Name: 단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 학습하세요 인간 혈장 및 혈청에서 단백질 소화, 초여과, 크기 배제 크로마토그래피를 활용한 엑소좀 정제 프로토콜입니다. 비엑소좀 단백질 오염을 최소화하여 정확한 단백체 분석과 바이오마커 발굴이 가능합니다.

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이 연구는 (KMD/NKG)에 CSU (KMD)를, ATCC 계약 #2016-0550-0002 (NIAID HHSN272201600013C의 하청), 그리고 법안과 멜 린다 게이츠 재단 (OPP1039688)에서 내부 자금에 의해 지원 되었다. 우리는 추가 지원에 대 한 콜로라도 주립 대학에서 학부생 (소장) 여름 프로그램에 대 한 NSF 연구 경험 감사합니다.

이 작품을 결정 했다 하지 인간의 주제 연구 초기 검토에서 콜로라도 주립 대학의 기관 검토 위원회 (IRB), 모든 인간의 샘플 Bioreclamation IVT biorepository에서 취소 확인 된 견본으로 가져온 고 했다 IRB 승인 프로토콜에서 수집.
1. 산 큰 소포 및 세포질 파편에 의해 원유 샘플 (플라스마 또는 혈 청)의 준비
참고: 안전 고려 사항: 플라스마, 혈 청, 그리고 다른 생물 학적 체액 유해 재료 이며 장갑 및 실험실 외 투를 포함 하 여 기본적인 개인 보호 장비를 착용 하는 동안 특별 한 관리와 처리 해야 합니다. 생물 학적 샘플 biosafety 내각;에서 처리 되는 것이 좋습니다. 그렇지 않다면, 눈 보호를 사용 하 여 것이 좋습니다.
<ol><li>4 ° C 냉장고에 하룻밤 떨고 비 조건에서 튜브를 배치 하 여 혈 청 또는 혈장 샘플을 equilibrate (중-20에서 또는-80 ° C).</li>
	<li>Aliquot 250 µ L 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 microcentrifuge 튜브에 샘플의.</li>
	<li>4 ° c.에 30 분 18000 x g에서 샘플을 원심</li>
	<li>200 µ L 피 펫을 사용 하 여, 허가 상쾌한의 200 µ L을 제거 하 고 새로운 microcentrifuge 튜브에 추가. 상쾌한 전송 하는 동안 수송과 자료를 하지 마십시오. 수송과 자료를 삭제 합니다.</li>
	<li>Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과, 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 샘플의 단백질 함량을 계량. 분석 결과 수행 하려면 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 1:50 샘플을 희석. 중복에서 각 샘플을 테스트 합니다. 참고: 프로토콜에 걸쳐 1 x PBS를 사용 하 여 달리 명시 하지 않는 한. 평균적으로, 명백 하 게 혈 청 또는 플라스마 (18000 x g) 후의 200 µ L 총 단백질의 15 mg을 얻을 것입니다. 낮은 또는 높은 단백질 콘텐츠, 다른 샘플 형식 추가 BCA 희석 해야 합니다.</li>
	<li>새로운 microcentrifuge 관으로 샘플의 aliquot 10 밀리 그램. 1.5 단계에서 얻은 농도 사용 하 여 계산 하는 샘플의 해당 볼륨. 약 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 샘플 수입니다. 참고: -80 ° c.에 나머지 샘플을 저장 하는 것이 좋습니다. Aliquot 샘플을 피하기 위해 여러 동결-해 동 주기 미래에 튜브 당 10 마그네슘에 다른 튜브에 사용 합니다.</li>
</ol>2. 비 exosomal 혈액 단백질의 소화
참고: 소화 단계는 exosomes와 공동 정화 수 있는 비 exosomal 단백질을 줄이기 위해 설계 되었습니다. 보존 exosome 표면 단백질의 다운스트림 분석에 필요한 경우이 단계는이 분석을 방해 하는 고려 사항으로 취해야 한다. Exosomal CD63, 표면 노출 tetraspanin 단백질의 검출은이 과정에 의해 크게 부정적인 영향을 하지.
<ol><li>PBS에서 500 µ g/mL의 농도에서 가수분해 K 솔루션을 준비 합니다. 원뿔 튜브에 가수분해 K의 해당 금액을 추가 합니다. 그런 다음 버퍼와 30에 대 한 소용돌이 추가 s, 실 온에서 3 배.</li>
