Name: 장 술 셀 부동성 마우스 공장 Cryosections에 시각화에 안티 인 girdin 항 체의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 배우세요 마우스 공장 절편에서 술 셀을 시각화하는 면역형광 염색법을. pY1798 항체를 사용하여 술 셀 증식을 연구하고 위장관 감염 동안 세포 역학을 분석하는 데 활용할 수 있습니다.

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나고야 대학에서 요코타 나 오 유야 아 사이 부동성 공장 섹션에 대 한 낮은 온도 항 검색의 개발에 대 한 유용한 제안을 제공 하는 감사 합니다. 이 작품 지원 연구비에 의해 Scientific Research (KAKENHI) (C) 2012 (JP25460493)와 (B) 일본 사회 과학의 승진 (JSP)에 대 한 2017 년 (JP17H04065), A 단계 부여 2014 (AS251Z02522Q) 및 2015 년 (AS262Z00715Q)에서 일본 과학 기술 기구 (JST)와 다케다 비전 연구 (석사)에 다케다 과학 재단에서 부여 2014.

여기에 설명 된 모든 방법 동물 관리 및 사용 발달 연구, 아이치 휴먼 서비스 센터에 대 한 연구소의 위원회에 의해 승인 되었다 (출원 번호: M-03).
1입니다. 준비
<ol><li>10 L 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 준비: 32.27 g Na2HPO4·12H2O, NaH2포4·2H2O, 4.5 g의 NaCl의 80.0 g 실 온 (RT)에서 10 L. 저장소 솔루션의 최종 볼륨을 초순에 추가.</li>
	<li>PBS-t: 200 mL의 PBS의 단계 1.1에서에서 polyoxyethylene(10) octylphenyl 에테르의 100 µ L 0.05% (vol:vol)의 최종 농도에 200ml를 준비 합니다. 실시간에 저장소</li>
	<li>장갑과 눈 보호를 입고, 하는 동안 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액에 15% 자당의 50 mL 준비: 자당 10%에 추가의 7.5 g을 50 mL의 최종 볼륨 중성 포 르 말린 솔루션 (자료 테이블) 버퍼링. 실시간에 저장소 주의: 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액에 포름알데히드와 흡입 또는 피부 또는 눈 접촉 위험 수 있습니다. 신중 하 게 처리 합니다.</li>
	<li>200 단위/mL phalloidin 형광 염료 어원이 재고 솔루션의 1.5 mL를 준비: phalloidin 형광 염료 켤레 (1 유리병, 동결 건조 된 고체, 여기 및 방출 파장 300 단위: 581 및 609 nm, 각각)의 1.5 mL에 메탄올입니다. -20 ° c.에 어둠 속에서 저장소 솔루션</li>
	<li>준비 5 mg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) 재고 솔루션: N, N-dimethylformamide (DMF) 2 mL에 DAPI 10 밀리 그램. -20 ° c.에 어둠 속에서 저장소 솔루션</li>
	<li>5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에서 준비: 0.5 g, BSA의 PBS의 10 mL. 4 ° c.에 게</li>
	<li>집게를 사용 하 여 18-게이지 바로 바늘의 경사진된 끝을 제거 하 고 액체 바늘 루멘 (그림 1A1)을 통해 흐름을 수 있도록 세로 방향으로 핀 처와 물린된 끝을 꼬집어. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
</ol>2. 동물 해 부와 공장의 절연
<ol><li>마우스의 관류 고정<ol>
<li>장갑을 착용 하 고 통풍이 잘되는 지역에서 작동.</li>
		<li>100 mL 유리 비 커를 준비, 10% 중성 포 르 말린 솔루션, 수술 도구 (가 위, 집게), 금속 트레이 버퍼링, 6-0 나일론 봉합, 1.7, 같이 준비 18 게이지 바로 바늘 22 게이지 날개 달린된 바늘, 20 mL 주사기.</li>
		<li>20 mL 주사기에 유리 비 커에서 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액 20 mL를 로드 하 고 콘센트에 연결할 22 게이지 날개 달린된 바늘.</li>
		<li>50 mL 원심 분리기 튜브에서의 PBS (최종 5% 젤라틴) 20 mL에 젤라틴 가루 1 g을 추가 하 여 액체 젤라틴을 준비 합니다. RT에 15 분 동안 몸을 담근 채, 후 동요 없이 15 분 동안 물 목욕에서 50 ° C에서 품 어.</li>
		<li>짧게 소용돌이, 그리고 또 다른 15 분 완전히 젤라틴 분해 50 ° C에서 품 어. 사용까지 RT에 튜브를 둡니다.</li>
		<li>자 궁 경부 전위에 의해 성인 마우스를 안락사.</li>
		<li>금속 쟁반에 단계의 2.1.6 마우스를 놓고 수술 도구를 사용 하 여 ensiform 연골을 통해 피부에 작은 절 개를 하 게 합니다.</li>
		<li>흉부와 복 부 지역 노출 양손으로 절 개를 확장 합니다.</li>
		<li>노출 횡 경 막, 복 막 열고 양쪽에 다이어 프 램을 엽니다.</li>
		<li>흉부 새 장 양쪽 모두 앞쪽 axillary 라인을 따라 잘라 다음 마음을 노출 thymus의 위치에서 가로 방향으로 절단 하 여 흉 벽을 제거 합니다.</li>
		<li>혈액을 배수 하 고 좌 심 실의 꼭대기에 22 게이지 날개 달린된 바늘을 삽입 하는 오른쪽 아 트리 움의 auricle에 작은 절 개를 확인 합니다. Perfuse 버퍼 10% 중성 포 르 말린 솔루션으로 조직에 플런저를 밀어.</li>
		<li>골반에 장기 노출 후, 항문에서 직장의 끝을 잘라 하 고는 mesentery를 절단 하 여 시체에서 내장을 분리 합니다.</li>
		<li>공장을, 4cm 위 동굴의 항문 쪽에서에서 내장을 잘라. 나머지 소장의 항문 절반을 삭제 합니다.</li>
		<li>반 물 내리는 절차를 촉진 하기 위하여 공장을 클립. 부하 20 mL의 10% 중성 포 르 말린 용액 20 mL 주사기에 버퍼링 고 18 게이지 바로 바늘 단계 1.7 콘센트에서에서 준비를 연결 합니다.</li>
		<li>잘린된 공장 장의 내용을 제거 하 고 창 자 루멘 표면 (그림 1A2)를 해결 하기 위해의 한쪽 끝에서 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 솔루션을 주입.</li>
		<li>2.1.15 단계에서 설명한 대로 PBS를 주입 하 여 창 자 루멘을 씻어.</li>
		<li>2.1.15 액체 젤라틴 PBS 바꿉니다 단계에서 설명한 대로 창 자 루멘에 액체 젤라틴을 플러시.</li>
		<li>6-0 나일론을 사용 하 여 봉합 결 찰에 의해 잘린된 공장의 가까이 한쪽 잘라 봉합 하 고 액체 젤라틴 공장 채울 봉합 결 찰 (그림 1A3)에 의해 반대쪽 끝을 닫습니다.</li>
