 공학에 적용할 수 있습니다.

고립, 정화, 및 rbSF-MSCs의 문화: 이 프로토콜 맥을 사용 하 여 rbSF-MSCs, MSC 표면 마커 CD90의 식에 따라 분리. RbSF-MSCs의 고립, 정화, 그리고 특성화 및 생체 외에서 문화 프로토콜의 공정 흐름도 그림 1에 표시 됩니다.
마그네틱 활성화 셀 CD90와 (맥)을 정렬 후 셀 형태: 첫째, 맥, CD90 자석 구슬 가진 immunolabel MSCs에 대 한 원심, 후 resuspend precooled 정렬 버퍼의 80 µ L에 107 셀의 최대 고 CD90 자석 구슬, vortexing와 15 분 동안 4 ° C에 외피 다음의 20 µ L를 추가 합니다. 그 후, 셀 ...

이 문서 간단 분리와 뉴질랜드 백색 토끼 활 액 액체에서 중간 엽 줄기 세포의 정화에 대 한 간단 하 고 경제적인 프로토콜을 제공합니다.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

이 방법은 활액에서 직접 중간엽 줄기세포를 정제하는 절차를 제공함으로써 줄기세포 분야의 분류 프로토콜에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 토끼 활액에서 MACS를 분리하고 정제하기 위한 간단하고 경제적인 프로토콜을 확립했다는 것입니다. 일반적으로 연구에서는 이 방법으로 인해 세포 집단의 플루팅이 단일 세포 현탁액 생성에 의존하기 때문에 많은 노력을 기울입니다.우리는 현재 FDA에서 임상 적용을 위해 자기 활성화 세포 분류 방법만 승인되었다는 사실을 알게 되었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 동물 마취와 함께 이 절차를 시작합니다. 토끼의 무릎에서 관절 활액을 채취하려면 무릎 주위로 약 5 x 5cm 크기의 부위를 선택합니다.이 부위 주변의 토끼털은 안전 전기 면도기를 사용하여 면도합니다. 또는 포비돈 요오드 용액과 75% 에탄올로 시술 부위를 3회 소독합니다. 그런 다음 영역이 완전히 건조된 후 멸균 커튼을 적용합니다.멸균 피하 주사기를 사용하여 1-2ml의 등장성 식염수 용액을 측면 관절 공간에서 무릎 관절 구멍으로 주입합니다. 무릎을 3-4회 움직인 다음 실온에서 모든 활액을 흡인합니다. 40미크론 나일론 셀 스트레이너를 통해 활액을 여과하여 4시간 이내에 이물질을 제거합니다.토끼 SF-MSC를 배양하려면 여과된 유체를 50ml 원심분리 튜브에 수집하고 실온에서 10분 동안 1, 500rpm으로 원심분리합니다. 원심분리 후 상등액을 버리고 펠릿을 PBS로 세척합니다. 펠릿을 완전한 배양 배지로 재현탁시킨 후 배지를 100ml 접시에 플레이트화합니다.이산화탄소가 37%인 가습된 분위기에서 섭씨 5도의 접시를 배양합니다. 48시간 후, 접시에 새로운 배지를 보충하여 부착되지 않는 세포를 제거합니다. 배지를 일주일에 두 번, 2주 동안 Passage Zero로 교체하십시오.초기 도금 후 14일이 지나면 배양 접시에 많은 군체가 형성되어야 합니다. 직경이 2mm보다 큰 콜로니를 선택합니다. 접시 바닥에서 둘레를 추적하여 선택한 군체가 있는 위치를 표시합니다.너비가 2mm 미만인 군체는 세포 스크레이퍼를 사용하여 폐기합니다. 클로닝 실린더를 사용하여 선택한 콜로니를 약 5마이크로리터의 0.25%트립신으로 분해하고 콜로니를 새로운 접시로 옮겨 통과시킵니다. 세포가 약 80% 포화도에 도달하면 배지를 흡인합니다.그런 다음 각 접

magnetic-activated-cell-sorting-strategies-to-isolate-purify-synovial

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

쥐 MSCS는 대퇴골과 tibias으로부터 격리하고 자기 세포 분류에 의해 풍부하게되었다. 정렬 세포 유동세포계측법에 의해 표면 마커의 표현에 대해 확인했다. 이러한 세포는 하나의 식민지를 형성 clonal 밀도에 교양 있었다 그리고 이들 식민지는 복제 실린더로 구분했다.