	<li>Aliquot 10 mg 샘플을 가수분해 K 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 부드럽게 혼합.</li>
	<li>플 로트 튜브 랙에서 튜브 30 분 장소에 대 한 물 목욕에서 37 ° C에서 샘플을 품 어 하 고 잠재적인 누설을 피하기 위해 물 목욕에서 튜브의 완전 한 침수를 방지.</li>
	<li>가수분해 K. 비활성화를 샘플 및 부동 튜브 랙 10 분 동안 60 ° C 물 목욕을 전송</li>
</ol>3. 작은 단백질 및 펩 티 드 원심 분리기 외에 의해의 제거
<ol><li>린스 사용 하기 전에 PBS와 100 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 필터를 포함 한 장치. PBS의 500 µ L 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 필터를 추가 하 여 이렇게 합니다. eluate 뿐만 아니라 모든 나머지 retentate 5 분 삭제에 대 한 3700 x g에 장치를 회전 합니다. 참고: 한 장치 샘플 볼륨 용량 0.5 mL-4 mL 50 µ L의 최종 감소 샘플 볼륨 달성 되도록 해야 합니다.</li>
	<li>2.4 단계에서 샘플 하 고 PBS를 추가 하 여 500 µ L 볼륨을 증가. 미리 씻어 서 한 장치에 샘플을 플라스틱. 참고: 평균, 샘플 볼륨 단계 2.4에서에서 185 µ L (120 ~ 150 µ L의 샘플 및 가수분해 K 솔루션의 50 µ L)입니다.</li>
	<li>샘플은 50 µ L의 볼륨을 줄일 때까지 4 ° C에서 3700 x g에서 고정 각도 벤치탑 원심 분리기에서 한 장치를 놓습니다. 주의: 죽은 중지 한 장치를 사용할 때 볼륨을 주의 해야 합니다 원심 분리 단계 필터 멤브레인의 완전 한 건조를 피하기 위해.</li>
	<li>직접 필터 막 5 번 위아래로 피 펫에 PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 3.3 단계에서 원심. 이 세척 단계 총 3 번을 수행 합니다.</li>
	<li>새로운 microcentrifuge 튜브에 최종 50 µ L retentate를 전송 합니다.</li>
	<li>200 µ L PBS, 10 번, 위아래로 pipetting으로 필터 막 헹 구 고 단계 3.5에서에서 튜브를 세척을 전송.</li>
	<li>새로운 튜브에서 역 위치에 필터 홀더를 배치 합니다. 2000 x g 막에서 나머지 샘플을 검색에 5 분에 대 한 역방향 회전 복구를 실행 합니다. 수영장 단계 3.5에서에서 샘플 샘플.</li>
</ol>4. 소포 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정화
<ol><li>구슬 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 빈, 출장 중력 흐름 열에 700 kDa의 MWCO 데 초 슬러리의 850 µ L를 추가 합니다. 적절 한 랙 똑 트레이 장착 크기에 열을 배치 합니다.</li>
	<li>칼럼의 하단을 벗기다 하 고 5 분 동안 액체 드레인. 일단 물기, 수 지를 세척 하는 PBS의 10 mL를 추가 합니다. 허용 열에서 세척에 대 일 분.</li>
	<li>집중 배치, 가수분해 K 15 mL 원뿔 튜브에 3.5 단계에서 샘플을 처리 하 고 5 ml 혈 청 학적인 피 펫으로 PBS를 추가 샘플 볼륨을 증가. 1 분 동안 흔들어 하 여 튜브를 부드럽게 혼합 하 고 천천히 단계 4.2 혈 청 학적인 피 펫에서에서 준비 하는 열에 샘플을 적용. 참고: 열의 모자가 제거 되 면 샘플은 통과 수 지 중력; 5 mL 샘플 10 분에 열을 통해 완전히 흐름 것입니다.</li>
	<li>새로운 15 mL 원뿔 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 수집 된 자료 700 kDa 아래 남아 있는 자료를 제거 하려면 다시 수 지 적용 됩니다.</li>
	<li>새로운 15 mL 원뿔 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다. PBS의 1 mL를 두 번 추가 하는 수 지를 세척. 4.5; 단계에서 튜브를 통해 흐름을 수집 총 마지막 볼륨 7 mL 대략 있을 것입니다. 참고: 4.6 단계, 후 샘플 것입니다 희석 약 35 번에서 원래 샘플 볼륨; 다음 단계는 볼륨 하 정화 exosome 샘플을 집중 하십시오.</li>
