장 술 셀 부동성 마우스 공장 Cryosections에 시각화에 안티 인 girdin 항 체의 사용

이 염색 절차의 전반적인 목표는 마우스 jejunum cryosections에서 tuft cell을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 기생충 감염 중 포유류의 장에서 다발 세포의 증식이 어떻게 일어나는지와 같은 위장병학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조직학적 경험이 제한된 연구자들이 고품질의 터프트 세포 이미지를 얻을 수 있다는 것입니다.

갓 포르말린으로 고정된 쥐 사체의 골반 장기를 노출하는 것으로 시작합니다. 항문에서 직장 끝을 잘라내고, 장간막을 잘라 장과 몸을 분리한다. 제주눔을 분리하기 위해, 위 전방의 항문 쪽에서 4cm 떨어진 곳을 잘라내고, 남은 소장의 항문 절반을 버린다.

세척 절차를 용이하게 하기 위해 제주넘을 반으로 자릅니다. 20ml 주사기에 20%완충된 중성 포르말린 용액 20ml를 넣고 베벨을 제거한 18게이지 직선 바늘을 부착합니다. 그런 다음 잘린 제주넘의 한쪽 끝에서 10% 완충된 중성 포르말린 용액을 주입하여 장 내용물을 씻어내고 장 내강 표면을 고정합니다.

PBS를 주사하여 장 내강을 씻습니다. 그런 다음 PBS를 대체하기 위해 액체 젤라틴 용액으로 씻어냅니다. 6-0 나일론 절단 봉합사를 사용하여 봉합 결찰로 잘린 jejunum의 한쪽 끝을 닫습니다.

제주넘에 액체 젤라틴을 채우고 봉합사 결찰로 반대쪽 끝을 닫습니다. 다음으로, 제주눔의 길이에 걸쳐 4개의 봉합사 매듭을 묶습니다. 조직을 10% 완충된 중성 포르말린 용액에 15% 자당 50ml에 넣고 섭씨 4도에서 밤새 담그십시오.

다음날, 봉합사 매듭에서 제주눔을 잘라 양쪽 끝이 연결된 소시지 같은 제주넴 조각 3개를 얻습니다. 조각을 cryomold에 정렬한 다음 임베딩 컴파운드로 덮습니다. 액체 질소로 냉각된 이소펜탄에서 극저온 몰드를 스냅 동결합니다.

제주눔 절편을 준비하려면 먼저 저온 유지 챔버 온도와 물체 온도를 모두 섭씨 영하 22도로 설정합니다. 냉동 조직 블록을 저온 유지 챔버의 극저온 몰드에 최소 15분 동안 놓습니다. 15분 후 면도날로 블록을 반으로 잘라 제주눔의 가로 부분이 드러나도록 합니다.

블록의 절반을 저온 유지 장치 어댑터에 장착합니다. 젤라틴으로 채워진 제주넘을 30미크론 두께의 섹션으로 나눕니다. 얼린 집게를 사용하여 35ml의 PBS가 들어 있는 3mm 배양 접시에 절편을 부드럽게 옮깁니다.

PBS-T 3ml로 각 5분씩 3회 세척한 후, 자유롭게 떠다니는 섹션이 들어 있는 접시에 갓 준비한 항원 회수 용액 3ml를 추가합니다. 그런 다음 뚜껑을 닫고 비닐 테이프 스트립으로 접시와 뚜껑 사이의 틈을 밀봉하고 섭씨 50도의 혼성화 인큐베이터에서 흔들지 않고 3시간 동안 배양합니다. 면역 염색 후 PBS에서 염색된 부분의 접시를 실체 현미경으로 옮깁니다.

200마이크로리터의 PBS를 MAS로 코딩된 흰색 유리 슬라이드 중앙에 있는 물방울에 놓습니다. 그런 다음 P200 피펫 팁을 사용하여 접시의 제주넘 섹션 하나를 액적으로 옮깁니다. 단면 정렬을 조정한 후 단면 주위에 남아 있는 모든 PBS를 흡인합니다.

20마이크로리터의 수성 장착 매체를 추가하고 매체 위에 커버 슬립을 놓습니다. 자일렌 기반 장착 매체로 커버 슬립 가장자리를 즉시 밀봉하고 컨포칼 현미경 검사를 시작하기 전에 2-3시간 동안 건조시킵니다. 제주눔의 젤라틴 충전은 둥근 디스크 모양을 보존하고 융모의 직립 위치를 유지합니다.

젤라틴 충전이 없으면 제주날 섹션이 꼬이는 경향이 있어 융모가 뒤로 스윙할 수 있습니다. pY1798은 막, 스풀 모양의 소마의 세포질, 강하게 염색된 내강 팁을 포함한 전체 다발 세포를 재현 가능하게 묘사하며, 여기서 강력한 신호 응축은 다발 세포의 돌출된 다발에 해당합니다. Phalloidin은 장내 브러시 경계를 형성하는 미세 융모에 존재하는 사상체 액틴에 대한 친화력이 높습니다.

Phalloidin은 다발에서 뻗어 나온 뿌리 덩어리에 해당하는 두꺼워진 덤불 테두리를 재현 가능하고 눈에 띄게 표시합니다. pY1798 신호와 두드러지게 두꺼워진 팔로이딘 양성 브러시 경계의 일관된 공동 국소화는 이 프로토콜이 융모에 있든 crypt에 있든 관계없이 다발 세포를 성공적으로 식별한다는 것을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3일 안에 완료할 수 있습니다.

저방출점 젤라틴, 자유 부유 극저온 절편 및 저온 항원 검색의 조합은 다른 프로젝트 조직의 면역 염색에 적용할 수 있습니다.