분리 및 랫 Mesenchymal 줄기 세포의 농축 (MSCS)와 MSCS를 유래 단일 식민지의 분리

토끼의 무릎 관절 연골 결손의 치료를위한 실험 기법을 설명합니다. 연골 결손에 동종 간엽 줄기 세포의 이식은 조직 공학 분야의 유망한 개발을 제공합니다. 섬유소 세포 혈전의...

섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 주입에 의한 토끼의 무릎 관절의 골 연골 결함의 치료

이 프로토콜은 소화 효소, 밀도 구배 분리, 수지 밀착성 및 CD146 + 자성 비드의 선택을 이용하여, 래트에서 일차 폐 상주 간엽 기질 세포를 얻기위한 분리 기술을 설명한다.

CD146의 분리<sup&gt; +</sup쥐 폐에서&gt; 주민 폐 중간 엽 기질 세포

우리는 유전자 발현 및 콜라겐 분해 활성을 평가하기 위해 쥐 서혜부(피하) 및 성선주위(내장) 지방 조직 저장소에서 기질 혈관 분획(SVF)을 분리하는 데 필요한 기술을 제시합니다. 이 방법에는 면역자기 세포 분리를 사용하여 Sca1고지방 유래 줄기세포(ASC)를 농축하는 것이 포함됩니다.

지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리<sup&gt; 높은</sup&gt; 지방이 유래 줄기 세포 (의 ASC)

미니피그의 활액과 골수에서 분리하고 주사기 흡인을 사용하여 비침습적으로 채취한 중간엽 줄기세포(MSC)를 확립하는 프로토콜이 제시됩니다. 세포 표현형분석은 세포 분리 후 유세포 분석을 사용하여 수행되었으며 MSC에서 유래한 골수 및 활액의 체외 배양을 수행했습니다.

Minipigs의 활액과 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 세포 표현형

줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

여기에서는 3D 바이오리액터를 이용하여 활액 중간엽 줄기세포로부터 다수의 GMP급 엑소좀을 생산하는 프로토콜을 제시합니다.

3D 생물반응기 배양에 의한 활액 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀의 대규모 제조

본 연구는 쥐의 염증성 관절염 조직으로부터 활막 대식세포 및 섬유아세포를 분리하기 위한 수정된 프로토콜을 제공한다.

쥐 관절염 조직에서 Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts의 분리 및 배양

이 연구는 혈관벽 상주 CD34+ 줄기세포(CD34+ VW-SC)의 분리, 배양 및 기능적 결정을 위한 안정적이고 효율적인 방법을 확립했습니다. 이 따르기 쉽고 시간 효율적인 분리 방법은 다른 연구자가 심혈관 질환과 관련된 잠재적 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34+ 줄기 세포의 면역자기 분리

턱뼈 골수에서 채취한 중간엽 줄기세포는 다양한 분화, 자가 재생, 면역 조절에 중요한 기능을 합니다. 그들은 유전자 치료, 조직 공학 및 재생 의학에서 전구 세포의 중요한 저장소로 부상했습니다. 여기에서는 쥐에서 턱뼈 골수 중간엽 줄기세포를 분리하는 독특한 방법을 제시합니다.

Technique for Isolation and Culture of Rat Jaw Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells(쥐 턱뼈 골수 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 기법)

이 프로토콜은 피코에리트린(PE) 표지된 유세포검사 항체와 항PE 미생물구슬을 이용한 자기 구슬 기반 분류 방법을 설명하며, 고가의 세포 분류기나 표적 특이적 맞춤 구슬 없이 고가의 세포 분류기나 표적 맞춤형 비드 없이 고가의 세포 분류기나 표적 특이적 비드 없이 높은 사후 표적 표적 양성률을 가진 특정 중간엽 줄기세포 아군을 분리합니다.

간접 자기 구슬 전략을 이용한 포도플라닌 양성 중간엽 줄기세포 아군의 분리 및 검증

학습하세요 토끼 활액에서 중간엽 줄기세포를 마그네틱 활성화 세포 분류법으로 분리·정화하는 간단하고 경제적인 방법을. 이 기술은 재생의학 연구에 활용될 수 있습니다.

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

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