</ol>5. 정화 Exosomes와 부 총 단백질 량의 농도
<ol><li>3.1 단계에서 설명한 대로 3 kDa MWCO 필터 적용 장치 사용, PBS 전에 린스 합니다.</li>
	<li>한 장치 및 4 ° c.에 3700 x g에서 진동 물통 회전자에 원심 분리기 샘플 단계 4.6에서 추가 버퍼는 필터를 통과 하 고 삭제 될 수 있습니다. 집중된 exosomes 필터 위에 유지 됩니다. 샘플을 원심 필터 (retentate) 위에 볼륨 200 µ L로 감소 될 때까지.</li>
	<li>새로운 microcentrifuge 튜브에는 retentate를 전송.</li>
	<li>10 번 막에 pipetting으로 200 µ L PBS 가진 필터 멤브레인을 헹 구 고 단계 5.3에서에서 튜브를 세척을 전송. 이것은 어떤 잔여 exosome 샘플의 컬렉션에 대 한 허용.</li>
	<li>PBS를 추가 하 여 500 µ L 최대 샘플 볼륨을 가져와. 10 번 위아래로 천천히 pipetting으로 혼합. 참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 샘플 4 ° C 하룻밤 사이에 또는 긴 기간 저장을 위해-20/80 ° C에서 저장 되어야 한다.</li>
	<li>BCA 분석 결과, 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 샘플의 단백질 함량을 계량. 예제 1시 10분과 1:50 PBS에 희석. 중복에서 각 샘플을 실행 합니다. 참고: 혈 청 또는 플라스마의 총 단백질의 10mg에서 시작 해 서, 단계 5.6에서에서 순화 exosomes에 총 단백질 수확량은, 평균, 150 µ g. 추가 희석 해야 경우 혈 청 또는 혈장 샘플 사용 됩니다; yield 샘플 유형으로 달라질 수 있습니다.</li>
</ol>6. 정량화 및 나노 분석 (NTA)를 추적 하 여 Exosomes의 크기 조정
<ol><li>추가 정화 exosomes의 5 µ g (5.6에서 계량) 1 mL의 PBS와 15에 대 한 소용돌이를 낮은 중간 속도에 s.<ol>
<li>1 mL 일회용 주사기에 샘플을 놓습니다. 가능한 경우, 희석된 exosome 샘플 30 µ L/min의 속도로 주입을 설정 하는 자동 주사기 펌프에 주사기를 설정 합니다.</li>
		<li>NTA 측정 비디오 캡처 설정을 사용 하 여 수행: 12-13의 3-4 및 카메라 레벨의 이득 화면.</li>
		<li>30의 최소 3 기술 복제를 실행 하려면 분석 스크립트 정의 지속적인 흐름을 사용 하 여 모든 복제에 대 한 s. 분석을 위해 5에서 캡처 임계값을 설정 합니다. 참고: 비디오 캡처에 대 한 설정과 자동 주사기의 사용에 관한 세부 기준13사용할 수 있습니다. 주권에 대 한 캡처 및 분석 설정을 comparability을 보장 하기 위해 다른 샘플에서 일치 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7입니다. 수용 성 단백질 감소의 결정
<ol><li>SDS 샘플 버퍼에 순화 exosomes의 1-10 µ g을 추가 하 고 수행 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 4-12% 두번째-트리 스 젤을 사용 하 여 1 x MES SDS 200에서 35 분에 대 한 버퍼를 실행에 V. 전송 전압 o를 적용 하 여 니트로 0.2 µ m 막 단백질을 해결 f 50 V 1-1.5 헤 알 부 민, apolipoproteins A 및 B, exosome 마커 CD 63의 존재를 평가 하기 위해 수행 서쪽 오 점 분석을 위한 표준 방법론에 따라. 참고: 7.1에서 메서드에 대 한 전체 프로토콜 참조14;에서 찾을 수 있습니다. 특히, SP007: polyacrylamide 젤 및 SP011의 실행: 서쪽 오 점 프로토콜.</li>
	<li>7.1 단계 에서처럼 페이지를 사용 하 여 순화 exosomes의 10 µ g 하 고 얼룩 단백질 밴드 coomassie 염료를 사용 하 여 단백질 변형 및 샘플 간의 감소를 시각화 하기 위해 다음과 같은 표준 권장 합니다. 참고: 서쪽 오 점 CD63에 대 한 프로토콜에 대 한 자세한 내용은 디아즈 외에 의해 설명 되어 있습니다. 15
</li>
</ol>