		<li>Cryomold (그림 1A4)의 우울된 부분에 소시지 모양의 공장 섹션에 맞게 4 봉합 사 매듭을 추가 합니다. 참고: cryomolds는 20 m m x 25 m m x 5 m m 우울된 섹션으로,에 대 한 ~ 20 밀리미터 소시지 같은 공장 섹션이 바람직합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 하룻밤 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액에 15% 자당의 50 mL에 조직을 담근 다 참고: 이러한 단계 젤라틴 및 조직의 포 르 말린에 의해 자당 및 단백질 고정 하 여 cryoprotection을 확인합니다. 실시간에 고정 되지 않은 gelatinized 젤라틴 4 ° C에서 녹는 반면 말린 gelatinized 젤라틴 RT에 녹여 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 젤라틴 가득 공장 조직의 스냅
<ol><li>봉합 사 매듭에 공장을 잘라서 출혈 양쪽으로 3 개의 소시지 같은 공장 조각 (그림 1A4) 얻을 수 있습니다. 소시지와 같은 조각 포함 동결된 조직 표본의 준비에 대 한 화합물의 추가 대 한 cryomold에 맞춥니다.</li>
	<li>스냅 동결에 액체 질소로 냉각 isopentane cryomold. Cryomolds-80 ° C에서 저장 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
</ol>4. 면역 형광이 술의 부동성 Cryosections를 사용 하 여 세포
<ol><li>Cryosectioning<ol>
<li>-22 ° c cryostat 챔버 온도 (CT) 및 개체 온도 (OT)를 설정 장소 냉동된 조직 적어도 15 분 동안 cryostat 챔버에 cryomold에서 차단 합니다.</li>
		<li>35 m m 문화 접시에 PBS의 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>cryomold에서 냉동된 조직 블록을 제거 하 고 공장의 횡 근 섹션 노출 면도날으로 반 블록을 잘라. 탑재 한 척 (cryostat 어댑터) 절단 평면 면도날을 섹션에 블록의 절반.</li>
		<li>섹션 30 µ m 두께 섹션으로 젤라틴 가득 공장. 사용 고정 집게를 부드럽게 준비 단계 4.1.2 (그림 2B오른쪽)에서 35 m m 문화 접시에 섹션을 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 차 항 체의 응용<ol>
<li>각 상호 통에 가벼운 떨고와 3 mL PBS-T와 함께 5 분에 대 한 3 회 35 m m 문화 접시에 부동성 섹션을 세척 (약 36 회 / 분).</li>
		<li>Antigen 검색 솔루션 준비: 초순 2.7 mL에 항 원 검색 솔루션 집중 (자료 테이블)의 0.3 mL. 부동성 섹션을 포함 하는 35 m m 문화 접시에 항 원 검색 솔루션의 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>뚜껑을 닫고, 접시와 뚜껑 비닐 테이프의 스트립 사이의 간격을 밀봉 하 고 동요 하지 않고 3 h에 대 한 교 잡 인큐베이터에서 50 ° C에서 품 어.</li>
		<li>인큐베이터를 20 분에 대 한 RT에서 멋진 요리를 제거 합니다. 비닐 테이프를 제거 후 씻어 3 시간 5 분 동안 각 3 mL와 함께 PBS-T와 온화한 동요의 섹션.</li>
		<li>PBS-T 발음을 섹션에 차단 솔루션 (자료 테이블)의 5 방울을 추가 합니다. 온화한 동요와 함께 5 분 RT에서 품 어.</li>
		<li>1 차적인 항 체 솔루션 준비: 인 Y1798 (pY1798) girdin 항 체 (자료 테이블)의 5 µ L와 PBS에서 5 %BSA 495 µ L. 1 차적인 항 체 (차단 솔루션이 필요 하지 않습니다 제거) 섹션에 솔루션의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>부 화 습도 챔버에 접시를 놓고 가벼운 떨고와 4 ° C에서 밤새 품 어. 참고: 하룻밤 외피는 최대 3 박에 확장할 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이차 항 체의 응용<ol>
<li>워시 3 번 5 분 동안 각 3 ml에서 PBS-T 가벼운 진동의 섹션.</li>
		<li>희석된 DAPI 재고 솔루션을 준비: DAPI 재고 솔루션 (단계 1.5), PBS의 998 µ L의 2 µ L.</li>
		<li>이차 항 체 솔루션: PBS, 희석된 DAPI 솔루션, phalloidin-형광 염료 어원이 재고 솔루션의 12.5 µ L, 염소-토끼 IgG-형광 염료 켤레의 1 µ L의 10.5 µ L에에서 5 %BSA 476 µ L (파장: 여기 496 nm, 방출 520 nm).</li>
		<li>PBS-T 발음, 후 이차 항 체 솔루션을 적용 하 고 온화한 떨고와 30 분 RT에서 빛 차폐 인큐베이션 챔버에 품 어.</li>
		<li>3 시간 5 분 동안 각 3 mL와 함께 PBS-T와 온화한 동요의 섹션을 씻어.</li>
		<li>최종 세척 후 PBS-T를 제거 하 고 polyoxyethylene(10) octylphenyl 에테르 부족 PBS의 3 mL을 바꿉니다. 입체 음향 현미경에 접시를 전송.</li>
		<li>장소 200 µ L의 PBS P200 피펫으로 팁을 사용 하 여 작은 물방울에 접시에서 매스 코팅 흰색 유리 슬라이드와 이전 한 공장 섹션의 중앙에 작은 물방울에서.</li>
		<li>입체 현미경 섹션 맞춤 조정 후 섹션을 둘러싼 모든 나머지 PBS 발음.</li>
		<li>수성 설치 미디어의 20 µ L을 추가 하 고 미디어 꼭대기 20 x 20 m m coverslip 장소.</li>
		<li>즉시 크 실 렌 기반 설치 미디어와 함께 coverslip 가장자리 물개. 나무 mappe에 슬라이드를 놓고 2-3 h에 대 한 RT를 공고히 자일 렌 기반 설치 미디어를 허용 합니다. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 자일 렌 기반 설치 미디어 굳은 후 슬라이드 실시간에 빛 차폐 슬라이드 상자에 2-3 주 동안 저장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. confocal 현미경 검사 법
<ol><li>공초점 현미경의 63 X 목표에 집중 기름을 넣어. Coverslip 슬라이드를 거절 하 고 무대에 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>레이저 파장 405, 488, 555 nm, 인수 TC 이미지를 디지털화 하 고 tiff 형식 (.tiff) 이미지를 저장 합니다. 참고: 형광 염료에 대 한 적절 한 검색 필터 세트를 선택 (즉, 여기/방출 맥시 마: 358/461 nm, 490/525, 및 590/617).</li>
</ol>