<ol><li>Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis+and+functions+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The biogenesis and functions of exosomes.</a> Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

순도 및 혈액에서 exosomes의 수확량을 증가 하는 최적화 된 방법 정확 하 게 여러 가지 질병에 대 한 생체의 원천으로 extracellular 소포 내 능력을 증가할 것 이다. 표준 방법 현재 exosomes, 특히, 분리 하는 데 사용 ultracentrifugation과 강 수 방법, exosome 집계 및 수용 성 단백질7,,17판 몇 가지 단점이 있다 18. 또는, SEC의 사용 exosome 격리, 집계에서 exosomes를 보호 하 고 일반적인 오염 물질 비 exosomal 단백질9,,1118 의 제거 향상에 상당한 개선을 나타났습니다. , <sup class...

Exosomes는 nanovesicles (30에서 크기에 이르기까지 150 nm nm)1,2처리 셀을 통신을 용이 하 게 하는 인체에 거의 모든 세포에 의해 발표. 흥미롭게도, exosomes의 구성 원본 셀 뿐만 아니라 개별3,,45의 건강 상태에 따라 변경합니다. 또한, exosomes에서에서 검색할 수 있습니다 여러 가지 생물 학적 체액과 같은: 타 액, 소변, 혈액2. 이러한 기능 때문에 exosomes 질병 biomarkers의 좋은 원천이 될 여겨진다. 불행히도, exosomes의 격리에 대 한 표준 방법이입니다. 일부 실험실 exosome 격리에 대 한 표준 방법으로 밀도 그라디언트를 사용 하 여 100000 x g에서 최종 고속 단계 다단계 원심 분리를 고려 합니다. 그러나, 최근 연구는 ultracentrifugation exosomes 수용 성 단백질 및 exosome 무결성, 다운스트림 응용 프로그램6,7 방해 수 있습니다 둘 다에 영향을 미치는 이외에 다른 exosomes의 유도 . Exosome 고립의 다른 일반적인 방법 포함, 하지만 제한 되지 않는다: 상업적인 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)에 의해 강 수 기반으로 시 약, 원심 외, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC). 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 고분자를 사용 하 여 상업용 시 약 그들 침전 한 펠 릿을 형성 하 여 exosomes을 풍부. 이 폴리머를 사용 하 여 제한 잔여 말뚝 폴리머와 최종 제품에 수용 성 비 exosomal 단백질의 풍부한 오염 있습니다. 한 원심 하 정화 하 고 셀 룰 로스 막;를 사용 하 여 소포를 집중 활용 exosomes는 필터 위에 작은 불순물 및 다른 단백질 막7,8을 통과 하는 동안 유지 됩니다. 다른 방법 처럼 원심 한 정화 exosomes의 비 exosomal 단백질, 단백질 복합물 및 집계를 포함 하 여 높은 수준의 보존 때문에 제한 된 용량을 하고있다. 마지막으로, 초 정화 분자 크기 별로 분리를 다공성 수 지를 사용 합니다. 초 오염 물질 단백질의 대부분을 캡처하고 중력 또는 저압 시스템7,를 기반으로 하는 고립 exosomal 무결성을 보존 하 여 다른 방법으로 경험이 문제의 대부분을 극복 하는 유망한 결과 보이고 있다 9. 그러나, 초 동안 더 큰 단백질 집계 및 단백질10 의 공동 격리 최종 exosome 준비의 순수성을 영향을 줍니다. 몇 가지 방법이 세포 문화 supernatants 및 플라즈마7, 또는 플라즈마9,11exosome 정화에 대 한 테스트 되었습니다, 혈액을 직접 비교 하는 방법의 성능에 대 한 정보는 플라즈마와 같은 개인에서 혈 청
여기, 우리는 다양 한 소포 농축 기술 플라즈마와 세럼 사이 번역 확인 하려면 워크플로 비교 하 여 exosomes 혈액의 정화에 초점. 나노 분석 및 서쪽 오 점 추적 exosome 농도, 순도, 단백질 구성 최종 제품에서의 차이 척도를 사용 했다. 마지막 방법은,이 프로토콜에 대 한 자세한 소포 번호를 증가 하 고 비 exosomal 단백질 수준을 감소 시킨다. 중요 한 것은, 일반적인 공동 계기 단백질 알 부 민 및 apolipoproteins 등의 급격 한 감소는 보여 줍니다. 피 고는 그들은 공동 정화 exosomes와 다운스트림 분석 기울이기 "순화" 샘플 간의 원인 불일치 하는 주파수에이 두 가지 단백질의 높은 풍부. 이 프로토콜은 상업적으로 사용할 수 있는 초 수 지;의 사용을 포함 수 지는 다공성 구슬 단백질 700 kDa 보다 작은 구슬을 입력할 수 있습니다 구성 된다. 한 번 안쪽으로, 단백질 octylamine 리간드에 의해 유지 됩니다. Exosomes와 700 kDa12보다 큰 분자는 eluate 구성 됩니다. 또한, 단백질 집계 및 구슬 트랩을 피하기 위해 apolipoproteins을 줄이기 위해 우리는 워크플로의 효소 소화 단계는. 현재, 공동 정화 비 exosomal 단백질을 줄이면서 exosome 수익률을 극대화 할 수 없는 하나의 기술이입니다. 이 연구는 여러 복구 및 정화 방법 효소 소화 전처리를 결합 하는 정화 프로토콜 exosome 수율 및 순도 혈액 혈 청 및 혈장에서 증가 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 마이크로 원심분리기&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>Legend Mico21</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기&nbsp;</td><td>벡크만 쿨터</td><td>알레그라 6R</td><td></td></tr><tr><td>워터배스&nbsp;</td><td>벤치마크</td><td>B2000-4</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>THERMO</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 BCA 단백질 분석 키트</td><td>THERMO</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 원심 필터 유닛 Ultracel-100 막</td><td>EMD-Millipore</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 원심 필터 유닛</td><td>EMD-Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>Capto Core 700</td><td>GE 헬스케어</td><td>17548103</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep&nbsp; 크로마토그래피 컬럼</td><td>BIORAD</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 겔</td><td>THERMO</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인, 롤, 0.2 &마이크로; m</td><td>BIORAD</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K,&nbsp; Tritirachium 앨범</td><td>EMD-Millipore</td><td>539480</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>THERMO</td><td>LC6065</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST&nbsp; BCIP/NBT</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>4-Chloro-1-naphthol</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>C6788</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD63 항체 (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary 항체</td><td>SYSTEM BIOSCIENCES</td><td>EXOAB-CD63A-1</td><td>1차 및 2차 항체</td></tr><tr><td>ALB 항체 (F-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-271605</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>apoB 항체 (C1.4)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-13538</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>apoA-I 항체 (B-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-376818</td><td>1차 항체</td></tr></tbody></table>