<ol><li>Kuga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+an+actin-binding+protein+Girdin+specifically+marks+tuft+cells+in+human+and+mouse+gut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut.</a> J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).</li>
<li>Jarvi, O., Keyrilainen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+cellular+structures+of+the+epithelial+invasions+in+the+glandular+stomach+of+mice+caused+by+intramural+application+of+20-methylcholantren%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pathol+Microbiol+Scand+Suppl%22%5BJournal%5D)">On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren.</a> Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).</li>
<li>Enomoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt%2FPKB+regulates+actin+organization+and+cell+motility+via+Girdin%2FAPE%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE.</a> Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).</li>
<li>Asai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+phenotypes+of+Girdin+germ-line+and+conditional+knockout+mice+indicate+a+crucial+role+for+Girdin+in+the+nestin+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage.</a> Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+VEGF-mediated+angiogenesis+by+the+Akt%2FPKB+substrate+Girdin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin.</a> Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Girdin+is+an+intrinsic+regulator+of+neuroblast+chain+migration+in+the+rostral+migratory+stream+of+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain.</a> J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).</li>
<li>Nahorski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCDC88A+mutations+cause+PEHO-like+syndrome+in+humans+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">CCDC88A mutations cause PEHO-like syndrome in humans and mouse.</a> Brain. 139 (Pt 4), 1036-1044 (2016).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21954290">Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration.</a> Science signaling. 4 (192), ra64(2011).</li>
<li>Omori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Girdin+is+phosphorylated+on+tyrosine+1798+when+associated+with+structures+required+for+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration.</a> Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).</li>
<li>Goto, H., Inagaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+site-+and+phosphorylation+state-specific+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).</li>
<li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+phallotoxin%2C+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li>
<li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+sensitive+antigen+retrieval+method+for+free-floating+and+slide-mounted+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections.</a> J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).</li>
<li>Feltkamp-Vroom, T. M., Boode, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+embedding+and+sectioning+technique+for+immunohistochemical+studies+of+minute+specimens+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">An embedding and sectioning technique for immunohistochemical studies of minute specimens of tissue.</a> J Clin Pathol. 23 (2), 188-189 (1970).</li>
<li>Ushida, K. <a target="_blank" href="http://www.nibb.ac.jp/pamtbr/?active_action=repository_view_main_item_detail&page_id=15&block_id=15&item_id=1787&item_no=1">Pre-embedding technique with low melting temperature gelatin for preparation of histological sections.</a> Proceeding of the Annual Meeting on Technologies in Biological Research. 36, 66-69 (2014).</li>
<li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft+cells%2C+taste-chemosensory+cells%2C+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜은 술 셀 (TCs)의 신뢰할 수 있는 이미지를 얻기 위해 조직학 경험 없이 연구를 허용 하도록 설계 되었습니다. 이 프로토콜은 3 개의 중요 한 포인트: 1) 사이트 및 인 산화 상태 특정 토끼 polyclonal 항 체의 티로신 1798 (pY1798 항 체)에 phosphorylated 인간 girdin에 대 한 특정 회사 (에서 가져온 된 사용 Immuno-Biological 실험실 회사 X =); 2) 젤라틴 작성 공장; 그리고 3) 저온 항 원 복구. 넓은 의미에서 인 산화 상태 특정 항 체의 포스트 번역 상 수정 (예: acetylation 이나 메 틸 화, 인 산화)의 특정 유형을 인식 수정-특정 항 체로 분류 될 수 있다는 특정 한 아미노산 잔류물에 단백질입니다. 오모리 외. 회사 X는 공동 phosphorylated 펩 티 드와 토끼를 면역 하 고 다음 이동의 방법9, unphosphorylated 펩타이드와 고체 상 크로마토그래피를 사용 하 여 결과 항 체를 순화 하 여 pY1798 항 체를 생성 10. pY1798 항 체/티로신 17989점 돌연변이 없이 전체 길이 인간의 girdin 식 벡터를 사용 하 여 인 산화 분석 생체 외에서 집중적으로 검증 했다. 그 후, Kuga 연구진이 발견 회사 X에서에서 pY1798 항 체 장 TCs1의 구체적이 고 민감한 마커. 따라서, 회사 X에서에서 pY1798 항 체의 포함이이 프로토콜에서 중요 한 포인트 이다.
젤라틴 동물의 조직에서 추출한 콜라겐을 포함 하 고 오래 조직화 학적인 연구 cryosections13를 사용 하 여 조직 표본을 포함 하는 데 사용 되었습니다. 4 ° C에서 gelatinized 하지만 상 온에서 녹는 다, 낮은 녹는 포인트 젤라틴14를 포함 하는 동안 액체 상태에 젤라틴을 유지 하는 데 필요한 열의 부작용을 피하기 위해 적용 하기 시작 했다. 이 프로토콜에서 낮은 녹는 포인트 젤라틴 4 ° C에서 gelatinizes RT에서 녹는 젤라틴 파우더에서 만든 마우스 공장의 가로 cryosections의 형태를 유지 하기 위해 사용 되었다. 이 젤라틴을 완전히 공장을 채우기 위해 사용 되었다 때 샘플 다음 포 르 말린-고정 했다 돌이킬 수 없는 젤라틴을 달성 하기 위해. 열 유도 항 원 복구 알데하이드를 포함 하는 fixatives12의 복 면 된 항 원 노출 하는 효과적인 방법입니다. 그러나, 고온 (30 분 동안 95-99 ° C) 일반적으로 파라핀 섹션의 분석에 사용 되는 복잡 한 조직/젤라틴의 형태를 손상 수 있습니다. 여기 우리는 항 원 검색 및 조직의 형태학의 보존을 허용 하는 낮은 온도 항 원 복구 (50 ° C 3 h)를 사용 합니다.
pY1798 항 체는 마우스 공장 뿐만 아니라 생쥐와 인간1에서 여러 기관 (위, 회장, 콜론, 및 쓸 개)에서 TCs 레이블을 수 있습니다. 그러나, 어떤 조직에서 떼어낸된 조직에서 pY1798 신호 저하 빠르게 됩니다 때문에이 프로토콜 포함 공장 루멘에 말린 주입 (단계 2.1.15., 그림 1A2).
부동성 cryosections의 두께와 관련 된 제한이 있습니다. 얇은 cryosections 현미경 검사 법에 대 한 반투명 측면에서 유리한 될 수, 있지만 두께 게이 섹션 육체적으로 취약. 대조적으로, 두꺼운 cryosections 육체적으로 튼튼한, 하지만 낮은 항 체 침투성 섹션으로. 이 프로토콜에서 30 µ m 두께 섹션 사용 되었다 육체적 안정 및 항 체에 융 화 했다. 프로토콜 실패 해야 하는 경우이 방법은 조직학, 광범위 한 경험 없이 연구자에 대 한 설계 되었습니다, 비록 구가 외 에서 사용 하는 유사한 섹션 pY1798/villin/DAPI 트리플 파라핀의 얼룩 1수행된 될 수 있습니다. 파라핀 섹션 했다 phalloidin F-말라 파라핀 섹션에서의 얼룩과 관련 된 어려움을 피하기 위해 여기 사용 되지 않습니다.
티로신-1798 girdin에 인접 한 아미노산 시퀀스의 보존 때문에 pY1798 항 체 마우스, 쥐, 인간을 포함 한 다른 종에서 TCs를 얼룩에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 되는 젤라틴 작성 또한 다른 빈 기관에 대 한 적용할 수 있습니다. 실제로, pY1798, TC, 저온 항 원 복구와 함께 작성 하는 젤라틴의 조합 그리고 악명에 마우스, "어려운" epitopes를 공개 하는 데 유용 수 있습니다 결과적으로, 많은 연구자에 대 한 관심이 있을 수 있습니다.
Girdin의 생물학 역할 및 TCs에 그것의 인 산화의 의미는 명확 하지 않습니다. 그러나, 린 외에 의해 연구 제안 그 티로신 인 산화 girdin의 F-말라 합8의 학위와 관련. 한편, Kuga 연구진이 발견 그 치명적인 apoptosis inducers의 복용량 (예., cisplatin, x 선 방사선) 연결 될 수 있습니다 그들은 가상 마우스 소장에서 TCs의 상대 주파수에서 큰 증가 발생는 가능 enterocytes에서에 변환 TCs, microvilli1girdin의 인 산화와 동기화. 이 가능성은 미래에 추가 조사가 필요 합니다. 최근 급속 한 관찰 3 그룹 기생충 감염15,,1617다음 TC 주파수에서 증가. 따라서,이 부동성 얼룩 뿐만 아니라 인간의 용기 라고 수집 조직, 분석에 사용 될 수 있지만 TC 축적 수 또한 인간의 창 자에서 기생충 감염의 진단에 도움이 됩니다.