단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 exosomes의 절연을 최적화 하

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, nanovesicle, 모든 세포 유형에 서 발표의 형식 어떤 신체 유체에서 격리 될 수 있습니다. Exosomes, RNAs, 단백질 등의 내용에서 그들이 파생 되 고 질병의 지시자로 사용 될 수 있는 셀에 독특합니다. Ultracentrifugation를 포함 하 여 몇 가지 일반적인 농축 프로토콜 exosomes 수용 성 단백질 오염 물질와 라덴 항복. 특히, 우리는 발견 혈액 내에서 가장 풍부한 단백질 종종 공동 exosomes와 정화와 다운스트림 proteomic 연구, 혼동 수 있습니다 낮은 풍부한 바이오 마커 후보 식별을 방해. 추가적인 관심사의 비 exosomal 단백질 레벨의 일관성 없는 표현으로 인해 exosome 단백질 정량화의 irreproducibility가입니다. 여기서 설명 하는 프로토콜 공동 exosome 정화 과정을 엄 함 추가, exosomes 함께 정화 비 exosomal 단백질 제거 개발 되었다. 5 개의 메서드 쌍된 혈액 플라스마 및 5 기증자에서 혈 청을 사용 하 여 비교 되었다. 나노 분석 및 마이크로 bicinchoninic 산 성 단백질 분석 결과 추적을 사용 하 여 분석 결합된 프로토콜 적용 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용 하 여 최적의 소포 농축 및 수용 성 단백질 제거 나왔고 밝혔다. 서 부 럽 확인 예상된 풍부한 혈액 단백질, 알 부 민 및 apolipoproteins를 포함 하 여 고갈 되었다 사용 되었다.

아래 데이터는 5 명의 건강 한 혈액 기증자 로부터 쌍된 플라스마와 혈 청 샘플을 사용 하 여 얻은 했다. 그리고 각 처리 단계에의 효과 확인 하려면 제시 프로토콜의 5 개의 변형 수행 했다, exosome 복구 및 비 exosome 단백질 제거 비교 했다. 포함 된 메서드 trialed: 1) SEC 700 kDa + 외 3 kDa; 2) 한 100 kDa; 3) 가수분해 K + 외 100 kDa; 4) 초 700 kDa + 외 100 kDa, 및 5) 성분을 K + 외 100 kDa + 초 700 kDa 외 3 kDa.
샨 다, 초 700 kDa (1, 4, 및 5)를 포함 하는 모든 방법 샘플, 혈 청, 그리고 플라즈마 (그림 1A-B)의 두 종류에서 단백질의 그램 당 ves...

여기, 선물이 exosomes 플라즈마와 비 exosomal 혈액 단백질의 감소 공동 정화와 혈 청에서 순화 하는 프로토콜. 최적화 된 프로토콜 적용, 효소 치료, 및 크기 배타 착 색 인쇄기를 포함 한다. Exosomes 혜택 다운스트림 분석, 소포 및 proteomic 특성의 더 정확한 정량화를 포함 하 여 향상 된 정화.

단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

이 절차의 전반적인 목표는 나노 입자 추적 및 단백질체학을 포함한 다운스트림 분석을 방해할 수 있는 공동 정제 단백질 및 복합체를 줄이면서 혈액에서 소포를 정제하는 것입니다. 이 방법은 건강한 상태와 비교하여 질병 상태 동안 혈청 또는 혈장 소포의 단백질체 변화가 무엇인지와 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소포 계수의 정확도가 향상된다는 것입니다.풍부한 비소포 오염 물질을 제거함으로써 저농도 단백질과 질병의 잠재적인 바이오마커에 대한 식별을 증가시킵니다. 이 방법의 의미는 새로운 진단 바이오마커의 발견으로 확장됩니다. 이를 통해 혈액과 같은 복잡한 매트릭스에서 세포외 소포체의 단백질체 구성을 보다 정확하게 측정할 수 있습니다.일반적으로 소포 정제를 처음 접하는 개인은 발표된 기술이 많기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 다운스트림 단백질체학 분석의 재현성은 풍부한 혈청 단백질의 공동 정제에 의해 영향을 받습니다. 혈청 또는 혈장 샘플을 평형을 이룹니다.튜브를 흔들리지 않는 상태로 섭씨 4도의 냉장고에 밤새 넣어 주십시오.다음 날, 1, 000 마이크로리터 피펫을 사용하여 250 마이크로리터의 샘플을 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다. 18, 000 시간 G에서 섭씨 4도에서 30분 동안 샘플을 원심분리하십시오. 200마이크로리터 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 투명화된 상등액을 제거하고 새 마이크로원심분리기 튜브에 추가합니다.상층액을 옮기는 동안 펠릿 물질을 피하십시오. 제조업체의 프로토콜을 사용하여 BCA 분석으로 샘플의 단백질 함량을 정량화합니다. 분석을 수행하려면 하나의 X 인산염 완충 식염수에 샘플을 1에서 50으로 희석합니다.각 샘플을 중복하여 테스트합니다. 먼저 원뿔형 튜브에 해당 양의 proteinase K를 첨가하여 PBS에서 밀리리터당 50마이크로그램의 농도로 proteinase K 용액을 준비합니다. 그런 다음 버퍼를 추가하고 실온에서 30초 동안 3회 와류를 추가합니다.다음으로, 10mg 샘플 분취액에 50마이크로리터의 proteinase K 용액을 추가하고 200마이크로리터 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 샘플을 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 배양하고 튜브를 플로트 튜브 랙에 놓습니다. 잠재적인 누출을 방지하려면 튜브가 수조에 완전히 잠기지 않도록 하십시오.배양 후 샘플과 랙을 섭씨 60도의 수조로 10분 동안 옮겨 단백질 분해 효소 K를 비활성화합니다.다음으로, 사용하기 전에 PBS로 100킬로달톤 분자량 차단 필터가 포함된 한외여과 장치를 헹굽니다. 1, 000 마이크로리터 피펫을 사용하여 500 마이크로리터의 PBS를 필터에 추가합니다. 5분 동안 G를 3, 700회 회전시킨 후 남아 있는 잔류물과 용리액을 모두 폐기합니다.PBS를 첨가하여 샘플의 부피를 500마이크로리터로 늘립니다. 그런 다음 미리 헹궈진 한외여과 장치에 샘플을 피펫으로 넣습니다. 샘플이 50마이크로리터의 부피로 줄어들 때까지 3, 700배 G 및 섭씨 4도의 고정각 탁상용 원심분리기에서 한외여과 장치를 원심분리합니다.그런 다음 500마이크로리터의 PBS를 필터 멤브레인에 직접 추가합니다. 그리고 이전과 같이 다시 원심분리하기 전에 5번 위아래로 피펫을 만듭니다. 최종 50마이크로리터 잔류물을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.200마이크로리터의 PBS로 필터 멤브레인을 헹구고 위아래로 10회 피펫팅합니다. 그리고 세척을 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 필터 홀더를 새 튜브의 반대 위치에 놓습니다.2, 000배 G에서 5분 동안 역 스핀 복구를 실행하여 멤브레인에서 남은 샘플을 회수합니다. 크기에 적합한 랙에 열을 놓습니다. 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 700 킬로달톤의 분자량 컷오프를 갖는 비드와 함께 850 마이크로 리터의 SEC 슬러리를 추가합니다.컬럼 바닥의 뚜껑을 풀고 액체를 폐기물 용기로 5분 동안 배출합니다. 배수가 완료되면 10마이크로리터의 PBS를 첨가하여 수지를 세척합니다. 세척액이 컬럼에서 배수될 때까지 20분 동안 기다립니다.농축된 proteinase K 처리된 샘플을 15ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 그리고 혈청학적 피펫과 함께 PBS를 첨가하여 시료 부피를 5ml로 늘립니다. 튜브를 1분 동안 흔들어 부드럽게 섞습니다.