술 셀 (TCs)는 꼭대기 tufts 및 스풀 모양 somas1특징은 위장 epithelia의 사소한 흩어져 요소입니다. TCs 처음 19562에 설명 했다, 비록 TC 기능은 부분적으로 신뢰할 수 있는 TC 마커의 부족 불분명 남아 있습니다.
에노모토 외. 먼저 girdin3, 혈관, 심장 판 막, 힘 줄, 그리고 골격 근육4같은 비 신경 조직에서 뿐만 아니라 신 경계 표현 말라 바인딩 단백질 특징. Girdin의 유전 제거와 쥐 성장 지체와 여러 뇌 변칙4,,56을 표시합니다. 한편, 손실의 기능 돌연변이 인간 girdin에 진보적인 뇌 질환, 심한 지체, 및 이른 개시 간 질 발작7와 연결 됩니다.
2011 년에 린 외. 티로신 tyrosine kinases EGFR 및 Src8등으로 중재 하는 1798에서 girdin의 동적 인 산화 발견. 그들은 또한 phosphorylated girdin 셀 마이그레이션8트리거를 개장 하는 걸 필요는 보여주었다. 오모리 연구진이 개발 사이트-그리고 인 산화 상태 특정 항 체에 대 한 인간의 girdin 티로신 1798 (pY1798 항 체) 고토의 프로토콜 다음에 phosphorylated 사이트 감독 mutagenesis의를 사용 하 여 항 체 확인 식 운반 전체 길이 girdin9,10벡터 스 2017 년, 구가 외. 그 pY1798는 높은 특이성 및 높은 감도1TCs 라벨을 보고 했다. PY1798 항 체는 우수한 착 색 속성을 밝혀 아직 특성 lumenal 끝에 ' 술'을 포함 하 여 전체 셀 모양 girdin의 생물학적 역할 기반 이전 TC 표식에 우수한 고 tc에서 인 girdin를 표시 했다 함수에는 불분명 한1남아 있었다.
이 연구에서 설명 하는 방법을 포함 한다 얼룩, 조직학 기술 표시 대상 단백질에 대 한 1 차적인 항 체와 형광 활용 된 이차 항 체에 대 한 기본 사용 하 여 조직에서 특정 단백질에 면역 형광 검사를 항 체입니다. 이 방법의 목적은 높은 품질 TC 이미지를 얻기 위해 조직학 경험 연구 수 있도록입니다. 이 프로토콜은 부동성 cryosections cryosections 슬라이드 마운트에 대 한 필요 또는 파라핀 섹션을 사용 합니다. 그러나, 무료-부동 섹션은 깨지기 쉬운 유리 슬라이드에서 지원의 부재로 인해 고 섹션 두께 항 체 침투성을 줄일 수 있습니다. 이 프로토콜 포함 되어 이러한 문제를 극복 하는 두 가지 방법: 1) 얼룩 절차에 걸쳐 무료-부동 섹션의 형태를 보존 하는 젤라틴과 전체 공장 루멘 작성 및 저온 항 원 검색을 사용 하 여 2) pY1798 신호를 강화.

<table><tbody><tr><td>Slc:DDY 6주 된 암컷 마우스</td><td>Chubu Kagaku Shizai</td><td>해당</td><td></td>없음</tr><tr><td>Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O)</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O</td><td>Wako</td><td>199-02825</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Wako</td><td>199-10665</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100,&nbsp; 폴리옥시에틸렌(10) 옥틸페닐 에테르</td><td>카타야마 케미컬</td><td>해당</td><td></td>없음</tr><tr><td>자당</td><td>Wako</td><td>190-00013</td><td></td></tr><tr><td>10% 완충 중성 포르말린 용액</td><td>Muto Chemical</td><td>20215</td><td>단계 1.3.</td></tr><tr><td>팔로이딘-형광 염료 접합체, Alexa Fluor 594 팔로이딘</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21915-35</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌, 디하이드로클로라이드)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>N.N-디메틸포름아미드(DMF)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>13015-75</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A9647-10G</td><td></td></tr><tr><td>18 게이지 스테인레스 스트레이트 바늘</td><td>테루 모</td><td>NN-1838R</td><td></td></tr><tr><td>U.S.P. 6-0, 60cm 나일론 컷 봉합사, Crownjun</td><td>코노 제작소</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>22 게이지 날개 바늘</td><td>테루 모</td><td>SV-22DLK</td><td></td></tr><tr><td>20mL 테루</td> 모 주사기 <td>테루 모</td><td>SS-20ES</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원심 분리기 튜브</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>15mL 이와키 원심분리기 튜브</td><td>이와키</td><td>2325-015</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 마이크로 시험관</td><td>Star</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 분말, Gelare-blanc</td><td>Nitta Biolab</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>냉동 조직 표본용 임베딩 컴파운드, O.C.T. 컴파운드 118mL 12개</td><td>Sakura FineTech</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125개, 웰 크기 20 x 25 x 5(mm)</td><td>Shoei Work's</td><td>1101-3</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26404-75</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 세포 배양 접시 35 x 10mm Easy-Grip</td><td>Corning</td><td>353001</td><td></td></tr>원 <tr><td>회수 용액 농축액, 표적 회수 용액 pH 9 10x</td><td>Dako</td><td>S2367</td><td>항원 회수 용액 농축액(단계 4.2.2</td></tr>).<tr><td>단백질 블록</td><td>Dako</td><td>X0909</td><td>4.2.5의 차단 솔루션.</td></tr><tr><td>Phospho-Y1798 girdin (pY1798) 항체</td><td>Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X</td><td>28143</td><td>Phospho-Y1798 girdin 항체 단계 4.2.6.</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) 고교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Aquous 마운팅 미디어, Prolong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1</td><td>Matsunami Glass</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>Entellan 새로운 크실렌 기반 마운팅 미디어 현미경 검사</td><td>Merck Millipore</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>MAS 코팅 슬라이드 유리 화이트</td><td>Matsunami Glass</td><td>MI-MAS-01</td><td></td></tr><tr><td>Wooden Mappe KO 형</td><td>Shoei Work '</td><td>s 99-40007</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil 518F 형광 프리 20ml</td><td>Zeiss</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)</td> <td>Gilson</td><td>F144801, F123600, F123601, F123602</td><td></td></tr><tr><td>초순수 생산 시스템</td><td>Advantec</td><td>GS-590</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 장갑, 스타 니트릴 장갑</td><td>스타</td><td>RSU-NGVM</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>급속 냉동고, SANYO 초저</td><td>Sanyo</td><td>MDF-382</td><td></td></tr><tr><td>쇼케이스 냉장고</td><td>Nihon Freezer</td><td>NC-ME50EC</td><td></td></tr><tr><td>수조, Thermominder SDminiN (50 °C에서 젤라틴 용해</td>)<td>Taitec</td><td>0068750-000</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 인큐베이터 (50 °C에서 항원 회수 용)</td><td>Taitec</td><td>HB-100</td><td></td></tr><tr><td>면역 염색 용 인큐베이션 챔버</td><td>Cosmo Bio</td><td>10DO</td><td></td></tr><tr><td>면역 조직 화학을위한 상호 쉐이커 (실온)</td><td>Taitec</td><td>NR-1</td><td></td></tr><tr><td>면역조직화학을 위한 상호 쉐이커(4C용)</td><td>Tokyo Rika Kikai</td><td>MMS-3010</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경(조직 처리용)</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경(그림 1B용)</td><td>Leica Microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경(그림 3용)</td><td>Nikon</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table> 시리즈

장 술 셀 부동성 마우스 공장 cryosections에 시각화에 안티 인 girdin 항 체의 사용

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

말라 바인딩 단백질 girdin 걸 다양 한 조직에 셀 이동 하는 리 모델링에 필요한 cytosolic 단백질 이다. Girdin 수용 체와 티로신 1798에서 비 수용 체 티로신 kinases phosphorylated입니다. 오모리 연구진이 개발 사이트 및 인 산화 상태 특정 항 체 티로신-1798 (pY1798)에서 인간 girdin에 대하여 특히 묶는 phosphorylated 티로신-1798, 하지만 하지 unphosphorylated 티로신-1798. pY1798 항 체 특히 술 셀 (TCs) 포유류 위장 조직에 존재 하는 레이블을 사용 되었습니다 하지만 이러한 세포의 기능을 명확 하지 않다. 이 프로토콜에는 pY1798 항 체와 면역 형광을 사용 하 여 공장에서 TCs의 강력한 시각화 수 있습니다. 성공적이 고 간단한 TC 시각화를 위해이 프로토콜 포함 2 개의 조직학 기술: 젤라틴 가득 공장 조직, 그리고 3 헤와 공장 작성 50 ° C에서 저온 항 원 복구에서 자유 롭 뜨 cryosections의 생산 저온 항 원 복구 TCs이이 프로토콜의 성공적인 사용 pY1798 모 끝에서 배포 하는 TCs의 얼룩에 결과에서 강력한 신호를 보장 하는 반면 젤라틴 얼룩 절차에 걸쳐 무료-부동 섹션의 모양 유지 토 굴입니다. 얼룩진된 TCs 스풀 모양 소마와 형광 신호 튀어나온 '술.'에 해당 하는 lumenal 끝에 응축 Phalloidin 얼룩 두꺼워 솔 국경에 pY1798-긍정적인 TCs와 colocalized 고 TC 술에서 연장 rootlet 질량에 해당 합니다. 위장 내 시경으로 수집 하는 인간의 생 샘플에서 TCs 검사이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 또한, TCs 최근 알려졌다 쥐, 기생충 감염에 따라 축적이 프로토콜 인간의 창 자에서 기생충 감염의 진단에 대 한 응용 프로그램을 할 수 제안.