그런 다음 혈청학적 피펫으로 준비된 컬럼에 샘플을 천천히 적용합니다. 새로운 15ml 원추형 튜브에 플로우 스루를 수집합니다. 수집된 물질을 수지 위에 다시 피펫팅하여 700킬로달톤 미만의 잔여 물질을 제거하고 새로운 15ml 원추형 튜브에 관류를 수집합니다.매번 1ml의 PBS를 추가하여 수지를 두 번 세척합니다. 튜브에 흐름을 수집합니다. 총 최종 부피는 약 7밀리리터가 될 것입니다.이전과 같이 3 kilodalton 분자량 필터로 한외여과 장치를 헹굽니다. 3, 700 시간 G 및 4 섭씨 온도에서 스윙 버킷 로터의 원심 분리기. 버퍼는 필터를 통과하여 폐기할 수 있습니다.농축된 엑소좀은 필터 위에 유지됩니다. 필터 위의 부피가 200마이크로리터로 줄어들 때까지 샘플을 원심분리합니다. 제조업체의 프로토콜을 사용하여 BCA 분석으로 샘플의 단백질 함량을 정량화합니다.PBS 1ml에 정제된 엑소좀 5마이크로그램을 추가합니다. 그리고 낮은 중간 속도에서 15초 동안 소용돌이. 샘플을 1mL 일회용 주사기에 넣습니다.가능한 경우, 희석된 엑소좀 샘플을 분당 30마이크로리터의 속도로 주입하도록 설정된 자동 주사기 펌프에 주사기를 설정합니다. 분석을 위한 스크립트를 정의하여 모든 반복에 대해 일정한 흐름을 사용하여 최소 30초 동안 3개의 기술 반복을 실행합니다. 분석을 위해 캡처 임계값을 5로 설정합니다.마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 가용성 단백질 감소를 결정합니다. 정제된 혈청 소포체의 나노입자 추적 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. 소포 크기는 예상대로 약 100나노미터입니다.여기에 표시된 것은 미처리 혈청, SEC 전후 분획을 비교하여 알부민 및 기타 비소포 오염 물질의 감소를 보여주는 Coomassie 염색 단백질 겔입니다. 웨스턴 블롯(Western blot)은 proteina K 처리 및 정제 후 엑소좀 단백질의 특징인 CD63의 잔류를 나타냅니다. proteinAse K 단계는 수용성 단백질을 소화하도록 설계되었습니다.CD63은 막관통 단백질이며 결정된 농도와 배양 길이에서 proteinase K에 덜 민감합니다. 여기서 웨스턴 블롯은 혈액에서 가장 풍부한 단백질이자 정제 후 일반적인 공동 정제 단백질인 알부민의 고갈을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 6시간 안에 완료할 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 원심분리기 한외여과, 프로테아제 분해 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 생물학적 유체에서 소포를 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 크로마토그래피 및 나노입자 추적 전에 BCA 또는 이와 동등한 기술로 단백질 정량을 수행하는 것이 중요합니다. 단백질 농도가 이 프로토콜에 명시된 농도를 초과하는 경우 결과가 달라질 수 있습니다.생물학적 액체로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑, 실험복 및 보안경을 포함한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 따라 정제된 소포에 포함된 정확한 단백질을 측정하기 위해 액체 크로마토그래피 질량 분석기와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 혈액 소포의 구성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 소변, CSF 또는 세포 배양 상층액과 같은 다른 샘플 유형에도 적용할 수 있습니다.

protein-digestion-ultrafiltration-size-exclusion-chromatography-to

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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엑소 정량화 및 크기 측정을위한 혁신적인 방법

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박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.

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여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

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단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

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