젤라틴-공장의 작성
젤라틴-충전 (그림 1B)의 혜택은 젤라틴으로 마우스 공장을 작성을 위한 일반적인 절차 (그림 1A), 표시 됩니다. 간단히, 18 게이지 바로 바늘의 경사진된 팁 피어 싱 창 자 벽 (그림 1A1) 로부터 보호 하기 위해 제거 되었습니다. 젤라틴 채우기 사용 하 여 달성 했다 10% 액체 젤라틴 ( 작성 전에 중립 말린 솔루션 잘린된 공장 섹션 소장 하 고 창 자 루멘 표면 (그림 1A2)를 해결 하기 위해의 한쪽 끝에서 주입을 버퍼링 그림 1A3). 결과 소시지 모양의 조각 (그림 1A4) 내장, 냉동, 되었고 transversely는 cryostat에서 30 µ m 두께 조각으로 구분. 작성 하는 젤라틴의 부재, 꼬임, 뒤로 스윙 villi 허용 (그림 1B왼쪽) jejunal 섹션에 의하여 경향이 있다. 젤라틴 작성 섹션의 둥근 디스크 모양을 유지 하 고 (그림 1B오른쪽) villi의 수직 위치를 유지. 이미지는 명확 하 게 작성 부동성 공장 섹션의 형태를 보존 하는 젤라틴에서 제공 하는 혜택을 나타냅니다.
장 술 셀의 성공적인 영상
pY1798 항 체 점 럽, 부 럽, 파라핀 섹션 얼룩, 얼룩, 해 동 실장 cryosection 또는 부동성 cryosection1,9얼룩을 포함 하 여 변수 immunostaining 기술을 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 형광 pY1798 항 체, phalloidin, TCs1의 구조적 특성을 설명 하기 위해 얼룩 DAPI를 사용 하 여 마우스 공장에서 TCs의 얼룩에 대 한 자유 롭 뜨 cryosections에 집중 했다. 일반적으로, TCs는 약 한 TC/100 상피 세포 모 팁에서 토 굴1의 속도로 흩어져 있습니다. 대표 결과 그 pY1798 reproducibly 막, 스풀 모양 소마와 강하게 스테인드 lumenal 팁, 강력한 신호 응축 튀어나온 TC1의 ' 술'에 해당 하는 곳의 세포질을 포함 하 여 전체 TCs를 구분 (그림 2A-2B). 한편, phalloidin phallotoxin, 버섯 버섯 phalloides에서 유독한 bicyclic heptapeptides의 가족 이며 장 브러시 테두리를 이루는 microvilli에 filamentous 말라 (F-말라)에 대 한 높은 선호도가지고 11. Phalloidin reproducibly와 눈에 띄게 표시 rootlets 술1에서 확장의 질량에 해당 하는 굵은 브러시 테두리. 따라서, pY1798 신호 (스풀 모양 소마, lumenal 끝 신호 응축) 눈에 띄게 두꺼워 phalloidin 양성 브러시 테두리의 일관 된 공동 지역화 방법을 보여 줍니다이 프로토콜 성공적으로 관계 없이 TCs 식별 여부 그들은 토 굴그림 2B) (또는 모그림 2A) (에.
낮은-온도 항 원 복구 부동성 섹션 얼룩에 효과적입니다.
95-99 ° C에서 열 기반 항 원 복구 파라핀 섹션 및 슬라이드 마운트 cryosections의 분석을 위해 널리 이용 된다. 그러나 이러한 섹션은 일반적으로 슬라이드12에서 지원 되는 슬라이드 마운트 섹션 보다 더 깨지기 때문에, 손상을 초래 하지 않고 부동성 섹션에 적용이 접근 어려운입니다. 저온 항 원 복구 (50 ° C 3 h)부터 물 목욕을 사용 하 여 미치지 않았다 형태 우리 장 님에서 항 원 복구의 객관적인 효과 평가 하는 예비 실험에서 부동성 공장 섹션의 테스트를 통계적으로 낮은 온도 항 원 복구 (그림 3)의 효과를 확인 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig1.jpg"> 그림 1: cryosections의 형태 보존을 위한 공장 부분의 젤라틴 작성 젤라틴으로 마우스 공장 intraluminal 작성 절차의 (A) 사진. (A1) 18 게이지 바로 바늘의 경사진된 팁을 용기 벽을 관통 하는 피하기 위해 제거 되었습니다. (A2) 버퍼링 된 중성 포 르 말린 용액 (10%)는 잘린된 공장 장의 내용을 플러시하고 창 자 루멘 표면 수정에 한 쪽 끝에 주입 했다. (A3) 잘린된 공장 액체 젤라틴 및 출혈 6-0 나일론 봉합 (검은 화살표)를사용 하 여 양쪽으로 가득 합니다. (A4) 4 더 많은 봉합 사 매듭 (흰색 화살표) 기존 봉합 매듭 (검은 화살표) 사이 3 개의 짧은 조각 나왔고. 조직은 다음 두 개의 지정 된 위치 (흰색 화살표)에서 3 개의 소시지 모양의 조각으로 구분 됩니다. (B) 부동성 cryosection 형태학에 젤라틴 채우기의 유익한 효과 젤라틴 작성 없이 섹션 경향이 꼬임, 쉽게 뒤로 (왼쪽); 스윙 villi 허용 젤라틴 작성, 30 µ m 두께 섹션 디스크 모양 유지와 villi의 수직 위치는 보존 (오른쪽). 이미지는 Nomarski 미분 간섭 명암을 사용 하 여 촬영 했다. 스케일 바, 1 m m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig2.jpg"> 그림 2: 대표적인 형광 이미지 마우스 장 술 셀의 TCs 모 (A) 또는 토 굴에서의 공초점 형광 이미지 (B), 부동성 마우스 공장 섹션에서 사이트별로 얼룩진 고 인 산화 상태 특정 항 체에 대 한 girdin에 티로신 phosphorylated 1798 ( pY1798, 녹색, 최적의 여기/방출 파장 490/525 nm), phalloidin (빨강, 590/617 nm), 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 파랑, 358/461 nm). 낮은 확대 이미지 (스케일 바, 50 µ m)에서 흰색 상자로 둘러싸인 영역 오른쪽 (스케일 바, 10 µ m)에 확장 됩니다. pY1798 항 체 reproducibly 위치 ( (A), 모에 또는 (B)토 굴에서), lumenal 팁 (화살표), 막, 및 스풀 모양 TC 소마의 세포질에 얼룩과 TCs, 얼룩. Phalloidin 얼룩 (화살촉)에서 눈에 띄게 굵은 브러시 테두리는 TCs의 또 다른 독특한 기호 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig3.jpg"> 그림 3: 낮은 온도 항 원 복구 pY1798 면역 형광을 향상 시킵니다. 실험 절차의 두 그룹-저온 항 검색의 효율성을 확인 비교 되었다. 부동성 공장 섹션 (30 µ m 두께, n = 13)에서 단일 고정된 블록 두 그룹으로 분할 되었다 및 각 그룹에서 섹션 전체 프로토콜 다음 얼룩진 했다 또는 같은 프로토콜 부족 저온 항 원 복구 (4.2.2 단계). 얼룩, 후 섹션 그룹 숫자, 표시 하는 개별 슬라이드에 장착 했다 고 마스킹 테이프로 덮여 있었다 각 슬라이드에 라벨. 모든 슬라이드 단행, 테이프에 새로운 숫자 표시 되었고 FITC 필터를 통해 형광 현미경에서 관찰. 표시 pY1798 양성 TCs의 총 수는 각 그룹에 평균 했다 하 고 막대 그래프 (평균 ± 표준 편차)에 표시 했다. 두 꼬리 t-검정은 두 그룹 사이의 평균 수를 비교 위해 수행 되었습니다. P-값이 0.05 이하로 통계적으로 간주 됐다. 저온 항 원 복구는 크게 pY1798-면역 형광의 효율성을 개선. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

구가 외 인 산화 상태는 말라 바인딩 단백질 girdin 티로신 1798 (pY1798)에 phosphorylated에 대 한 특정 항 체 술 셀 (TCs)을 사용할 수 있습니다 발견. 이 프로토콜의 부동성 공장 cryosections pY1798 항 체와 immunofluorescent 얼룩을 사용 하 여 TCs의 강력한 시각화 수 있습니다.

장 술 셀 부동성 마우스 공장 Cryosections에 시각화에 안티 인 girdin 항 체의 사용

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

이 염색 절차의 전반적인 목표는 마우스 jejunum cryosections에서 tuft cell을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 기생충 감염 중 포유류의 장에서 다발 세포의 증식이 어떻게 일어나는지와 같은 위장병학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조직학적 경험이 제한된 연구자들이 고품질의 터프트 세포 이미지를 얻을 수 있다는 것입니다.갓 포르말린으로 고정된 쥐 사체의 골반 장기를 노출하는 것으로 시작합니다. 항문에서 직장 끝을 잘라내고, 장간막을 잘라 장과 몸을 분리한다. 제주눔을 분리하기 위해, 위 전방의 항문 쪽에서 4cm 떨어진 곳을 잘라내고, 남은 소장의 항문 절반을 버린다.세척 절차를 용이하게 하기 위해 제주넘을 반으로 자릅니다. 20ml 주사기에 20%완충된 중성 포르말린 용액 20ml를 넣고 베벨을 제거한 18게이지 직선 바늘을 부착합니다. 그런 다음 잘린 제주넘의 한쪽 끝에서 10% 완충된 중성 포르말린 용액을 주입하여 장 내용물을 씻어내고 장 내강 표면을 고정합니다.PBS를 주사하여 장 내강을 씻습니다. 그런 다음 PBS를 대체하기 위해 액체 젤라틴 용액으로 씻어냅니다. 6-0 나일론 절단 봉합사를 사용하여 봉합 결찰로 잘린 jejunum의 한쪽 끝을 닫습니다.제주넘에 액체 젤라틴을 채우고 봉합사 결찰로 반대쪽 끝을 닫습니다. 다음으로, 제주눔의 길이에 걸쳐 4개의 봉합사 매듭을 묶습니다. 조직을 10% 완충된 중성 포르말린 용액에 15% 자당 50ml에 넣고 섭씨 4도에서 밤새 담그십시오.다음날, 봉합사 매듭에서 제주눔을 잘라 양쪽 끝이 연결된 소시지 같은 제주넴 조각 3개를 얻습니다. 조각을 cryomold에 정렬한 다음 임베딩 컴파운드로 덮습니다. 액체 질소로 냉각된 이소펜탄에서 극저온 몰드를 스냅 동결합니다.제주눔 절편을 준비하려면 먼저 저온 유지 챔버 온도와 물체 온도를 모두 섭씨 영하 22도로 설정합니다. 냉동 조직 블록을 저온 유지 챔버의 극저온 몰드에 최소 15분 동안 놓습니다. 15분 후 면도날로 블록을 반으로 잘라 제주눔의 가로 부분이 드러나도록 합니다.블록의 절반을 저온 유지 장치 어댑터에 장착합니다. 젤라틴으로 채워진 제주넘을 30미크론 두께의 섹션으로 나눕니다. 얼린 집게를 사용하여 35ml의 PBS가 들어 있는 3mm 배양 접시에 절편을 부드럽게 옮깁니다.PBS-T 3ml로 각 5분씩 3회 세척한 후, 자유롭게 떠다니는 섹션이 들어 있는 접시에 갓 준비한 항원 회수 용액 3ml를 추가합니다. 그런 다음 뚜껑을 닫고 비닐 테이프 스트립으로 접시와 뚜껑 사이의 틈을 밀봉하고 섭씨 50도의 혼성화 인큐베이터에서 흔들지 않고 3시간 동안 배양합니다. 면역 염색 후 PBS에서 염색된 부분의 접시를 실체 현미경으로 옮깁니다.200마이크로리터의 PBS를 MAS로 코딩된 흰색 유리 슬라이드 중앙에 있는 물방울에 놓습니다. 그런 다음 P200 피펫 팁을 사용하여 접시의 제주넘 섹션 하나를 액적으로 옮깁니다. 단면 정렬을 조정한 후 단면 주위에 남아 있는 모든 PBS를 흡인합니다.20마이크로리터의 수성 장착 매체를 추가하고 매체 위에 커버 슬립을 놓습니다. 자일렌 기반 장착 매체로 커버 슬립 가장자리를 즉시 밀봉하고 컨포칼 현미경 검사를 시작하기 전에 2-3시간 동안 건조시킵니다. 제주눔의 젤라틴 충전은 둥근 디스크 모양을 보존하고 융모의 직립 위치를 유지합니다.젤라틴 충전이 없으면 제주날 섹션이 꼬이는 경향이 있어 융모가 뒤로 스윙할 수 있습니다. pY1798은 막, 스풀 모양의 소마의 세포질, 강하게 염색된 내강 팁을 포함한 전체 다발 세포를 재현 가능하게 묘사하며, 여기서 강력한 신호 응축은 다발 세포의 돌출된 다발에 해당합니다. Phalloidin은 장내 브러시 경계를 형성하는 미세 융모에 존재하는 사상체 액틴에 대한 친화력이 높습니다.Phalloidin은 다발에서 뻗어 나온 뿌리 덩어리에 해당하는 두꺼워진 덤불 테두리를 재현 가능하고 눈에 띄게 표시합니다. pY1798 신호와 두드러지게 두꺼워진 팔로이딘 양성 브러시 경계의 일관된 공동 국소화는 이 프로토콜이 융모에 있든 crypt에 있든 관계없이 다발 세포를 성공적으로 식별한다는 것을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3일 안에 완료할 수 있습니다.저방출점 젤라틴, 자유 부유 극저온 절편 및 저온 항원 검색의 조합은 다른 프로젝트 조직의 면역 염색에 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Cajal (ICC)의 중간 세포는 위장 (GI) 트랙트의 맥박 조정기 세포입니다. 그들은 평활근 세포와 GI 수축성 조절에 게시할 - ganglionic의 연결 섬유 사이의 복잡한 네트워크를 형성하고 있습니다. 여기, 우리는 immunofluorescence 횡단면 방법과 murine ICC 네트워크 전체 마운트 시각화를 제시한다.

마우스의 Cajal (ICC) 네트워크의 중간 세포의 시각화

Peyer의 패치를 다루는 전문 뿌리 - 관련 상피의 M 세포는 창자 - 관련 림프 조직에서 점막 immunosurveillance을위한 중요한 역할을한다. 여기 우리는 M 세포에 의해 세균 transcytosis에 대한 평가 방법을...

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

이 동영상은 자유 부유 마우스 jejunum 동결절편에서 장 다발 세포를 시각화하기 위한 면역형광 기반 방법을 보여줍니다. 장 융모 내에서, 확장된 붉은 뿌리 덩어리와 함께 내강 끝에서 녹색 형광의 공동 국소화는 다발 세포의 존재를 나타냅니다.

Jejunum cryosections에서 Tuft 세포를 시각화하기 위한 면역형광 기반 방법

이 비디오는 쥐 장의 점막하 및 판막에서 장 신경교세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 점막하 및 얇은 판 propria 조직을 추출하고, 장 신경교세포를 분리하고, 코팅된 웰 플레이트에서 세포를 배양하여 장 신경교세포 배양을 확립하는 단계를 간략하게 설명합니다.

쥐의 점막하부(submucosa and lamina propria)에서 장 신경교세포(enteric glial cells)를 분리(isorating enteric glial cells from the submucosa and lamina propria of a mouse)

이 비디오는 면역형광 및 컨포칼 현미경을 사용하여 신경 세포 집단 분포를 시각화하고 분석하기 위해 배아 쥐 위장관의 면역 염색을 보여줍니다.

Immunofluorescent staining of neuronal populations in the embryonic murine gastrointestinal tract(배아 쥐 위장관에서 신경 세포 집단의 면역형광 염색)

장 상피 줄기 세포 (ISCS)는 Paneth 셀과 혼합된다. 이러한 세포 ISCS을 지원 항균 보호를 제공 ISC의 자손을 차별화한다. 여기에서 우리는 우리가 Paneth 세포가 장 상피 세포를 유지하는데 중요한 역할을한다는 설정하는 형질 전환 조건부 마우스 모델을 사용하는 방법을 보여줍니다.

조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜<em&gt; Cre 호텔-LOX</em&gt; 마우스 모델

선물이 vivo에서 조직에서 장 3 차원 구조의 절연에 대 한 프로토콜 및 지하실 매트릭스 생체 외에서 organoids, 및 세부 다른 정착 immuno-microtubule의 라벨에 대 한 최적화 된 프로토콜을 얼룩이 지 포함 centrosomal, 그리고 접합 단백질도로 표식 줄기 세포 단백질 Lgr5를 포함 하 여 셀.

Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

장은 소화와 흡수에 매우 중요합니다. 십이지장, 제주눔, 회장, 결장 등 각 부위는 독특한 세포 구조로 인해 뚜렷한 기능을 수행합니다. 장 생리학을 연구하려면 세심한 조직 분석이 필요합니다. 이 프로토콜은 스위스 롤 기법을 사용한 조직 고정 및 처리를 간략하게 설명하며, 적절한 조직 보존 및 배향을 통해 정확한 면역염색을 보장합니다.

Intestinal Swiss Rolls 및 파라핀 포매 조직의 면역형광 염색에 최적화된 프로토콜

본 연구는 전체 마운트 장 조직과 다광자 현미경을 사용하여 분비된 점액을 정량화하여 카르바모일콜린 클로라이드와 같은 자극에 대한 점액 역학의 정밀한 체적 분석 및 시각화를 가능하게 하는 3D 이미징 방법을 제시합니다.

전체 마운트 조직 이미징을 사용한 장 점액의 3차원 정량화

배우세요 마우스 공장 절편에서 술 셀을 시각화하는 면역형광 염색법을. pY1798 항체를 사용하여 술 셀 증식을 연구하고 위장관 감염 동안 세포 역학을 분석하는 데 활용할 수 있습니다.

장 술 셀 부동성 마우스 공장 Cryosections에 시각화에 안티 인 girdin 항 체의 사용

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